小鼠酪氨酸酶酶联免疫分析ELISA
ELISA试验方法
ELISA试验方法ELISA试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），也称酶联免疫吸附试验，是一种常用于检测抗原或抗体的敏感且特异性的实验方法。
ELISA试验既可以用于研究基础科学，也可以应用于诊断医学、生物制药、科研开发等领域。
第一步：固相吸附首先，将特异性抗原或抗体加入固相载体，如微孔板或磁珠，通过吸附作用将其固定在载体上，形成固相。
然后，将未被吸附的地方进行阻断，例如使用牛血清蛋白（BSA）或胸腺素等阻断剂来封闭非特异性结合位点，减少非特异性结合。
第二步：样品加入将待检样品加入固相，并充分与特异性抗原或抗体反应。
如果待检物是抗原，则待检样品中存在的特异性抗体会与固相上的抗原结合。
如果待检物是抗体，则待检样品中存在的抗原会与固相上的抗体结合。
第三步：洗涤通过反复洗涤固相，去除非特异性结合的物质，确保只有特异性结合物留在固相上。
典型的洗涤液包括缓冲盐水或洗涤缓冲液。
第四步：二抗加入将经过酶标记的二抗加入固相，使其与特异性结合的抗原或抗体结合。
酶标记的二抗可以与特异性结合物形成二抗-抗原或二抗-抗体复合物。
第五步：洗涤再次进行洗涤步骤，去除非特异性结合的酶标记的二抗，确保只有特异性结合的复合物留在固相上。
第六步：底物加入将含有底物的反应物加入固相，使其与酶标记的二抗发生反应。
底物与酶标记的二抗之间的反应产生颜色变化，即可定性或定量检测待检物质的存在和浓度。
第七步：反应停止通过加入反应停止剂，停止酶反应，阻止进一步的底物转化为产物。
产物的生成量与待检物质的浓度成正比。
最后，通过光度计或酶标仪等检测设备，测量产生的颜色变化的光密度，可以定性或定量计算待检物质的存在和浓度。
ELISA试验具有高度的敏感性和特异性，能够检测低浓度的抗原或抗体。
它的操作简单、重复性好，广泛应用于生物医学研究、临床检测、植物检测、食品检测等领域。
不过需要注意的是，ELISA试验的结果受到很多因素的影响，如抗体的质量和纯度、试剂的质量和保存条件等，因此在进行ELISA试验时需要严格控制实验条件，保证结果的准确性和可重复性。
小鼠活性氧ROS酶联免疫分析ELISA
小鼠活性氧(ROS)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中活性氧(ROS)的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠活性氧(ROS)水平。
用纯化的小鼠活性氧(ROS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入活性氧(ROS)，再与HRP标记的活性氧(ROS)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的活性氧(ROS)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠活性氧(ROS)含量。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
酶联免疫分析技术
室 温 温 育 的 反 应 ， 操 作 时 的 室温 应 严格 限 制 在 规 定 的 范围 内 ， 标准 室 温温 度 是指 20-25℃ ， 应注 意 温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点， 一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对 硝基苯磷酸酯 作 为底物。产物为黄色的对硝基酚，在 405nm 波长处 有吸收峰。用 NaOH 终止酶反应后，黄色可稳定一时 间。 AP也有发荧光底物（磷酸 4- 甲基伞酮），可用 于 ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的 比色法。
洗涤液
常用的稀释液为含 0.05% 吐温 20磷酸盐缓冲液。
异相法：
?Ab* A* *g*和Ab 分离，然后测定 Ab Ag 或Ab 的量， 从而推算出 Ag量。
*
A
过量 Ab
g
*
Ab *
Ab A g
均相法 ：
?Ab *Ag中的标记物 *失去特性，直接测定游离 Ab *的量，从而推算出 Ag量。
*
A
过量 Ab
g
* Ab *
Ab A g
1 特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结 合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高 度的特异性。
2013-8-13
免疫检验
? 利用免疫检测原理检测与免疫相关的 物质（抗原、抗体、补体、细胞因子 等）
? 利用免疫检测原理检测体液中的微量 物质（激素、酶、血浆中的微量蛋白、 药物浓度等） 这些检测结果为临床上确定诊断， 分析病情，调整治疗方案和判断预后 提供有效的实验依据 。
酶联免疫分析技术
使用酶联免疫分析检测基本信息、测定用途、结果解释注意事项等要点总结
使用酶联免疫分析检测基本信息、测定用途、结果解释注意事项等要点总结使用酶联免疫分析检测蛋白质是诊断工具之一，测试用于监控和疾病监测以及诊断工具。
检测基本信息ELISA检测旨在检测针对细菌或病毒的抗原或抗体。
抗原是刺激抗体产生的外来蛋白质。
ELISA直接靶向细菌或病毒的蛋白质称为抗原ELISA，目标动物对细菌或病毒抗体反应称为抗体ELISA。
通过ELISA检测抗体或抗原的概念和过程完全相同，它从获得目标蛋白开始。
对单个蛋白质，需要单独方法来获得该单个蛋白质纯化浓度，确定目标蛋白是科学而复杂过程。
步骤1：用目标抗原或抗体预涂微孔板。
步骤2：添加样品测试并孵育，以使抗原和抗体之间发生附着。
步骤3：移除样品，并添加附着在抗体相对侧的特定抗体。
然后孵育样品以确保附着，并洗涤以确保去除任何非附着抗体或抗原。
步骤4：添加用能发出荧光的检测器标记的抗体，并将其附着在步骤3中添加的特殊抗体上。
然后再次孵育样品以确保附着，并洗涤以确保去除任何未附着的标记抗体。
步骤5：添加将触发残留的标记抗体荧光的试剂，然后进行孵育以确保附着。
步骤6：读取样品，通常使用特定波长的专用机器来量化颜色变化。
这一过程在检测方法是直接、间接还是夹心ELISA方面有一些细微的差异，每种检测方法都有不同的优点和缺点，但最终结果相同；吸光度或颜色变化越高，测试样品中目标抗原或抗体预期浓度越高。
直接ELISA：1. 将样品加入微孔2. 蛋白质附着于塑料上3. 偶联检测抗体与固ELISA定化分析物结合4. 酶促显色反应与结合抗体成正比夹心ELISA：1. 用捕获抗体预涂微孔2. 添加样品，分析物与捕获抗体结合3. 偶联检测抗体与固定化分析物结合4. 间接检测，酶促反应与分析物成正比竞争ELISA：1. 用第二捕获抗体预涂微孔2. 同时加入捕获抗体、偶联物和样品3. 偶联物和样品结合4. 酶促显色反应与结合偶联物成正比在竞争ELISA的情况下，关键是所使用的过程实际上会产生相反的结果。
酶联免疫斑点试验的原理
酶联免疫斑点试验的原理1. 引言酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay，简称ELISPOT）是一种用于检测细胞分泌物的敏感且高通量的免疫学技术。
该技术可以定量检测单个细胞分泌的蛋白质或细胞因子，在免疫学研究、药物开发和临床诊断中具有广泛的应用。
2. 原理概述ELISPOT技术基于酶标记抗体和特异性抗原结合的原理。
它通过将待测细胞与特定抗原刺激后，将细胞分泌物捕获到固相载体上，然后使用酶标记二抗进行检测，最后通过显色反应可视化并计数斑点数量。
该技术具有高灵敏度、高特异性和高通量等优势。
3. 实验步骤步骤一：制备固相载体在ELISPOT实验中，常用的固相载体是多孔膜板或膜片。
首先，在载体表面涂覆特异性抗原或抗体，以便捕获待测细胞分泌的特定蛋白质或细胞因子。
步骤二：孵育待测细胞将待测细胞加入到含有特异性抗原的培养基中，使其与抗原发生特异性反应。
通常，实验者会设置对照组，包括阴性对照组（只有培养基）和阳性对照组（含有已知分泌物的细胞）。
步骤三：洗涤将孵育后的细胞用洗涤缓冲液洗去未结合的细胞和其他杂质。
步骤四：二抗处理加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗IgG），使其与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合。
步骤五：显色反应加入适当的底物和显色剂，通过酶催化作用产生可见信号。
常用的显色剂是BCIP/NBT，在酶催化下会生成紫色斑点。
步骤六：计数和分析使用显微镜对固相载体进行观察，并使用计算机软件或手工计数斑点数量。
斑点的数量代表了待测细胞分泌物的水平。
4. 原理解析特异性抗原和抗体结合固相载体表面涂覆的特异性抗原或抗体与待测细胞分泌物中的特定蛋白质或细胞因子结合。
这种结合是通过免疫反应中抗原与抗体之间的特异性识别实现的。
酶标记二抗检测酶标记二抗是一种能够与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合并具有酶活性的二级抗体。
常用的酶标记二抗有辣根过氧化物酶标记的抗IgG。
酶联免疫吸附测定法基本步骤
酶联免疫吸附测定法基本步骤酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物化学分析技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在和浓度。
其基本步骤包括固相化免疫反应、酶标记物检测、底物显色和测定结果的分析。
一、固相化免疫反应固相化免疫反应是ELISA的第一步，通常使用微孔板作为固相载体。
首先，在微孔板的孔中添加特定抗原或抗体，使其与孔壁结合形成固相。
然后，将孔中的非特异性结合位点封闭，以防止后续步骤中的非特异性结合。
此步骤旨在固定待测物质，使其能够与特异性抗体发生免疫反应。
二、酶标记物检测酶标记物检测是ELISA的关键步骤之一。
在这一步骤中，将与待测物质特异性结合的酶标记物加入孔中，并与待测物质发生免疫反应。
酶标记物可以是酶抗体复合物，也可以是酶标记的抗原。
典型的酶标记物有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）。
该步骤的目的是通过酶标记物的存在来检测待测物质的存在和浓度。
三、底物显色底物显色是ELISA的关键步骤之一，用于检测酶标记物的存在。
在这一步骤中，将适当的底物加入孔中，与酶标记物发生化学反应。
底物的选择取决于酶标记物的类型，常见的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）和pNPP（对硝基苯磷酸盐）。
化学反应的产物可呈现颜色变化，例如TMB底物在酶的作用下会变成蓝色。
颜色的强度与酶标记物的浓度成正比，从而可以间接反映待测物质的存在和浓度。
四、测定结果的分析测定结果的分析是ELISA的最后一步，通过测量底物显色反应的光密度来定量分析待测物质的浓度。
通常使用酶标仪或分光光度计来测量吸光度，并将所得数据进行处理和分析。
根据标准曲线，可以将吸光度值转化为待测物质的浓度值。
ELISA的结果可以是定性的（阳性或阴性），也可以是定量的（浓度值）。
ELISA试验基本步骤及材料和试剂
ELISA试验基本步骤及材料和试剂ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用于检测蛋白质或抗体的定性和定量方法。
它的基本原理是利用酶-抗体偶联物来检测特定目标物质的存在，通过酶催化底物的变化来实现信号的放大和检测。
下面将介绍ELISA试验的基本步骤以及相关的材料和试剂。
1.涂板：首先，将微孔板（96孔板或其他规格的板）用目标蛋白质或抗体溶液涂覆在表面上，使其吸附固定。
这一步通常称为“涂板”。
2.阻断：将蛋白质或抗体涂覆后的微孔板用阻断剂（例如牛血清蛋白、BSA）进行阻断处理，以防止非特异性结合。
3.样品处理：将待检测的样品加入到微孔板中，并与目标蛋白质或抗体结合（如果存在）。
样品通常需要经过一系列稀释步骤，以便在量化检测时得出准确的结果。
4.洗涤：使用缓冲液反复洗涤微孔板，以去除未结合的物质。
5.二抗处理：加入与待检测物种类对应的二抗荧光素，使其与待检测物结合。
这一步通常称为“二级标记”。
6.洗涤：再次使用缓冲液反复洗涤微孔板，以去除未结合的二抗。
7.底物结合：加入底物（如TMB或ABTS）并等待一定的反应时间，使酶催化底物的变化产生可观察的颜色变化。
8.反应停止：加入停止液（如硫酸、盐酸）停止底物的反应。
9.测量：利用酶催化反应产生的颜色变化通过酶标仪或光谱仪进行测量，得出待测量物的浓度或定性。
1.微孔板：一般使用96孔的微孔板，也可根据需要选择其他规格的板。
2.涂板物质：目标蛋白质或抗体等。
3.阻断剂：常用的阻断剂有牛血清蛋白（BSA）等。
4.样品：待检测的生物样品，可以是血清、细胞提取物或其他组织液。
5.二抗：与待检测物种类对应的二抗，通常是抗体。
6.底物：用于酶催化反应并产生颜色变化的化学底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二胺）、ABTS等。
7.停止液：停止底物的反应，如硫酸、盐酸等。
8. 缓冲液：用于洗涤和稀释的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（含Tween-20的洗涤缓冲液）等。
【国家自然科学基金】_酶联免疫吸附测定(elisa)_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140730
血栓前状态 血凝素类 葡萄球菌,表皮 苹果砧木 自身抗原 自身抗体 脑损伤 胶质源性神经营养因子 胶原ⅰ型 胰岛素 胞外信号调节激酶 胚胎发育 胃肿瘤 肿瘤转移 肿瘤复发,局部 肽库 肽基二肽酶a 肺损伤 肝肿瘤 肝细胞癌 肝炎抗体 肝炎 肝星状细胞 聚类分析 聚合酶链反应 网箱 结合亲和力 细胞 组织型纤溶酶原激活剂和抑制剂 组氨酸trna连接酶 纤溶酶原激活抑制物 糖尿病,2型 精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸 移植物抗宿主病 禽副黏液病毒属 神经氨酸酶 神经根病 神经干细胞 碳酸酐酶ⅲ抗体 碳酸酐酶ⅲ 硫化氢 矮化性评价指标 直接竞争 益气化瘀补肾法 皮质酮 皮肌炎 白藜芦醇 白色念珠茵 白细胞介素 白介素-2 白介素-1 生长激素 生物膜 甘露聚糖类
血管内皮生长因子a 血管内皮生长因子 血清 蛋白激酶c 萘 茶黄素双没食子酸酯 苯并(a)芘 色素上皮 自身抗原 腺病毒载体 腺病毒 腺样囊性癌 脑红蛋白 脑损伤 脉冲电磁场 脂多糖类 胚胎着床 肿瘤死亡因子-α 肿瘤坏死因子α 肽类 肺肿瘤 肺纤维化 肥大细胞 肝细胞 肝移植 肝功能损害 缺失plc-γ 1基因小鼠成纤维细胞 绿磺隆 维甲酸 结肠肿瘤 结核 细胞色素c 细胞因子类 细胞因子 细胞凋亡 纳米金组合电极 紫杉醇 糖皮质激素 糖尿病 离子通道转运调节因子 神经营养素-3 神经网络(计算机) 磷脂酶c-γ 1 硝基化酪氨酸 眼/生理学 直接竞争酶联免疫吸附分析 盐酸克伦特罗 皮质酮 白血病 白藜芦醇 白细胞介素4 白细胞介素1β /投药和剂量 白细胞介素13 白细胞介素12
生物sharp mouse IgE ELISA试剂盒使用说明书
一、产品简介 ������������������� ���������二、检测原理 ������������������� ���������三、试剂盒组分 ������������������� ���������四、储存条件 ������������������ ����������五、注意事项 ������������������ ����������六、其它实验材料 ������������������� ��������七、使用说明 �������������������� �������1、样品收集、处理及保存方法 �������������������� ��2、试剂准备 �������������������� �������3、操作步骤 �������������������� �������4、操作流程图 �������������������� �������5、操作要点提示 �������������������� �������6、结果判断 �������������������� �������八、常见问题分析及解决 ���������� ������������� 2 2 3 3 3 4 4 4 4 5 6 6 6 8目 录全国统一热线：400-600-4213 ELISA试剂盒使用说明书本试剂盒用于定量检测小鼠血清、血浆或细胞培养上清液等样本中天然和重组IgE浓度。
使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分，如有任何疑问请与合肥兰杰柯科技有限公司联系，公司将为您提供强有力的技术支持。
仅供研究，不用于临床诊断。
二、检测原理本实验采用双抗体夹心ELISA。
用抗小鼠IgE单克隆抗体预包被酶标板，加入适度稀释的样本和标准品，其中的IgE会与其单抗结合，洗去游离成分；加入生物素化的抗小鼠IgE抗体，抗小鼠IgE抗体与结合在单抗上的小鼠IgE结合而形成免疫复合物，洗去游离的成分；加入辣根过氧化物酶标记的亲合素，生物素与亲合素特异性结合，洗去未结合的酶结合物；加入显色剂，若反应孔中有IgE，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色；加终止液变黄。
小鼠乳酸脱氢酶(LDH)酶联免疫分析(ELISA)
小鼠乳酸脱氢酶（LDH）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
药品名称：通用名：小鼠乳酸脱氢酶（LDH）酶联免疫分析试剂盒使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中乳酸脱氢酶（LDH）含量。
实验原理本试剂盒应用间接法测定标本中小鼠乳酸脱氢酶（LDH）水平。
用纯化的小鼠乳酸脱氢酶（LDH）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入已知浓度的乳酸脱氢酶（LDH）标准品和未知浓度的LDH待检样品，温育后，加入生物素标记的抗IgG 抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的乳酸脱氢酶（LDH）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠乳酸脱氢酶（LDH）浓度。
试剂盒组成标本要求1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融操作步骤1.根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。
每个标准品和空白孔建议做复孔。
每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品，其余各步操作相同）、标准品孔、待测样品孔。
然后在标准品孔中加入标准品50μl，在样本反应孔中先加入待测样品10μl再加入样品稀释液40μl（样品最终稀释度为5倍），盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。
3.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用4.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干。
5.加生物素标记的抗-IgG抗体：每孔加入生物素标记的抗-IgG抗体50μl。
ELISA方法及基本原理
ELISA方法及基本原理ELISA （enzyme-linked immunosorbent assay）即酶联免疫吸附测定法，是一种常用的免疫分析技术。
ELISA方法通过将特定抗原或抗体固定在试验板上，并利用酶标记二抗或酶标记抗原来检测目标分子的存在和浓度水平。
下面将详细介绍ELISA方法的原理和步骤。
间接ELISA方法是最常用的ELISA形式之一、它首先在试验板上固定抗原或抗体，然后经过样品孵育，样品中的目标分子与固定的抗原或抗体反应。
接着，加入一种与目标分子反应的酶标记二抗，引物二抗与样品中的目标分子结合。
最后，加入底物，底物经过酶的催化作用而产生可观测的颜色变化。
颜色的强度与目标分子的浓度呈正相关关系。
竞争ELISA方法是通过固定一个抗原或抗体于试验板上，然后将非标记的目标物质或样品加入到试验板孔中，与固定的抗原或抗体竞争结合。
接着，加入酶标记的抗体或抗原，使其与未结合的目标物质竞争结合。
孵育完成后，固定标记物分子的孔洞的底物测定，底物变色程度与未结合的标记物分子的多少呈反比关系。
夹心ELISA方法是通过在试验板上固定抗体，接着孵育样品，在第一次孵育结束后洗涤，然后孵育酶标记的第二抗体。
孵育完成后洗涤，然后加入底物，进行检测。
夹心ELISA方法可以同时检测两个抗原结合位点，因此能够提高检测的敏感性。
直接ELISA方法是最简单和最迅速的ELISA形式之一、直接ELISA方法是通过将特异抗体直接固定在试验板上，加入样品孵育，接着加入酶标记的第二抗体，再加入底物，进行检测。
直接ELISA方法省去了两次抗体反应的步骤，因此可以节省时间，并且具有较高的灵敏度。
除了上述的几种常见形式外，ELISA方法还可以根据特定需求，进行一些改进和变化。
例如，可以引入荧光物质作为标记物，以进行荧光ELISA；也可以使用化学发光物质作为标记物，进行化学发光ELISA。
这些改进可以进一步提高ELISA方法的灵敏度和特异性。
elisa方法
elisa方法Elisa方法是一种广泛应用于生物医学研究领域的实验技术，它的全称是Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，即酶联免疫吸附实验。
Elisa方法通过特定的抗体-抗原相互作用来检测样本中特定分子的存在，因此在临床诊断、生物学研究和药物开发等领域都有重要应用价值。
本文将从Elisa方法的原理、步骤和应用领域等方面进行介绍。
首先，Elisa方法的原理是基于酶标记的免疫反应。
在Elisa实验中，将待检测的抗原或抗体与固相载体结合，形成固相抗原或抗体。
然后，加入特异性的酶标记二抗或酶标记抗原，使其与待检测的抗原或抗体结合形成酶标记的免疫复合物。
最后，通过酶底物的作用来检测酶的活性，从而间接检测待检测物质的存在。
Elisa方法的步骤一般包括固相吸附、非特异性结合位点的封闭、特异性抗原或抗体的结合、酶标记的二抗或抗原的结合、底物的作用和测定。
其中，固相吸附是将待检测的抗原或抗体吸附在固相载体上，而非特异性结合位点的封闭则是为了防止非特异性结合的干扰。
特异性抗原或抗体的结合是Elisa方法的核心步骤，它决定了实验的灵敏度和特异性。
酶标记的二抗或抗原的结合是为了增强检测的信号，底物的作用和测定则是通过测定酶的活性来间接检测待检测物质的存在。
Elisa方法在临床诊断、生物学研究和药物开发等领域有着广泛的应用。
在临床诊断中，Elisa方法可以用于检测各种疾病标志物，如肿瘤标志物、传染病病原体抗体等，具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点。
在生物学研究中，Elisa方法可以用于检测细胞因子、蛋白质相互作用、药物浓度等，为科研人员提供了重要的实验手段。
在药物开发中，Elisa方法可以用于筛选药物靶点、评价药物的药效和毒性，为药物研发提供了重要的技术支持。
总之，Elisa方法作为一种重要的实验技术，在生物医学研究领域有着广泛的应用前景。
通过本文的介绍，相信读者对Elisa方法有了更深入的了解，希望能够为相关领域的研究和实践提供帮助。
酶联免疫法ELISA的原理
酶联免疫法ELISA的原理
酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是一种常用的生物分析技术，可以检测样品中特定分子的存在和数量。
ELISA主要依赖于抗原与抗体之间的特异性结合，以及酶反应的催化作用来检测目标分子。
ELISA基本原理：
1.涂层：将含有特定抗原的溶液涂在微孔板上，并使其吸附在孔壁上形成固相。
2.阻断：为了避免非特异性吸附，需要加入一种阻断剂，如牛血清白蛋白（BSA）等，在孔内形成一个保护层。
3.加样：加入待测样品，目标分子与固相中的抗原结合。
4.洗涤：洗去未结合分子和杂质。
5.检测：加入与目标分子结合的二抗或直接标记的一抗，并进行适当反应时间。
6.洗涤：洗去未结合物质。
7.显色：加入染色底物，使酶催化反应产生可见信号。
8.终止反应：加入终止剂停止酶催化反应，并读取吸光度。
ELISA的优点：
1. 灵敏度高：ELISA可以检测非常低浓度的目标分子，一般可以达到纳克级别。
2. 特异性强：由于抗原与抗体之间的特异性结合，ELISA可以区分不同种类的分子。
3. 可定量化：通过比较样品与标准曲线的吸光度值，可以计算出样品中目标分子的浓度。
4. 操作简单：ELISA操作相对简单，且大多数试剂盒都提供了详细的操作说明。
5. 适用范围广：ELISA可用于检测血清、尿液、唾液等多种生物样品中的目标物质。
总之，酶联免疫法是一种基于特异性抗原-抗体反应和酶催化作用的生物学检测技术。
它具有灵敏度高、特异性强、可定量化、操作简单和适用范围广等优点，在医学、生物学、环境科学等领域得到了广泛应用。
化妆品中的美白效果评价方法研究
化妆品中的美白效果评价方法研究近年来，随着人们对美白肌肤的需求不断增长，化妆品市场上涌现出众多美白产品。
然而，如何准确评价化妆品的美白效果成为了广大消费者关注的焦点。
本文将从不同角度研究化妆品中的美白效果评价方法，为消费者提供参考，以便选择适合自己的产品。
以下是几个重要的评价指标：一、肤色改善度评价法肤色改善度是评价美白产品效果的重要指标之一。
目前，常见的评价方法包括使用色度仪测量皮肤颜色变化、使用专业的肤色分析仪、化妆品临床试验和消费者自评等。
1. 色度仪测量皮肤颜色变化：色度仪是一种用于测量色彩的仪器，通过比较使用美白产品前后的肤色变化，可以评估产品的美白效果。
通常在不同时间点测量肌肤的颜色，并进行数据分析，以便获取肤色改善的度量值。
2. 肤色分析仪：肤色分析仪是专业化妆工具，通过拍摄和分析肌肤照片，可以评估肤色的均匀度、亮度和红润度等参数。
通过分析这些参数的变化，可以得出美白产品的效果。
3. 化妆品临床试验：化妆品临床试验是用一定数量的参与者进行的实验，通过评估其肌肤颜色的变化，以确定美白产品的效果。
这种方法能够更真实地反映出产品对肌肤的影响。
4. 消费者自评：消费者自评是在使用美白产品一段时间后，让用户根据自身感受评估产品的效果。
这种方法有助于了解产品在日常使用中的实际效果。
二、黑色素含量评价法黑色素是肌肤暗沉、肤色不均匀的主要原因之一。
因此，评价化妆品的美白效果时，测量黑色素含量是一种常见的方法。
以下是几种常用的黑色素含量评价方法：1. 高效液相色谱法（HPLC）：HPLC是一种用于分离、定量和分析化合物的方法。
通过采集肌肤样本，提取其中的黑色素，并利用HPLC 技术分析黑色素的含量，以评估化妆品的美白效果。
2. 酪氨酸酶酶联免疫吸附测定法（TyrELISA）：TyrELISA是一种测定黑色素含量的方法。
它通过酪氨酸酶特异性地结合黑色素，利用酶标仪测定黑色素含量，从而评估美白产品的效果。
酶联免疫试验原理
酶联免疫试验原理酶联免疫试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的实验室技术，用于检测和测量蛋白质、抗体、肽或小分子化合物。
它是一种特异性高、敏感度好的定量或定性检测方法，具有应用广泛、结果准确可靠的优势。
酶联免疫试验的原理基于抗原与特异性抗体的特异性结合作用。
通常，免疫试验中常用的抗原是被测物，抗体则是与抗原特异结合的免疫球蛋白。
ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等不同类型，其原理略有差异。
一般而言，ELISA的关键步骤包括以下几部分：1.固相吸附：将抗原或抗体固定在实验室常用的微孔板上，如96孔板，通过物理吸附或化学偶联的方法，使其与微孔板上的表面结合。
2.试样处理：待测物质需要进行预处理，如适当的稀释、纯化或者反应梯度等。
这一步骤通常是为了提高试验的灵敏度和准确性。
3.特异性结合：将预处理好的试样加入孔中，与固相吸附的抗原结合，同时加入特异性结合的抗体，形成抗原-抗体复合物。
这个抗原-抗体复合物具有高度的特异性，可以仅与特定的抗原结合，并与其他非特异性物质的结合有所区别。
4.清洗：为了去除非特异性结合的物质，需要进行反应后的洗涤步骤。
一般采用盐溶液、缓冲液或洗涤缓冲液进行洗涤，以去除没有结合的物质，保留住特异性抗原-抗体复合物。
5.信号产生：加入检测物质，以产生与特异性抗原-抗体复合物结合的信号。
一般常用的方法是将辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）结合在第二抗体上，使其与特异性抗原-抗体复合物结合。
这样，酶作用于底物时将可产生荧光、发光或颜色的变化。
6.信号测量：通过测量底物转化产物的光学性质，如吸光度或荧光强度，可以得到与原始抗原或抗体浓度相关的信号。
根据吸光度或荧光强度，可以使用分光光度计或光学显微镜等仪器设备进行检测。
总结来说，酶联免疫试验的原理是通过抗原与特异性抗体结合，形成特异性抗原-抗体复合物，通过特定的酶作用，产生可测量的信号，从而检测和测量所需的物质或分子。
elisa检测方法
elisa检测方法Elisa检测方法。
ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学检测方法，广泛应用于医学、生物学、环境监测等领域。
它通过特定抗体和酶标记的二抗相互作用，实现对特定抗原的高灵敏度、高特异性检测。
下面将介绍ELISA检测方法的基本原理、步骤和注意事项。
1. 基本原理。
ELISA检测方法基于抗原与抗体的特异性结合，利用酶标记的二抗或底物显色反应来定量或半定量检测抗原或抗体。
其原理主要包括固相吸附、特异性结合、酶标记、底物显色等步骤。
在固相吸附阶段，待检样品中的抗原或抗体被吸附在微孔板表面；在特异性结合阶段，加入特异性抗体与待检样品中的抗原结合；在酶标记阶段，加入酶标记的二抗与特异性抗体结合形成免疫复合物；最后，在底物显色阶段，加入底物使酶催化反应产生显色产物，通过光密度测定来定量或半定量检测待测物。
2. 步骤。
ELISA检测方法的步骤主要包括样品处理、固相吸附、特异性结合、酶标记和底物显色等。
首先，将待检样品进行处理，如离心、稀释等；然后将处理后的样品加入到微孔板中，进行固相吸附；接着加入特异性抗体与待检样品中的抗原结合；随后加入酶标记的二抗与特异性抗体结合形成免疫复合物；最后加入底物使酶催化反应产生显色产物，通过光密度测定来定量或半定量检测待测物。
3. 注意事项。
在进行ELISA检测时，需要注意以下几点，首先，严格按照操作规程进行操作，避免交叉污染；其次，样品处理的过程中需要注意避免蛋白质的降解和失活；另外，在固相吸附、特异性结合、酶标记和底物显色等步骤中，需要控制好反应时间和温度，以保证实验的准确性和可重复性；最后，需要注意底物显色反应的终止时间，避免过度显色导致结果失真。
总之，ELISA检测方法是一种简单、快速、灵敏、特异性高的免疫学检测方法，广泛应用于医学、生物学、环境监测等领域。
掌握其基本原理、步骤和注意事项，对于准确、可靠地进行ELISA检测具有重要意义。
elisa酶联免疫原理
elisa酶联免疫原理ELISA是一种高效、灵敏和特异性酶联免疫测定技术，用于检测生物样品中的抗原或抗体。
接下来，本文将详细讲解ELISA酶联免疫原理，并介绍其应用和优势。
一、酶联免疫原理ELISA酶联免疫的原理是通过抗原与特异性抗体的免疫反应，实现生物样品中化学物质的检测。
整个ELISA酶联免疫过程包括以下步骤：样品制备：首先，需要将待检测的生物样品进行制备处理，目的是提取生物样品中的抗原或抗体。
涂层：在免疫板的孔中加入特异性抗体，然后将免疫板放入孔中，允许特异性抗体与免疫板结合。
这样，免疫板就成为了涂层。
检测物添加：将待检生物样品加入免疫板孔内，使免疫原与特异性抗体结合。
缓冲液清洗：使用缓冲液清洗免疫板孔，以去除生物样品中未与特异性抗体结合的免疫原。
检测抗体添加：将酶偶联的特异性抗体加入免疫板孔，允许特异性抗体与已结合的生物样品中的免疫原结合。
底物添加：通过底物的添加，允许酶催化产生颜色或荧光等信号，使我们能够判断免疫原的存在或数目。
二、ELISA的应用由于ELISA酶联免疫技术对于抗原抗体的检测十分敏感和特异，因此应用广泛。
以下是一些常见的ELISA应用领域：1. 临床使用：ELISA酶联免疫技术在临床实验室中广泛应用，用于检测各种疾病和疫苗的抗体反应。
例如，ELISA酶联免疫技术可以用于艾滋病、乙肝、流感等病毒性疾病的抗体检测。
2. 生物学研究：ELISA酶联免疫技术不仅用于检测天然免疫反应，还可用于检测特异性免疫应答，如细胞因子、趋化因子等蛋白的检测。
3. 农业生产：用于畜牧业上的ELISA检测技术，如检测动物血清中病原体抗体的含量，以确定所检测动物感染疫病的情况。
4. 食品工业：ELISA酶联免疫技术还可以用于检测食品中潜在的过敏原和食物中的化学残留物。
三、ELISA的优势1. 灵敏度高：ELISA检测技术对于检测非常少量的特异性抗体具有高度灵敏度。
基于这一特性，ELISA常常用于疫苗接种后，检测患者抗体反应是否良好。
酶免疫测定法原理
酶免疫测定法原理酶免疫测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的生物化学分析技术，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
其原理基于抗原与抗体的特异性结合反应，利用酶的催化作用实现检测与定量分析。
ELISA可以用于检测体液中的蛋白质、病原体、抗体等多种生物分子。
其基本原理是将待检样品中的目标分子与特异性抗体结合，再通过酶标记的二抗或底物与结合复合物发生反应，最后通过酶的催化作用产生显色或荧光信号来定量检测目标物质的含量。
ELISA的基本步骤包括：1. 固相吸附：将特异性抗体固定在微孔板上，形成抗原固定相。
2. 样品加入：待检样品中的目标分子与抗原固定相结合。
3. 清洗：通过洗涤步骤去除非特异性结合物质。
4. 酶标记的二抗或底物加入：酶标记的二抗与结合复合物发生特异性结合，或底物与酶发生催化反应。
5. 清洗：去除未结合的二抗或底物。
6. 显色：加入显色底物使酶催化产生可见的色信号。
7. 反应停止：加入反应停止液终止酶催化反应。
8. 读取结果：使用酶标仪或光度计测量样品中的信号强度，与标准曲线比对得出待测样品中目标物质的浓度。
ELISA技术的优点在于其高灵敏度、高特异性、简单易行、可定量测定等特点。
它可以应用于疾病的早期诊断、药物疗效监测、免疫学研究等方面。
同时，ELISA还可以通过改变实验条件或使用不同的检测标记，实现不同类型的检测，例如酶免疫吸附试验、酶免疫细胞分析等。
然而，ELISA也存在一些局限性。
由于ELISA依赖于抗原与抗体的特异性结合反应，因此需要具备高质量和特异性的抗体。
此外，ELISA的结果受到多种因素的影响，包括温度、洗涤步骤的严格控制、反应时间的控制等。
因此，在进行ELISA实验时，需要严格控制实验条件，保证结果的准确性和可靠性。
酶免疫测定法原理基于抗原与抗体的特异性结合反应和酶的催化作用，通过检测酶催化产物的信号来定量分析待测物质的含量。
酶联反应的基本原理和应用
酶联反应的基本原理和应用基本原理酶联反应（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是一种广泛应用于生物学、医学和环境科学等领域的实验技术。
其基本原理可以概括为以下几个步骤：1.血清样品准备：首先，需要从被测样品中提取并纯化所需的分析物。
一般以血清为例，可以通过离心、稀释等方法得到要分析的样品。
2.固定抗原：在一个固定的表面上，将要检测的抗原定向地固定下来。
这个表面可以是试管、96孔板等。
常用的固定方法有吸附、共价结合等。
3.样品处理：将准备好的样品加入到固定抗原的表面上，使得样品中的抗体与抗原发生特异性反应。
这个步骤可以用来检测血清中是否存在特定的分析物。
4.添加标记抗体：将已标记的抗体加入到样品中，使得抗体和抗原形成特异性的结合。
标记抗体一般会选择与被测抗原不同来源的抗体，以便于检测。
5.检测信号：通过添加一定的底物，使得标记抗体产生可视的信号。
常见的底物有酶类、荧光染料等。
这个信号可以通过光学或电化学等方式进行测定。
应用酶联反应在生物科学中有着广泛的应用，其中包括以下几个方面：1.医学诊断：酶联反应是一种常见的临床检验方法，可以用于检测血液中的特定抗体、抗原以及其他生物分子。
比如，ELISA可以用于检测病毒感染、免疫相关疾病等。
此外，ELISA还可以用于检测肿瘤标记物、药物残留等。
2.免疫学研究：酶联反应是免疫学研究中的重要工具，可以用于检测和定量特定蛋白质、抗体以及其他分子的存在和表达水平。
通过ELISA，可以对免疫应答、免疫学相关疾病等进行深入的研究。
3.食品安全监测：ELISA可以用于检测食品中的各种污染物，如重金属、农药残留、有害微生物等。
这对于保障食品安全具有重要意义。
4.环境监测：酶联反应在环境科学中也有广泛的应用。
比如，ELISA可以用于检测水体、土壤和空气中的有害物质，如重金属、有机污染物等。
这对于环境污染的监测和评估具有重要意义。
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小鼠酪氨酸酶酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，细胞上清及相关液体样本中酪氨酸酶的活性。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠酪氨酸酶水平。
用纯化的小鼠酪氨酸酶抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入酪氨酸酶，再与HRP标记的酪氨酸酶抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的酪氨酸酶呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠酪氨酸酶浓度。
试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为12U/L，8U/L ，4U/L，2U/L，1U/L）。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。
在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。
2.批内与批间应分别小于9%和15%检测范围：0.3U/L -15U/L保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月FOR RESEARCH USE ONLYDrug NamesGeneric Name：Mouse TYR ELISA Kit.PurposeThis kit allows for the determination of TYR concentrations in Mouse serum, cell culture supernatant, and other biological fluids.Principle of the assayT he kit assay Mouse TYR level in the sample，use Purified Mouse TYR antibody to coat microtiter plate wells, make solid-phase antibody, then add TYR to wells, Combined TYR antibody which With HRP labeled ,become antibody - antigen - enzyme-antibody complex, after washing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. The concentration of TYR in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samplesto the standard curve.Materials provided with the kitSpecimen requirements1.serum- coagulation at room temperature 10-20 mins，centrifugation 20-min at the speed of2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.2.plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix 10-20mins ,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.3.Urine-collect sue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m.remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again. The Operation of Hydrothorax and cerebrospinal fluid Reference to it.4.cell culture supernatant-detect secretory components, collect sue a sterile container,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant,detect the composition of cells, Dilut cell suspension with PBS（PH7.2-7.4）, Cell concentration reached 1 million / ml, repeated freeze-thaw cycles, damage cells and release of intracellular components, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.5.Tissue samples- After cutting samples, check the weight,add PBS（PH7.2-7.4）, Rapidlyfrozen with liquid nitrogen, maintain samples at 2-8℃ after melting,add PBS（PH7.4）, Homogenized by hand or Grinders, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m.remove supernatant.6.extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevantliterature, and should be experiment as soon as possible after the extraction. If it can’t, specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.7.Can’t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active. Assay procedure1.Dilute and add sample to Standard: set 10 Standard wells on the ELISA plates coated, add Standard 100μl to the first and the second well, then add Standard dilution50μl to the first and the second well, mix; take out 100μl form the first and the second well then add it to the third and the forth well separately. then add Standard dilution 50μl to the third and the forth well ,mix ; then take out 50μl from the third and the forth well discard, add 50μl t o the fifth and the sixth well ,then add Standard dilution 50μl to the fifth and the sixth well, mix ; take out 50μl from the fifth and the sixth well and add to the seventh and the eighth well, then add Standard dilution 50μl to the seventh and the eighth well ,mix ; take out 50μl from the seventh and the eighth well and add to the ninth and the tenth well, add Standard dilution 50μl to the ninth and the tenth well, mix , take out 50μl fro m the ninth and the tenth well discard(add Sample 50μl to each well after Diluting ,(density: 12U/L，8U/L ，4U/L，2U/L，1U/L)2.add sample：Set blank wells separately (blank comparison wells don’t add sample and HRP-Conjugate reagent, other each step operation is same). testing sample well. add Sample dilution 40μl to testing s ample well, then add testing sample 10μl (sample final dilution is 5-fold), add sample to wells , don’t touch the well wall as far as possible, and Gently mix.3.Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 30 min at 37℃.4.Configurate liquid: 30-fold (or 20-fold)wash solution diluted 30-fold (or 20-fold) with distilled water and reserve.5.washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent 50μl to each well, except blank well.7.incubate：Operation with 3.8.washing：Operation with 5.9.color：Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade the light preservation for 15 min at 37℃10.Stop the reaction：Add Stop Solution50μl to each well, Stop the reaction(the blue color change to yellow color).11.assay：take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution and within 15min.Important notes1.The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes inthe room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate should be stored in Sealed bag.2.washing buffer will Crystallization separation, it can be heated the water helps dissolvewhen dilute . Washing does not affect the result.3.add Sample with sampler Each step, And proofread its accuracy frequently, avoids theexperimental error. add sample within 5 mins, if the number of sample is much , recommend to use Volley .4.if the testing material content is excessively higher (The sample OD is bigger than the firststandard well ),please dilute Sample (n-fold), Please diluente and multiplied by the dilution factor.（×n×5）.5.Closure plate membrane only limits the disposable use, to avoid cross-contamination.6.The substrate evade the light preservation.7.Please according to use instruction strictly, The test result determination must take themicrotiter plate reader as a standard.8.All samples, washing buffer and each kind of reject should according to infective materialprocess.9.Do not mix reagents with those from other lots.CalculateAssay range0.3U/L -15U/LStorage and validity1．Storage ： 2-8℃. 2．validity ： six months.Take the standard density as the horizontal, the OD value for the vertical ,draw the standard curve on graph paper, Find out the corresponding density according to the sample OD value by the Sample curve, multiplied by the dilution multiple, or calculate the straight line regression equation of the standard curve with the standard density and the OD value ,with the sample OD value in the equation, calculate the sample density, multiplied by the dilution factor, the result is the sample actual density.This chart for reference only。