高效液相色谱技术
高效液相色谱法 HPLC
1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓
二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
高效液相色谱技术
反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来。流动相的pH对样品溶质的电离状态影响很大，进而影响其疏水性，所以在分离肽类和蛋白质等生物大分子的过程中，经常要加入修饰性的离子对物质，最常用的离子对试剂是三氟乙酸（TFA），使用浓度为0.1％，使流动相的pH值为2～3，这样可以有效地抑制氨基酸上α羧基的离介，使ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ疏水性增加，延长洗脱时间，提高分辨率和分离效果。 完全离子化的溶质，例如强酸或强碱，其在反相键合相上的保留值很低，近于死时间流出，不能进行分析。根据离子对色谱的原理将一种与样品离子电荷（A＋）相反的离子（B－），称为对离子，加入到流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对，即中性缔合物，从而增强了样品的疏水性，加大了保留值，改善了分离效果。
2. 柱效率： 定义： 理论塔板数 ： ( 每米柱 ) ơ—标准偏差，曲线拐点处峰宽的 1/2h 2ơ 一半，即峰高0.607处峰宽的一半。 W1/2 为便于测量，改用半峰宽： 1/2h W1/2( 或2×△t1/2 ) Wb 最常用的计算式： 另一计算式： ( Wb不如W1/2容易测量，因而此式用的较少。)
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
什么是高效液相色谱(HPLC)
什么是HPLC（高效液相色谱）？简史和一些定义液相色谱(LC)是俄国植物学家Mikhail S. Tswett在20世纪初定义的概念。
他当时专注于使用填充有颗粒的柱子分离用溶剂从植物中提取的化合物[叶色素]，这是液相色谱史上的先驱性研究。
Tswett用颗粒填充开放式玻璃柱。
他发现粉状白垩[碳酸钙]和氧化铝这两种特殊材料对分离有用。
他将样品[均质化植物叶子的溶剂提取物]倒入柱中，使样品通过颗粒床。
然后使纯溶剂通过。
当样品在重力作用下穿过柱子时，可以观察到样品分成了不同颜色的谱带，这是因为某些组分的移动速度快于其他组分。
他将这些不同颜色的分离谱带与样品中最初包含的不同化合物联系起来。
根据各种化合物对颗粒的化学吸引力强度不同，对这些化合物进行了分析分离。
对颗粒有更强吸引的化合物移动速度减慢，而对溶剂有更强吸引的其他化合物移动速度较快。
该过程可以描述如下：样品中包含的化合物在称为流动相的移动溶剂与称为固定相的颗粒之间以不同的方式分布或分配。
这导致各种化合物以不同的速度移动，从而引起化合物的分离。
Tswett创造了色谱(chromatography)[来自希腊词chroma（意思是颜色）和graph（意思是书写）的组合，即“彩色的书写”）]一词来描述其色彩斑斓的实验。
[有趣的是，俄语名字Tswett的意思是颜色。
]目前，各种形式的液相色谱已成为分析化学领域的一种强大工具。
液相色谱(LC)技术液相色谱可使用平面技术[技术1和2]或柱技术[技术3]来实施。
柱液相色谱的功能更为强大，并且具有更高的样品容量。
在所有情况下，样品都必须先溶解在液体中，然后输送到色谱装置之上或色谱装置内部。
技术1.将样品以点状形式上样到固定在玻璃板表面上的色谱颗粒[固定相]薄层上，然后使液流流过该薄层。
板的底部边缘置于溶剂中。
当溶剂[流动相]扩散至干燥颗粒层并沿玻璃板向上移动时，通过毛细管作用产生液流。
这种技术被称为薄层色谱或TLC。
hplc高效液相色谱法
HPLC高效液相色谱法简介高效液相色谱法（HPLC）是一种利用液体作为流动相，通过高压输液系统，将样品中的各组分在固定相和流动相之间进行分配或吸附等作用而实现分离和检测的色谱技术。
HPLC具有分离效率高、灵敏度高、选择性强、分析速度快、样品适用范围广等优点，已成为化学、生物、医药、环境等领域中最重要的分析方法之一。
本文将简要介绍HPLC的基本原理、仪器组成、常用的色谱模式和应用领域，以期对HPLC感兴趣的读者有所帮助。
一、HPLC的基本原理HPLC的基本原理是利用样品中的各组分在固定相和流动相之间的不同亲和力，使其在色谱柱内以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
固定相是填充在色谱柱内的颗粒状物质，可以是固体或涂于固体载体上的液体。
流动相是通过高压泵送入色谱柱的溶剂或溶剂混合物，可以是极性或非极性的。
样品是通过进样器注入流动相中，并随流动相进入色谱柱。
当样品中的各组分经过固定相时，会发生吸附、分配、离子交换、排阻等作用，导致它们在固定相中停留不同的时间。
这个时间称为保留时间（retention time），通常用tR表示。
保留时间是反映样品组分在色谱柱内分离程度的重要参数，不同的组分有不同的保留时间。
当样品组分从色谱柱出口流出时，会被检测器检测到，并产生一个信号。
这个信号随时间变化而变化，形成一个色谱峰（chromatographic peak）。
色谱峰的位置反映了样品组分的保留时间，色谱峰的面积或高度反映了样品组分的含量或浓度。
将检测器信号随时间变化而绘制出来，就得到了一条色谱图（chromatogram）。
色谱图上可以看到不同的色谱峰，每个峰对应一个样品组分。
通过比较保留时间和色谱峰面积或高度，就可以对样品进行定性和定量分析。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由以下几个部分组成：溶剂供给系统（solvent delivery system）：负责提供恒定压力和流速的流动相，并将溶剂混合成所需比例。
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱技术
高效液相色谱技术
高效液相色谱(HPLC)技术是一种用于分离、纯化、定性和定量分析溶液中化合物的技术。
它是在液相色谱技术基础上发展起来的，具有分离能力强、分辨率高、灵敏度高、分析速度快等优点。
HPLC技术的核心是色谱柱和溶液泵。
色谱柱是分离样品的重要部分，根据不同的分离目标可以选择不同类型的柱子，例如反相柱、离子交换柱、大小分子排阻柱等。
溶液泵用于将样品溶液以一定的流速推动通过色谱柱，保持流动相的恒定。
高效液相色谱技术主要包括以下几个步骤：
1. 样品预处理：将待分析样品进行处理，如提取、浓缩、溶解等，以便于后续的分析。
2. 进样：将样品注入到进样装置中，通过自动或手动控制，精确地给定进样体积。
3. 分离：在色谱柱中根据样品分离目标的性质和柱上固定相的特性，通过流动相的带动将样品分离。
4. 检测：利用检测器检测样品的浓度或质量，并将信号转化为电信号输出。
5. 数据处理：通过对检测器输出信号的处理和计算，得到对样品的定性和定量分析结果。
高效液相色谱技术在许多领域得到广泛应用，如药学、环境监测、食品安全等。
它能够对样品中的化合物进行高效、灵敏、准确的分离和分析，为科研和工业生产提供了强有力的工具。
高效液相色谱
高效液相色谱高效液相色谱，又称高压液相色谱（HPLC，High Performance Liquid Chromatography），是一种重要的色谱技术，广泛应用于药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。
相较于传统液相色谱，高效液相色谱具有分离效果好、分析速度快、灵敏度高等优势，因此成为现代分析实验的核心技术之一。
高效液相色谱的原理基于物质在不同相互作用力下的差异，通过样品在固定相上的分配行为，实现对不同成分的分离和分析。
其核心部分是色谱柱，包括固定相、流动相和样品分子。
其中，固定相是一种特定的固体或液体材料，具有一定的孔隙结构和表面特性，用于捕获和分离样品成分。
流动相则由溶剂组成，可以通过与固定相的相互作用调节分离效果。
而样品分子则根据其在固定相上的亲疏性，相继被吸附、扩散和解吸，最终实现分离。
高效液相色谱的分离过程包括样品进样、柱温控制、流速调节等步骤，每个步骤都需要严格控制，以保证分离效果和结果准确性。
在样品进样之前，通常需要采用样品前处理方法，如固相萃取、溶剂萃取等，以去除杂质和提高分析物的浓度。
然后，样品通过进样器进入色谱柱，通过控制流速和柱温，使样品成分在固定相上发生分配行为，从而实现分离。
最后，通过采集柱洗脱出来的物质，并通过检测器检测其浓度变化，得到分析结果。
高效液相色谱的关键是选择适当的固定相和流动相。
不同的样品性质和分析要求需要选择不同的固定相。
常见的固定相包括疏水相、离子交换相、亲水相等。
此外，流动相的选择也非常重要，常见的流动相溶剂有水、有机溶剂（如甲醇、乙腈）等。
合理选择固定相和流动相能提高分离效果，提高检测灵敏度。
高效液相色谱有多种检测器可供选择，常用的有紫外-可见光谱检测器（UV-Vis）、荧光检测器、质谱检测器等。
通过检测器的信号，可以得到样品的浓度信息，从而进行定量分析。
高效液相色谱在药物分析中的应用广泛。
例如，针对不同药物的检测需求，可以选择不同的色谱柱和流动相，在合适的检测器下进行分析。
高效液相色谱法
第十五章高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography，HPLC 15.1概述高效液相色谱又称为高压液相色谱（High Pressure Liquid Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquid Chromatography）、高分离度液相色谱（High Resolution Liquid Chromatography）或现代液相色谱（Modern Liquid Chromatography），是在20世纪60年代末期在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的一种新型分离分析技术。
由于其适用范围广，分离速度快，灵敏度高，色谱柱可以反复使用，样品用量少，还可以收集被分离的组分，特别是计算机等新技术的引入使其自动化与数据处理能力大大提高，高效液相色谱技术得到飞速发展。
高效液相色谱法和经典液相色谱法在分析原理上基本相同，但由于在技术上采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。
经过数十年的发展，高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化等方面，都达到了很高的程度，可以和气相色谱法相媲美，并保持了经典液相色谱对样品通用范围广、可供选择的流动相种类多和便于用作制备色谱等优点。
至今，高效液相色谱法已在生物工程、制药工业、食品行业、环境监测、石油化工等领域获得广泛的应用。
15.1.1与经典液相色谱法比较经典液相色谱法通常使用的固定相是多孔粗粒，装填在大口径长色谱柱（玻璃）管内，流动相是靠重力作用流经色谱柱的，溶质在固定相的传质速度缓慢，柱入口压力低，分析时间长，因此柱效低，分离能力差，难以解决复杂混合物的分离分析；而高效液相色谱法使用的固定相是全多孔微粒，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相是通过高压输液泵进入色谱柱的，溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快，柱效可比前者高2~3个数量级，从而在短时间内获得高柱效和高分离能力，可以分离上百个组分。
高效液相色谱法(HPLC)
4.离子对色谱法：将一种（或数种）与溶质离子电荷相 反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中， 使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保 留行为的一种色谱法。
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5.离子色谱法：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以电导检测器检 测组分含量，用抑制柱消除强电解质背景离子对电导检测器的干扰。（与离子交换 色谱法不同的是分离组分的检测器不同）
1．分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相 溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是 在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高 了分离效率，从而能分离各种复杂组分。
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2、固定相 (1)担体(表面多孔型) 它是30～ 40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为 1 ～ 2μm的多孔硅胶。由 于固定相仅是表面很薄一层，因此，传质速度快，加之是直径很小的均匀球体，装 填容易，重现性好，现已广泛使用！ 但表面积小，柱容量低，需用高灵敏度检测器。
高效液相色谱法(HPLC)
High Performance Liquid Chromatography
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§3- 1 高效液相色谱法概述
一、定义 以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做 流动相的新色谱技术.
而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品组分分子，为提高选择性 增加了一个因素。还可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大 分离的选择性（能同时选择固定相和流动相） 。
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②液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色 谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱是不 可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱ห้องสมุดไป่ตู้离条件的选择。
高效液相色谱-电化学法_概述及解释说明
高效液相色谱-电化学法概述及解释说明1. 引言1.1 概述高效液相色谱-电化学法（简称HPLC-EC）是一种常用的分析技术，利用高效液相色谱技术和电化学检测原理相结合，实现对样品中化合物的分离和定量分析。
此方法具有灵敏度高、选择性好、重复性好等优点，因而在环境科学、生物医药和食品安全等领域得到广泛应用。
1.2 文章结构本文共分五个部分进行阐述。
引言部分是对整篇文章的概述，介绍了HPLC-EC 技术的背景和研究意义。
第二部分将对HPLC技术和电化学法以及它们之间的结合进行简要介绍。
接下来一节将详细讨论HPLC-EC的实验原理与分析过程。
第四部分将探讨HPLC-EC在环境污染物、生物医药和食品安全领域中的应用案例。
最后一节是总结与展望，回顾整篇文章所提到的内容，并展望该技术在未来发展中可能取得的进展。
1.3 目的本文旨在全面介绍高效液相色谱-电化学法的相关知识，深入探讨其原理及其在环境科学、生物医药和食品安全领域的应用。
通过文章阐述，读者可以对HPLC-EC技术有一个全面的了解，并且了解到该技术在不同领域的实际应用和发展趋势。
2. 高效液相色谱-电化学法概述：2.1 高效液相色谱技术简介高效液相色谱(HPLC)是一种广泛应用于分析化学领域的分离技术。
它基于物质在溶剂流动下通过固定相的不同速率进行分离，可用于分析和检测各种化合物。
HPLC技术具有分离效果好、选择性强、重复性好等特点，因此被广泛应用于环境、生物医药和食品安全等领域的样品分析中。
2.2 电化学法简介电化学法是利用电极与溶液中存在的化学反应产生的电流或电势来检测或测定物质的一种方法。
根据所使用的电极类型和测量参数，常见的电化学方法包括极谱法、电化学滴定法、恒定电位法等。
这些方法可以实现对不同种类和浓度范围内的物质进行快速准确的检测和分析。
2.3 结合应用优势高效液相色谱-电化学法(HPLC-EC)是将HPLC技术与电化学方法相结合而形成的一种分析技术。
高效液相色谱法
正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作
流动相，即流动相的极性<固定相的极性。正相色 谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱， 极性大的后出柱。（反之为反相色谱）
高效液相色谱仪
压力表 储液器 高压泵
进样器
梯度洗 提装置
色 谱 柱
记录仪 检测器
馏分收集器
一 高压输液系统 1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni 合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行 泵内。 2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。 3.高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
二 分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱 本身所产生的峰形展宽相对要小些。即， HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些 因素包括：进样系统、连接管道及检测器 的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装 置简单、死体积小。但进样量小且重现性 差。
2．化学发光检测器
是近年发展起来的高选择性、高灵敏度
（二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光 光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池 的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达 1× 10-10g ／ ml ，比紫外检测 器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生 物能发荧光的物质。
主要用于氨基酸、
多环芳烃、维生素、 甾体化合物、酶类、 黄曲霉素、卟啉类 化合物、农药等的 检测。
利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解
度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般 为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段
高效液相色谱法（hplc）
高效液相色谱法(HPLC)一．概述色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。
二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC技术大发展，而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC的迅速发展。
目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。
现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。
HPLC已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。
1．HPLC的特点（1）适用范围广已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机物可用HPLC分析。
HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。
（2）流动相及固定均与样品分子作用，而GC仅固定相与样品分子作用。
（3）具有独特性能的柱填料（固定相）种类较多，具有多种分离方式，适于各种化合物分析。
（4）分离温度较低，提高了分离效率。
（5）具有一些独特的检测器：电化学，示差折光，可见紫外吸收及荧光检测器等。
（6）样品易回收。
2．HPLC分类按分离机理分为四类：吸附色谱（液固）：通过试样组分对活性固体表面吸附亲合力的不同实现分离。
对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性，早期应用较多，现在大多可用正相键合相色谱替代，常用硅胶柱。
分配色谱：不同溶质分子按其在固定相和流动相中分配系数不同得到分离。
现代分配色谱即化学键合相色谱，是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表面，具有很好的化学稳定性和热稳定性。
大部分分离问题都可用键合相色谱解决。
离子交换色谱：以离子交换剂为固定相，试样中电离组分与交换剂基体相反电荷的离解部位亲合力不同而分离。
用于分离无机或有机离子。
固定相为阴（阳）离子交换树脂，流动相为电解质溶液。
分子排阻色谱：按物质分子量大小进行分离。
不仅对高聚物，对分子量差别较大的低聚物或小分子化合物也可进行分离。
高效液相色谱法HPLC
VS
报告结果
整理分析数据，撰写分析报告，提供各组 分的浓度、纯度等相关信息，为科研或生 产提供决策依据。
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实验操作步骤
流动相的准备与平衡
根据实验要求配制流动相，通过泵以适宜的流速 通过色谱柱进行平衡。
洗脱与检测
流动相带着样品经过色谱柱洗脱，各个组分依次 流出并进入检测器进行检测。
ABCD
进样
将样品注入进样器，通过压力将样品送入色谱柱 进行分离。
数据处理与结果分析
对检测器输出的信号进行处理，得到各组分的峰 形和峰面积，进行定性和定量分析。
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进样
将样品注入色谱柱。
分离
在流动相的带动下，样品中的 组分在色谱柱中进行分离。
检测
检测器对分离后的组分进行检 测，并记录信号。
数据处理
对采集到的数据进行处理、分 析和存储。
高效液相色谱仪的维护和保养
定期清洗色谱柱
使用适当的溶剂清洗色谱柱， 以去除残留物和杂质。
维护和检查检测器
定期检查检测器的性能和准确 性，确保其正常运行。
数据处理系统
用于采集、处理、分析和存储色谱数据，通常采用色谱工 作站。
高效液相色谱仪的操作流程
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样品准备
将样品进行适当处理，以 便注入色谱柱。
流动相制备
根据实验要求，选择合适 的流动相，并进行过滤和 脱气处理。
系统平衡
在进样之前，确保色谱系 统达到平衡状态，以提高 分离效果。
高效液相色谱仪的操作流程
样品的预处理
分离
对于复杂样品，需要进行分离操 作以去除杂质或提取目标成分。 常用的分离方法包括离心、过滤、
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
高效液相色谱法
液相色谱法固定相
(三) 离子交换色谱法固定相
1. 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体， 在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。
2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基 团键合在惰性担体表面。
液相色谱法固定相
（四） 亲和色谱固定相
亲和色谱是一种基于分离物与配体间特异
的生物亲合作用来分离生物大分子的技术，它
五 高效液相色谱分离类型的选择
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品
的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应
用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质 量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度
以及化学结构等物理、化学性质。
1、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比
的作用越来越大，主要应用如下：
多环芳烃、农药、酚类、真菌毒素、异腈酸酯等
等。 特别是有机农药方面的检测。
1. 有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m)
流动相：正己烷
流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)
检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残 留量进行分析。
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
适于分离极性组分
反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC）
极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分
载体又称担体
(1) 全多孔型担体：
a.
HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球 体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的 Φ 100μ m全多孔型担体。
高效液相色谱检测技术
高效液相色谱法特点
高压：液体作为流动相流经色谱柱时，受到 的阻 力较大，施加高压能使液体迅速通过，一般高达 150-350 ×105Pa。
高速：载液在色谱柱内的流速较之经典液相色谱 法高得多，一般可达1-10mL/min。
高效：高效液相色谱法的柱效能可达3万塔板/米 ，而气相色谱法的柱效能仅为2000塔板/米。
高效液相色谱法自20世纪60年代问世以来，由于使用了高压输液泵、 全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器，实现了对样品的高速、高效和高 灵敏度的分离测定。高效液相色谱由于吸取了经典液相色谱的研制经验， 并引入微处理机技术，极大的提高了仪器的自动化水平和分析精度。现 在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很高，既能控制仪 器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液 收集、检测器功能等)，又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以 及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高
液相色谱仪最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检 测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还 可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进 样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。
液相色谱仪的工作过程：输液泵2将流动相以稳定的流速（或 压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器3将样品导入, 流动相将样品带入色谱柱4,在色谱柱中各组分因在固定相中的分 配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测
高灵敏度：采用高灵敏度的检测器，进一步提高 了分析的灵敏度，荧光检测器可达10-11 g 。
HPLC主要知名品牌
• 沃特斯（Waters • 安捷伦（Agilent） • 岛津（Shimazu） • 其它：戴安、菲尼根、热电等。
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电导检测器直接测定柱后洗脱液的电导 变化。将被测洗脱液臵于施加电场的两 个电极间，电导值 1／R（R为两电极间 电阻值）与电极截面积A，两电极间距 离 L和各离子的电导总和∑Cⅰλⅰ之间有 如下关系:
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式中Cⅰ为i离子的摩尔浓度，λⅰ为i离子的摩尔电导。
第二节 主要分离类型与原理P70
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(5) 液相色谱检测器
理想的HPLC检测器应具有如下特性：
第一，具有高灵敏度和可预测的响应； 第二，对样品所有组分都有响应，或具有可预测的特异性，适 用范围广； 第三，温度和洗脱液流速的变化对响应没有影响； 第四，响应与洗脱液组成无关，因此可作梯度洗脱； 第五，死体积小，不造成柱外谱带扩展； 第六，使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修； 第七，响应值随样品组分量的增加而线性增加，线性范围宽； 第八，不破坏样品组分； 第九，能对被检测的峰提供定性和定量信息； 第十，响应时间快。
(二)、HPLC与GC异同点
气相色谱 只能分析挥发性物质，只能分 析20%的化合物 不能用于热不稳定物质的分析 用毛细管色谱可得到很高的柱 效 有很灵敏的检测器如ECD和较灵 敏的通用检测器（FID和TCD） 流动相为气体，无毒，易于处 理 运行和操作容易 仪器制造难度较小
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高效液相色谱 几乎可以分析各种物质
可以用于热不稳定物质的分析 色谱柱不能很长，柱效不会很 高 没有较高灵敏的通用检测器①
流动相有毒，费用较高 运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大
① 近来出现的蒸发激光光散射检测器（ELSD）是灵敏度较高的通用检测器
流动相差别
GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。 HPLC：流动相为液体 组分与流动相和固定间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用。 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性 操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
basic principle and main separating types 一、液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatograph
二、液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatograph
三、离子交换色谱
ion-exchange chromatograph
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光电二极管阵列检测器
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c. 示差折光检测器
（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差 值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（ 每种物质具有不同的 折光指数）； 灵敏度低、对温 度敏感、不能用于梯 度洗脱； 偏转式、反射式 和干涉型三种；
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液
体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀 死体积小，很 适用于梯度洗 提等特性。
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往复式柱塞泵
(2)梯度淋洗装置
外梯度: （低压梯度） 将两种不同极性的 溶剂按一定的比例送入 梯度混合室，混合后进 入色谱柱。 内梯度：（高压梯度） 一台高压泵, 通过 比例调节阀,将两种或 多种不同极性的溶剂 按一定的比例抽入高 压泵中混合。
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示差折光检测器
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d. 荧光检测器
（fluorescence detector）
高灵敏度、高选择性的检测器。对 多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药、药物、氨基 酸、甾类化合物等有响应； 器(电导检测器、伏安检测器等)
e.其它检测器： 电化学检测
溶质性能 检测器
响应值取决于流动相中溶质 的物理或化学特性的检测器
浓度敏感 性检测器
按测量 信号性 质分 质量敏感 性检测器
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响应值正比于溶质在流动相 中的浓度，测量的是流动相 中溶质浓度瞬间的变化
样品量一定时，检 测器瞬间响应即峰 高响应值和流动相 流速无关，峰面积 与流速成反比，峰 面积与流速乘积为 常数
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二、液相色谱仪器
high performance liquid chromatograph
——2004年市场调查报告
2003年全球液相色谱市场的总销售额为25.16亿美金，2010年预计将达到 33.83亿美金。 国内对液相色谱仪的需求量越来越大： 2000年版中国药典规定用液相色谱仪对药物的最终质量控制和检验，较 之95版药典有了大幅度的增加；我国的医药生产、新药开发以及中草药的 研究都大大增加了对液相色谱的需求； 色谱分析已被列为全国化学及相关专业大学生的必修课，全国近 1000 所 大学学生实验用液相色谱仪的需求量将相当可观； 随着国家对环境保护和生态平衡的更加重视，“十五”期间全国各地的 环境监测站也已逐步配备液相色谱仪及其他分析仪器，对水质、大气和土 壤进行监控； 我国进出口国际贸易近年来快速增长，并还将持续大幅度增长，而色谱 分析方法及其色谱—质谱联用技术是世界公认的商品检验手段之一，只有 高质量的色谱仪、色质联用仪和高水平的检验结果才可能被世界各国认可 ，没有足够数量的高质量色谱仪器和色质联用仪就难以“与世界接轨”。 2013-10-13 我国液相色谱仪的发展远远落后于气相色谱仪的发展，目前国内使用的 液相色谱仪90%以上均是进口产品。
教学重点、教学难点：
1. 高效液相色谱与气相色谱的异同点 2. 高效液相色谱速率理论方程式在实验条件优化中的应用 3. 分离柱和流动相的选择和匹配 4. 不同种类液相色谱分离的原理上的差异
2013-10-13
第一节 高效液相色谱法概述
Generalization of high performance liquid chromatograph 一、概述 Generalization 二、高效液相色谱仪 HPLC 三、高效液相色谱法的特点 feature of HPLC 四、流程及主要部件 general process and main assembly of HPLC
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
2013-10-13
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
四、离子色谱
ion chromatograph
五、离子对色谱
ion-pair chromatograph
六、排阻色谱
size- exclusion chromatograph
七、亲和色谱(AC)
Affinity chromatograph
2013-10-13
一、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂：如硅胶、氧化铝等，较常使用 的是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂，“相似相 溶”原理 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；
峰面积与流动相流 速无关，峰响应值 与流速成正比
大部分常用的液 相色谱检测器都 属于该类检测器
响应值正比于单位时间内通 过检测器的物质的质量即正 比于质量流速
库仑检测器
光学性质 检测器
根据被测物质对光的吸收、 发射和散射等性质进行检测 的
应用范围广，灵敏 度高
按 测 量 原 理 分
紫外-可见检测器 ，示差折光率检 测器，蒸发光散 射检测器，荧光 检测器，化学发 光检测器，手性 检测器 安培检测器，电 导检测器，库仑 检测器，介电常 数检测器，极谱 检测器 光声检测器，热 透镜和光热偏转 检测器
电学及电 化学性质 检测器
根据被测物电化学性质进行 检测
热学性质 检测器 积分型检 测器 微分型检 测器
利用热学原理进行检测
按信号 记录方 式分
2013-10-13
显示的信号是指在给定时间 内物质通过检测器的总量 显示的信号表示在给定时间 内每一瞬间时通过检测器的 量
灵敏度低，定性困 难，应用少 灵敏度高
液相色谱仪（1）
2013-10-13
液相色谱仪（2）
2013-10-13
液相色谱仪（3）
201ห้องสมุดไป่ตู้-10-13
液相色谱仪（4）
2013-10-13
美.瓦里安 Prostar 210 高效液相色谱仪
2013-10-13
三、高效液相色谱法的特点和应用
特点： “三高” “一快” “一广” 高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度(紫外：10-9g；荧光：10-11g) 高选择性 分析速度快(＜1h) 应用范围广泛（可分析80%有机化合物） （是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。）
第三章 高效液相色谱分析
high performance liquid chromatograph
2013-10-13
教学目标及要求：
1.掌握液相色谱的特点； 2.掌握液相色谱法的分类； 3.了解影响液相色谱峰扩展及色谱分离的因素； 4.理解液相色谱分离的原理； 5.了解液相色谱的固定相和流动相； 6.了解液相色谱仪的组成和结构原理及主要部件； 7.了解液相色谱分离类型的选择； 8.了解液相色谱的应用。