PCR及核酸的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
琼脂糖凝胶浓度对电泳结果的影响
总结词
琼脂糖凝胶浓度对DNA分子的迁移速度和分离效果具有重要影响。
详细描述
不同浓度的琼脂糖凝胶对DNA分子的迁移速度和分离效果不同。高浓度的琼脂糖凝胶可以增加DNA分子的阻力， 减缓其迁移速度，从而提高分辨率。而低浓度的琼脂糖凝胶则会使DNA分子迁移速度加快，但分辨率降低。因此， 应根据DNA分子的大小和数量选择合适的琼脂糖凝胶浓度。
可视化
通过染色剂染色，可以 将DNA片段可视化，便 于观察和记录结果。
缺点
分辨率有限
琼脂糖凝胶电泳的分辨率有限，对于一些长度相近的DNA片段可能无 法区分。
易产生误差
由于操作过程中涉及到人为因素，如加样、凝胶制作等，容易产生误 差。
对小片段DNA检测效果不佳
对于小片段的DNA，琼脂糖凝胶电泳的检测效果不佳，可能会漏检。
电泳温度对电泳结果的影响
总结词
电泳温度对DNA分子的运动速度和琼脂糖凝胶的黏度有影响，进而影响电泳结 果。
详细描述
在一定范围内，较高的电泳温度可以提高DNA分子的运动速度，从而提高分辨 率。但温度过高可能导致凝胶变形和DNA分子变性，影响电泳结果。因此，应 根据DNA分子的大小和性质选择适宜的电泳温度。
在电场中，DNA分子会受到正极的吸引，向正极方向移动。
迁移速度与DNA分子大小相关
02
DNA分子越小，迁移速度越快；DNA分子越大，迁移速度越慢。
分离效果
03
通过琼脂糖凝胶的孔径大小和电场强度，可以将不同大小的
DNA分子进行分离。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的原理
琼脂糖凝胶孔径大小
DNA染料染色
琼脂糖凝胶具有不同孔径大小，可分离不 同大小的DNA分子。
实验2-PCR与琼脂糖凝胶电泳-New
1）吸取18µl水稻总DNA+3µl loading buffer, 混匀
Mark DNA: 5µl λDNA-HindⅢ
2） PCR产物+3µl loading buffer，混匀
Mark DNA : 5µl 100bp DNA 5、电泳：打开电源开关，调节电压至3-5 V/cm（约 100V），注意电极方向（可见到溴酚蓝条带 从负极向正极移动）；约30min后可观察 。
10× PCR buffer：
500mM KCl 200mM Tris-HCl（pH8.3）
0.01% 明胶 （ gelatin ）
15-20mM MgCl2
1×TBE缓冲液（1000ml）：电场中的导体 Tris 硼酸 EDTA 10.8 g 5.5 g 0.93 g
载样缓冲液（6×）：含指示剂溴芬蓝和二甲苯青，可在 可见光下指示样品的泳动过程 溴芬蓝 二甲苯青 甘油 0.25 % 0.25 % 30 %
0.2 µ l 引物R（10 µ M） :22179R
0.2 µ l Taq酶（5U/ µ l） 15.2 µ l ddH2O Total 18.0 µ l 模板DNA， 混匀，放入PCR仪中开始反应
最后加 2 µ l
PCR技术
PCR反应混合液（总体积20 µl）
成 份 ddH2O 1 15.2 n n × 15.2 10 152 25 380
72 ℃，延伸5 min PCR反应在带热盖的PCR仪上进行，大约
需要2小时。
电泳技术
3、制胶（浓度为2%）：
1）称取2.0g 琼脂糖，加入盛有200ml 1×TBE电泳缓冲 液的500ml蓝盖瓶中，摇匀，在微波炉上加热至琼脂 糖完全溶解，冷却到60 ℃，加入10µl Goldview并摇 匀。
琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳实验⼀、实验原理：琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA ⽚段的常⽤技术。
把DNA样品加⼊到⼀块包含电解质的多孔⽀持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。
由于DNA分⼦的双螺旋⾻架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。
在⼀定的电场强度下，DNA分⼦的迁移速度取决于分⼦筛效应。
具有不同的相对分⼦质量的DNA⽚段泳动速度不⼀样，因⽽可依据DNA分⼦的⼤⼩来使其分离。
凝胶电泳不仅可分离不同分⼦质量的DNA，也可以分离相对分⼦质量相同，⽽构型不同的DNA分⼦。
在电泳过程中可以通过⽰踪染料或相对分⼦质量标准参照物和样品⼀起进⾏电泳⽽得到检测。
相对分⼦质量标准参照物相对可以提供⼀个⽤于确定DNA⽚段⼤⼩的标准。
在凝胶中加⼊少量溴化⼄锭(ethidium bromide, EB)或者ＥＢ类似物，其分⼦可插⼊DNA的碱基之间，形成⼀种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红⾊荧光，因此也可对分离的DNA进⾏检测。
⼀般琼脂糖凝胶电泳适⽤于⼤⼩在0.2kb～50kb范围内的DNA⽚段。
三种不同构型分⼦进⾏电泳时的迁移速度⼤⼩顺序为：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的⽤来进⾏⼤⽚段核酸的电泳，⾼浓度的⽤来进⾏⼩⽚段分析。
低浓度胶易碎，⼩⼼操作和使⽤质量好的琼脂糖是解决办法。
注意⾼浓度的胶可能使分⼦⼤⼩相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常⽤的缓冲液有TAE和TBE，⽽TBE⽐TAE有着更好的缓冲能⼒。
电泳时使⽤新制的缓冲液可以明显提⾼电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使⽤后，离⼦强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产⽣条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
Marker的选择DNA电泳⼀定要使⽤DNA Marker或已知⼤⼩的正对照DNA来估计DNA⽚段⼤⼩。
RTPCR及琼脂糖凝胶电泳原理与结果精讲
RT-PCR反应程序
(1) 42℃30min， (2) 94℃3min， (3) 94℃变性3min，
(4) 94℃变性30sec，
(5) 52 ℃退火30sec， (6) 72 ℃延伸1min。 (7) goto(4)repeat29, （8）72 ℃延伸10min。
（9）hold at 4℃ 。
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸片段的有效方法琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸片段的有效方法琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性利用基质的特性利用电荷效应电荷效应在电场的作用下及在电场的作用下及中性中性phph的缓冲条件下的缓冲条件下带负电的核酸分子带负电的核酸分子向正极向正极迁移
RT-PCR反应体系
Volume(µl) 8(1µg) 4 2 1 0.4 1.0 Components R.T.Product 10xPCR buffer MgCl2(25mmol/L) Volume(µ l 5.0 2.5 2.5
Primer1
Primer2 Taq DNA polymerase ddH2O Total
琼脂糖凝胶电泳的操作过程
琼脂糖凝胶电泳的注意事项
配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA 分子大小来确定。
琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围
琼脂糖凝胶电泳的原理
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸片段的有效方法， 琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体 基质的特性，利用电荷效应，在电场的作用下及 中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极
迁移。利用分子筛效应可以分离不同片断大小和
不同构象的DNA、RNA分子。
琼脂糖凝胶电泳的主要用途
分离不同片断大小和不同构象的DNA、 RNA分子。 鉴定DNA片段，如PCR产物的鉴定。 纯化DNA分子。
PCR扩增产物的电泳分析
PCR扩增产物的电泳分析凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种.一、琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等.(一)凝胶浓度:凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定.琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围(二)电泳缓冲液核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解.10XTBE缓冲液的配制Tris硷，108克EDTA，9.3克硼酸，55克H2O至，1000ul(其PH应为8.0～8.2)临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释.(三)核酸电泳的指示剂与染色剂1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色.溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察.银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.(四)电泳1.电泳装置:电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等.2.电泳方法:(1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子.(2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA 片段，可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳.3.配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化.冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固.4.向电泳槽中倒入0.5XTBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子.如样品孔内有气泡，应设法除去.5.在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内.6.接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算).7.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳.一般200～400bp的PCR产物50V 电压，电泳20～40min即可.(3)溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小.二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA 序列分析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离.聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见表2.*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).(一)材料1.电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件.2.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N'一亚甲基双丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml装于棕色瓶内，4℃可保存二个月.3.10%过硫酸铵过硫酰铵，1克加水至，10ml4℃可保存一周，-20℃可保存一个月.4.1XTBE电泳缓冲液5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)(二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳:根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角.3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止.5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会.6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE缓冲液.7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡.9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳.10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果.12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高的灵敏度，可用银染.。
核酸电泳原理
核酸电泳原理
核酸电泳是一种分离和分析DNA或RNA的方法，其原理基于核酸在电场下的运动速率受其分子长度和电荷量的影响。
首先，核酸样品会被加入到含有琼脂糖的琼脂糖凝胶中。
琼脂糖凝胶是一种聚合物基质，具有孔隙结构。
这些孔隙可以使核酸分子根据其大小和电荷移动通过。
然后，在电泳槽两端建立一个电场，通常是通过在槽中放置两个电极并连接电源。
核酸样品会在电场作用下沿着凝胶孔隙向电极移动。
较小的核酸片段移动得更快，而较大的核酸片段移动得更慢。
在电泳过程中，核酸样品会在凝胶中形成一条或多条带状物。
这些带状物的位置和宽度反映了核酸样品中不同片段的大小和相对丰度。
为了可视化这些带状物，可以在核酸中加入荧光染料或通过其他方法进行标记。
然后，在电泳结束后，可以使用影像分析仪或紫外光照射来观察和记录核酸带状物的位置和强度。
总的来说，核酸电泳是通过利用核酸分子在电场下的运动速率差异来分离和分析核酸样品中的不同片段。
它是一种常用的核酸研究技术，可以用于检测DNA或RNA的长度、纯度、相对丰度以及其他相关信息。
琼脂糖凝胶电泳检测dna实验报告
琼脂糖凝胶电泳检测dna实验报告琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验报告引言：DNA是生物体中的重要遗传物质，通过检测和分析DNA可以揭示生物体的遗传信息。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分析方法，本实验旨在通过琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA样品的大小和纯度。
实验材料与方法：1. 实验材料：- DNA样品- DNA标准品- TBE缓冲液- 碱基对应的引物- DNA扩增反应体系- 琼脂糖凝胶- DNA电泳仪2. 实验方法：1) 准备琼脂糖凝胶：a. 取适量琼脂糖粉末加入TBE缓冲液中，搅拌均匀。
b. 将混合液加热至溶解，然后冷却至室温。
c. 将琼脂糖凝胶液倒入电泳槽中，插入梳子，待凝固。
2) 准备DNA样品：a. 取DNA样品，加入适量的DNA扩增反应体系。
b. 在PCR仪中进行DNA扩增反应，得到待检测的DNA样品。
3) 进行电泳检测：a. 取一定量的DNA样品和DNA标准品，加入电泳槽中的样品槽。
b. 打开电泳仪，设定适当的电压和时间。
c. 开始电泳，观察DNA在琼脂糖凝胶中的迁移情况。
结果与讨论：通过琼脂糖凝胶电泳检测，我们可以观察到DNA样品在电场作用下在琼脂糖凝胶中的迁移情况。
根据DNA片段的大小，我们可以通过比较DNA样品与DNA标准品的迁移距离，确定DNA样品的大小。
在实验中，我们发现不同大小的DNA片段会以不同的速度迁移，较小的DNA片段迁移速度较快，较大的DNA片段迁移速度较慢。
这是因为琼脂糖凝胶的孔径大小会影响DNA片段的迁移速度，较小的孔径会使DNA片段迁移速度变慢。
此外，我们还可以通过观察琼脂糖凝胶中DNA样品的带状图案来评估DNA样品的纯度。
如果带状图案清晰且无杂带，说明DNA样品较纯；而如果带状图案模糊或有多个杂带，说明DNA样品可能存在杂质或降解。
总结：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分析技术，通过观察DNA片段在琼脂糖凝胶中的迁移情况，我们可以确定DNA样品的大小和纯度。
这种技术在生物学研究和医学诊断中具有重要意义，可以帮助科学家们更好地理解生物体的遗传信息。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果1
溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA 样品在琼脂糖
凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动， 这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在
紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光
的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度
（一） 仪器
1. 2. 3. 4.
水平式凝胶电泳槽 稳压电泳仪 电炉 紫外检测仪
5. 台式离心机
（二）试
剂
1. 琼脂糖
2. TAE电泳缓冲液(50×) Tris 242g
冰醋酸
0.5mol/L EDTA（pH8.0）
57.1ml
100ml
3. 溴化乙锭溶液 纸包装保存。
10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂
琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果
实 验 目 的
了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握琼脂 糖凝胶的制作及进行电泳的方法。
实 验 原 理
琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，也是分
离和纯化DNA的常用方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观 察，可检测到10 ng的DNA）且检测的范围很广。它的原理是
4. 10×DNA样品上样缓冲液
实 验 步 骤
1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子，晾干。
2. 插好梳子。 3. 根据实验所需称取一定量的琼脂糖，放入制胶的容器中（一
般用三角瓶），然后加入适量的电泳缓冲液（1 × TAE）。
4. 加热，使琼脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至约60℃时，用少量的琼脂糖溶液封好挡板底部及两
端。
6. 在剩余的溶液中加入溴化乙锭至终浓度为0.5 μ g/ml，轻轻 摇匀（避免剧烈摇晃产生气泡），倒入制胶槽上，迅速在制胶 槽一端插上梳子，检查有无气泡。
凝胶电泳和PCR实验
实验二凝胶电泳和PCR实验一．凝胶电泳实验器材：电泳槽，电泳仪，制胶板，胶带，微波炉，凝胶成像系统，移液枪实验试剂：琼脂糖，Tris.base，冰乙酸，EDTA，DNA MAKER（D2000 PLUS），实验步骤：1.配电泳液（TAE缓冲液）：称量Tris 24.2g，Na2EDTA.2H2O 1.86g于烧杯中；向烧杯中加入约80ml去离子水，充分搅拌均匀；加入5.71ml的冰乙酸，充分溶解；用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至100mL后，室温保存。
使用时稀释50倍即1×TAE Buffer。
2. 配胶：先用胶带将制胶板两头封严，称量0.9%琼脂糖（即30ml胶加0.27g琼脂糖）凝胶（用电泳液配），一个制胶板约30ml凝胶。
用微波炉溶胶，待冷却一阵加入荧光染料2ul混匀，倒胶，立即插上梳子。
约20分钟后即可用，轻轻拔出梳子，将板放入电泳槽。
3. 点样：将待跑样品加1ul loading buffer点入点样孔，最后点2ul DNA Marker4. 跑胶：连接电泳槽，注意正负极，DNA从负极向正极跑，110V跑30分钟.5. 成像：将胶小心从胶版上拿起，放在紫外灯下照射拍照二．PCR实验PCR体系（20ul）：模板：0.5ul引物：上下游各0.3uldNTP: 2ulbuffer: 2ulrTaq酶：0.25ulddH20：14.7ulPCR条件：94°3min94°30s60°30s 30次72°45s72°10min4°forever实验三. PCR产物纯化：实验试剂：TE缓冲液( 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) 1 mmol/L EDTA(pH 8.0))，酚氯仿异戊醇，NaAc，无水乙醇实验步骤：1. 加约5倍体积的TE缓冲液，混匀2. 加等体积酚氯仿异戊醇，混匀，室温12000rpm离心5min3. 取上清，加1/10体积的3mol/L的NaAc(PH5.2)和2.5倍的冰冷无水乙醇4. -20°冰箱，放置30min以上5. 4°，12000rpm离心5min6. 弃上清，加1ml冰冷的70%乙醇。
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析【实验目的】1.学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2.掌握群体遗传学基因频率与基因型频率的计算方法。
【实验原理】1. 凝胶电泳是分离、鉴定、纯化及制备DNA片段最常用的方法，可分为两类，一类是琼脂糖凝胶电泳，适用于l kb和大于l kb以上DNA；另一类是聚丙烯酰胺凝胶电泳，适用于小于l kb的DNA。
琼脂糖凝胶电泳是一种简便易行的分离、纯化和鉴定DNA片段的方法。
分为水平板和垂直板两种，一般采用水平电泳。
2. 琼脂糖凝胶在DNA分子泳动时兼有“分子筛”和“电荷”的双重作用。
3. DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
4. 由于琼脂糖凝胶具有网络结构，因此电泳时，带电颗粒的分离速度不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小。
5. 由于实验中相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极移动。
6. 相对分子质量小者泳动快，大的泳动慢。
7. 溴化乙锭是分子生物学实验中常用的DNA荧光染料，含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团，它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。
DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。
溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍。
所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5μg/mL）时，可以检测到少至10ng的DNA条带8. TBE（成分：Tris，EDTA，硼酸，蒸馏水）的作用：a.稳定体系酸碱度（正负极氧化还原反应，使正极变酸、负极变碱性）b. 使溶液具有导电性，以利于DNA分子的迁移c. 其中的EDTA螯合镁离子，防止电泳时激活DNA酶9.引物二聚体: 引物二聚体是引物的3’端间相互错配扩增形成的。
引物二聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们的肉眼看不到而已。
琼脂糖凝胶电泳检测
凝胶成像分析系统
Lambda DNA / EcoRI + HindIII Marker （Ferments）
一个已知分子质量的 DNA样品做最对照， 用来确定待测样品的 相对分子质量。
• 凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成 像系统)等。
• 琼脂糖、 1XTBE电泳缓冲液、溴化乙锭、 6X载样缓冲液 （ 6X loading buffer）和DNA 分子量标准（ Lambda DNA / EcoRI + HindIII Marker ）等。
凝胶电泳系统
美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell
（2 ）加样： 5μl质粒DNA+1μl loading buffer ，混匀
15μlPCR产物+3μl loading buffer，混匀 10μl酶切产物+2μl loading buffer，混匀
6μlDNAMark （每板胶加一孔）
（3 ）电泳：电压3-5V/cm，约80-90V，注意电极方向 （4 ）染色：EB染色约15min
• EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废 液要经过处理才能丢弃。
• SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品 中，价格较昂贵。
【五】实验步骤
1. 制备琼脂糖凝胶（1%） 2. 制备凝胶板 3. 加样 4. 电泳 5. 染色 6. 结果观察
（1）制备凝胶和胶板：
45ml(1×TBE)+0.4g琼脂糖（ 三角瓶 ）， 煮胶，溶解，冷却至60℃(不烫手)，倒板(46mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。 胶板设计（44人）： • 每18孔胶板（5人X3样品+1marker），8胶板 • 每8孔胶板（2人X3样品+ 1marker ），2胶板
PCR 和凝胶电泳
实验一、实验二基因的PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测1、实验目的本实验通过学习用PCR扩增技术来获取特异性的基因DNA，以及扩增DNA的琼脂糖凝胶电泳检测技术，掌握有关的技术原理和实验方法。
2、实验原理2.1 特异性基因的PCR扩增：PCR扩增是指直接以待扩增的DNA为模板，加入特异性的一对引物、四种脱氧核糖核苷酸以及Tag DNA聚合酶等，进行DNA的合成反应。
2.2 琼脂糖电泳：DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5% 1,000～30,0000.7% 800～12,0001.0% 500～10,0001.2% 400～7,0001.5% 200～3,0003、材料、试剂及器具3.1 材料DNA模板3.2 试剂4XdNTP，Taq 酶 buffer，一对引物，Taq DNA聚合酶，琼脂糖，0.5*TBE。
3.3 器具PCR管，移液器，1.5ml Eppendorf管，PCR管架,Eppendorf管架，PCR 仪,电泳仪；紫外检测仪；水平电泳槽；一次性手套。
4、操作步骤4.1特定基因DNA的扩增1)配模板DNA液H2O 15.3 μldNTP (10 mM ) 0.5 μl10×Taq Buffer 2 μl引物1 (10 μM ) 0.5 μl引物2 (10 μM )0.5 μlTemplate 1 ulTaq DNA polymerase 0.2 μl==========================Total 20 μl2)加入1 ul的模板DNA。
对照组的模板为ddH2O。
3)进行PCR反应。
按照下列反应条件进行：预变性：95 ℃ 5 min变性：95 ℃？s退火反应：（Tm-5）℃？s引物延伸：72 ℃ 1 kb/min,循环数：30个循环补平反应：72 ℃ 5 min。
琼脂糖凝胶电泳在基因表达研究中的应用
琼脂糖凝胶电泳在基因表达研究中的应用琼脂糖凝胶电泳（Agarose Gel Electrophoresis）是一种常用的分离和检测核酸分子的实验方法，广泛应用于基因表达研究中。
本文将介绍琼脂糖凝胶电泳技术的原理、操作步骤以及在基因表达研究中的应用。
1. 原理琼脂糖凝胶电泳是基于DNA的电荷、大小和形状的差异，利用电场将DNA分子定向迁移的方法。
琼脂糖凝胶是一种由琼脂糖（agarose）制备的凝胶介质，其具有多孔结构，可以形成一系列固定孔径大小的凝胶柱。
在电泳过程中，DNA样品经过加热、退火、冷却等步骤后，被加载在琼脂糖凝胶中的孔隙中，然后施加电压使DNA在凝胶中迁移，根据DNA分子的大小和电荷性质，在凝胶中形成不同的DNA带。
2. 操作步骤（1）制备琼脂糖凝胶：将适量的琼脂糖加入缓冲液中，加热溶解后，静置冷却，形成琼脂糖凝胶。
（2）加载DNA样品：将待检测的DNA样品与DNA加载缓冲液混合，然后将混合液均匀加载到琼脂糖凝胶中的孔隙中。
（3）电泳：将琼脂糖凝胶板浸入电泳槽中，加入电泳缓冲液，施加适当电压进行电泳。
（4）染色和可视化：电泳结束后，将凝胶浸泡在DNA染色剂中，然后使用紫外灯或其他分析设备观察和记录DNA带的迁移情况。
3. 基因表达研究中的应用（1）DNA片段分析：琼脂糖凝胶电泳可以用于分析DNA片段的分子大小和纯度。
通过加载不同大小的DNA标准样品，可以确定目标DNA片段的分子大小。
此外，可以通过与其他技术相结合，如聚合酶链反应（PCR），来检测和分析具体基因的存在和表达情况。
（2）RNA分析：琼脂糖凝胶电泳也可用于分析RNA分子的存在和表达水平。
通过提取细胞或组织中的总RNA，通过逆转录反应转化为cDNA，然后加载到琼脂糖凝胶中进行电泳分析，可以检测和比较不同样品中的基因表达情况。
（3）蛋白质分析：琼脂糖凝胶电泳可以用于分析蛋白质的相对分子质量和组成。
通过将蛋白质样品经过电泳分离，然后进行染色或进行Western blot等检测方法，可以确定目标蛋白质的存在和表达水平。
pcr及琼脂糖凝胶电泳结果
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pcr产物电泳原理
pcr产物电泳原理
PCR产物电泳是一种常用于检测和分离PCR产物的技术，其原理基于DNA片段在电场中的迁移速度与其大小相关。
首先，在PCR反应结束后，产物通常包含了目标DNA片段及其它未反应的DNA和试剂残留物。
为了可视化和分离PCR产物，通常将其加入到一种称为琼脂糖凝胶的凝胶基质中。
琼脂糖凝胶是一种由琼脂糖和缓冲液组成的糖水溶液，具有一定的凝胶状态，类似于果冻。
在制备琼脂糖凝胶时，会在其中添加一种称为DNA染料的物质，用以可视化DNA分子。
凝胶形成后，将PCR产物沿着琼脂糖凝胶的一个侧面加载到一个凝胶槽中，与凝胶表面平行。
然后，将一定电压施加到凝胶槽的两端，使之形成一个电场。
由于DNA分子带有负电荷，施加电场后，DNA分子会朝着正电荷迁移。
小的DNA片段由于体积小，电荷轻，迁移速度较快，而大的DNA片段则迁移速度较慢。
在电泳过程中，由于DNA片段在凝胶中的迁移速度的差异，其会逐渐向前移动，并分成不同的带状条带。
最终，这些带状条带能够通过DNA染料在凝胶上的荧光显示，并且可以使用荧光成像系统或紫外线照射来进行观察和记录。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
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7
❖ 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当 DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动 时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化 乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物， 使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化 乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA 的含量，这样就可以检测DNA的浓度。
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5
❖ 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 ❖ 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0
线型DNA分子的分离范围 (Kb)
5～60
1～20
0.8～10
0.5～7
0.9～6
0.2～3
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0.1～2
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➢ DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分 子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
❖ 12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。
❖ 13.. 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中， 放于4℃保存，以备下实验用。
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PCR产物的 琼脂糖凝胶电泳
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使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750bp，500bp，250bp，100bp。
实验二 琼脂糖凝 胶电泳检测PCR产物
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生物体内DNA分Βιβλιοθήκη 复制的条件参与的组分 解旋酶 DNA母链 在DNA复制中的作用 打开DNA双链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
合成子链的原料
催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的 3’端开始连接脱氧核苷酸
引物
5 Essential Components of PCR Reaction
salts (ions)
DNA Polymerase
Template DNA dNTPs
Primers
GFP序列(~700bp)
ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAA
琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物
【目的】
掌握DNA琼脂糖凝胶电泳检测的原理，熟悉其 方法 。
【原理】
琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作 用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型 凝胶。
DNA的片段大小与相对迁移率相关
——分子量
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
【操作】
制胶
适量琼脂 糖
适量电泳 缓冲液
Δ
琼脂糖胶 溶液
1
2
20mL
+ – 3 4
点样孔 朝负极
制样 制胶
倒上电泳 缓冲液， 使其没过 点样孔。
点样 3
制样 制胶
倒上缓冲 液，使其 没过点样 孔。
样品（5μL）
小心！！！ 点样孔不要 戳破
点样 3
制样
制胶
点样 电泳
80－100V， 15min, 负极向正 极。结束后，取出琼脂糖凝 胶，置于紫外观察箱中观察。
——定量
PCR产物混合荧光染料（SYBR Green I)以及指示剂（溴酚蓝）后，以琼 脂糖凝胶为支持介质，在电泳冲液中电 泳，根据DNA片段的大小、构型分离成 不同区带，在紫外光下观察。
【试剂与器材】
• • • • • • 1.PCR产物、荧光染料（SYBR Green) 2.样品缓冲液（含溴酚蓝） 2.微量加样器 3.电泳仪、电泳槽 4.琼脂糖 5.TBE电泳缓冲液（pH8.0）
•1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 •1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,
比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
DNA聚合酶的特性
DNA聚合酶不能从头开始合 成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。 因此，DNA复制需要引物。
SYBR Green
SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光
琼脂糖凝胶不吸收紫外光
紫外灯下，结合有SYBR Green的PCR发出荧光
Excitation
SG 5’ 3’ SG
SG SG
SG SG
SG 3’
Emission
5’
SYBR Green结合的数量与DNA含量成正比
操作注意事项：
(1) 制胶时，要注意梳子的低部要距制胶板1mm以上。 (2) 凝胶冷却时要水平放置，完全凝固后才能使用。 (3) 点样时要小心，不要戳穿点样孔。 (4) 点加样品时，要缓缓加入，不能太快，否则样 品容易外溢，产生交叉污染。 (5) 样品点于电泳槽负极。 (6) 不要长时间观察紫外灯。
多聚酶链式反应扩增DNA片段及 琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段
PCR技术的创建
Kary B. Mullis（穆利斯（美））
•Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,扩增DNA的设想。
•1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。
3’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’
Primer1: 5’ Primer2: 5’
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………….. TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….
2011年高考理综北京31题
扩增GFP基本序列
5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ 3’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACC TGCTCGACATGTTCATT 5’
变性, 引物复性
5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC ……TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA Primer1: 5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………… ………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 3’ 5’ Primer2