贝类毒素的测定

麻痹性贝类毒素的测定方法

国际上麻痹性贝类毒素的检测方法较多，主要有小白鼠法、 高效液相色谱法、酶联免疫法、放射性免疫法等。 生物法(即小白鼠法)是国际惯用的麻痹性贝类毒素的测定 方法，已被美国公职分析化学家协会《公定分析方法》 （AOAO）收入，而成为最普遍应用的检验方法。 生物法 (即小白鼠法 )，系采用 ICR 系列的小白鼠作为检验 动物，进行贝类毒素分析
小白鼠试验

振荡使试液或其稀释液成为均匀的悬浮液 将每只小白鼠称重，每三只小白鼠为一组，分别将1mL 试液注射到小白鼠腹腔中 同时，另取三只小白鼠作为对照组，注射1mL 1%吐温60生理盐水于腹腔中 观察自注射开始到24h后的小白鼠 存活情况，求出一组三只中死亡两 只及两只以上的最小注射量



样品的测定
检样的制备

贝类 洗净外壳，切断闭壳 肌，开壳，用清水淋 洗内部去除泥沙及其 他外来杂质，仔细取 贝肉，收集沥水 5min （避免贝肉堆积）， 捡出碎壳等杂物，将 贝肉均质

注意：取肉时切勿 割破肉体，开壳前 不能加热或用麻醉 剂
样品的测定
检样的制备
贝类罐头 1. 将罐内所有内容物（包括贝肉组织及汁液）， 于均质器中均质 2. 大容量的罐头，则过滤分离贝肉及汁液，分别 称重，将固形物和汤汁按比例混合，充分均质 冷冻贝类 在室温下，使冷冻的样品（带壳或脱壳的）呈 半冷冻状态，按上述规定的方法清洗、开壳、 淋洗、取肉、均质
试剂和材料
Hale Waihona Puke Baidu

丙酮（分析纯） 乙醚（分析纯） 1% 吐温 -60 生理盐水：称取 1.0g 吐温 -60 ，溶于生理盐 水（0.8%NaCl）中，并定容至100.0mL
仪器和设备





旋转蒸发器 均质器 磨口烧瓶：圆底，500 mL，250 mL，100 mL 布氏漏斗：φ100mm 分液漏斗：具塞，500 mL 天平：感量0.1g 刻度试管：10mL，具塞 冰箱：0℃-5℃和-15℃- -20℃ 注射器：1mL 注射器针头：8# 小白鼠：体重为16-20g的健康ICR系雄性小白鼠


提取

取处理好的中肠腺，或200g贝肉置于均质杯内， 均质2min 加 3 倍量丙酮，与样品充分搅拌均匀后，用布 氏漏斗抽滤并收集提取液。对残渣以检样两倍 量丙酮再次抽滤两次，合并抽滤液

提取

将抽提液移入 500mL 的磨口烧瓶中，减压浓缩（旋转蒸发 器，56℃）去除丙酮，直至在液体表面分离出油状物 将浓缩液移入分液漏斗内，以100mL－200mL乙醚和少量的 水洗下粘壁部分，轻轻振荡(不能生成乳浊液)，静置分层 后，去除水层(下层)

小白鼠注射腹泻性贝毒后的症状 为运动不活泼，大多呼吸异常， 致死时间长
结果计算和表述
毒力的计算

使体重16-20g的小白鼠在24h死亡的毒力 为1个小白鼠单位（MU） 样品中DSP毒力的计算，按表1选择24h内 死亡二只及二只以上白鼠的最小注射量 及最大稀释倍数进行计算

注射量与毒力的关系
试验液 注射量mL 检样量1）g 毒力MU/g
在室温下，使冷冻的样品（带壳或去壳的）呈半冷冻 状态，按上述方法清洗、开壳、淋洗、取肉
冷冻贝类

检样的制备
取 样

可以切取中肠腺的贝类（扇贝、贻贝、牡蛎等），称取 200g贝肉后，仔细切取全部中肠腺，将中肠腺称重后细 切混合做为检样，注意不要使中肠内容物污染案板 对于尚未确定部位毒性的贝类及不易切取中肠腺的小 型贝肉，可将全部贝肉细切、混合，做为检样 为避免毒素的危害，应戴手套进行检验操作，移液管等 用过的器材应在5%的次氯酸钠溶液中浸泡1h以上，以使 毒素分解；废弃的提取液等也应用5%的次氯酸钠溶液处 理


用相当乙醚半量的蒸馏水洗乙醚层两次，再将乙醚层移入 250mL的磨口烧瓶中，减压浓缩 (旋转蒸发器， 35℃) 去除 乙醚
提取

以少量乙醚将浓缩物移入100mL磨口烧瓶中，再次减压 浓缩去除乙醚 以 1% 吐温 60 生理盐水将全部浓缩物在刻度试管中稀释 到 10mL 。此时 1mL 试液相当于 20g 去壳贝肉的重量，以 此悬浮液做为试验原液
贝类毒素的测定 生物法
一、麻痹性贝类毒素（PSP） Para1ytical shellfish poisoning



PSP中毒是最常见的食用贝类中毒 PSP由一组石房蛤毒及其衍生物组成，PSP与涡 鞭毛藻的水华有关（＞106个细胞／升） PSP在世界范围内分布 PSP 中毒引起神经系统紊乱，呼吸困难，感觉 窒息，心肺衰竭而在2—24小时内死亡 一般 PSP 中毒在 0.5-2h 的时间内，症状逐渐发 展，能承受12h以上的中毒者一般能康复
原液 原液 2倍稀释液 2倍稀释液 4倍稀释液 4倍稀释液 8倍稀释液 8倍稀释液 16倍稀释液 16倍稀释液
1.0 0.5 1.0 0.5 1.0 0.5 1.0 0.5 1.0 0.5
20 10 10 5 5 2.5 2.5 1.25 1.25 0.625
0.05 0.1 0.1 0.2 0.2 0.4 0.4 0.8 0.8 1.6

样品的测定
小鼠试验



若注射样品原液后，1只或2只小鼠的死亡时间 大于 7min ，则需再注射至少 3 只小鼠以确定样 品的毒力 若小鼠的死亡时间小于5min，则要稀释样品提 取液后，再注射另一组小鼠（3只），得到 5min-7min的死亡时间 稀释提取液时，要调节pH至2.0-4.0,逐滴加入 0.1mol/L或0.01mol/LHCl溶液
二、腹泻性贝类毒素（DSP） Diarrhetic shellfish poisoning

DSP是由于双壳贝类滤食含毒的涡鞭毛藻而引起

影响较严重的地区主要是日本和欧洲沿海国家， 发病率高，引起许多国家地区的关注 受DSP中毒的症状表现为消化功能紊乱（腹泻、 呕吐、腹痛），食用含毒贝类后 30 分钟至几小 时出现症状，中毒者一般在3-4天康复，尚无死 亡病例
检样的制备
生鲜带壳的贝类


用清水彻底洗净贝类外壳，开壳，用清水淋洗内部去 除泥沙及其他外来杂质，仔细取出贝肉，切勿割破肉 体 收集贝肉，沥水 5min ，捡出碎壳等杂物，迅速冷冻， 贮藏备用 注意不要破坏闭壳肌以外的组织，尤其是中肠腺（又 称消化盲囊，组织呈暗绿色或褐绿色）。开壳前不能 加热或用麻醉剂
结果的计算与判断
毒力的计算


根据小鼠的死亡时间，在附录B 中查出相应的每毫升注射 液的鼠单位数M 将存活鼠的死亡时间视为大于60min即相当于＜0.875MU 若试验动物重量＜ 19g或＞21g。则根据附录C查出重量校 正系数k 样品中PSP的含量按公式（1）计算。 ……………（1） 式中：
试剂
盐酸溶液：0.1 mol/L 盐酸溶液：5 mol/L 氢氧化钠溶液：0.1 mol/L

仪器和设备






均质器 天平（感量0.1g） 离心机 pH计 秒表 玻璃皿；烧杯、量筒、容量瓶、搅拌棒等 注射器：1mL 注射器针头：8#
小白鼠：
体重为19-21g的健康ICR系雄性小白鼠 若体重＜19g或＞21g，查表中的校正系 数便可得到校正的死亡时间 体重＞23g、或已用过的小白鼠则不能 使用

样品的测定
提取

取 100g 样 品 于 800mL 烧 杯 中 ， 加 0.1mol/L HCl 溶液 100mL 充分搅拌， 检查 pH （ pH 应为 2.0-4.0 ）。需要 时，可逐滴加入5mol/L HCl溶液或 0.1mol/L NaOH 溶液调整 pH ，加碱 时速度要慢，同时需不断搅拌，防 止局部碱化破坏毒素

将混合物加热，并徐徐煮沸 5min ，冷却至室温， 调节 pH 至 2.0-4.0 （切勿＞ 4.5 ）。将混合物移至 量筒中并稀释至200mL
样品的测定
提取

将混合物倒回烧杯，搅拌至均质状，使其沉降至 上清液呈半透明状，不能堵塞注射针头即可
必要时将混合物或上清液以3000r/min离心5min， 或用滤纸过滤 保留进行小鼠注射用的足量液体（约10mL）
1）以中肠腺为检样时，相当于含有中肠腺的去壳贝肉量。
谢谢 ！



生物法(即小白鼠法)优势：当使用生物法检测法时，一旦 发现超标样品，则本批样品不得食用，这说明所检测贝类 中相关的毒素含量已经影响到人们的食用安全，不适合食 用。
麻痹性贝类毒素的测定 生物法
(SC/T 3023-2003)
原理

根据小鼠注射贝类提取液后的死亡时间，查出 鼠单位，计算确定每100g贝肉中PSP的含量 特点：测定结果代表存在于贝肉内各种化学结 构的麻痹性贝类毒素的总量 鼠单位 mouse unit，MU：对体重为20g的小白 鼠腹腔注射1mL麻痹性贝类毒素后，小鼠在 15min时死亡所需的最低毒素量
X—样品中PSP含量，每百克样品中鼠单位（MU / 100g）
Ki—每只小鼠的重量校正系数 Mi—每只小鼠的鼠单位数，鼠单位（MU） D—样品提取液的稀释倍数 200—样品量，克（g）
结果的计算与判断
毒力单位转换
样品中的毒力单位的按公式（4）计算。 F· 80µ g /100g＝400MU/100g ………（3） F=5 式中： F—毒素转换系数； 80µ g /100g—样品中PSP限量，µ g /100g 400MU/100g—样品中PSP限量，MU/100g


样品的测定
小鼠试验

选择ICR系小鼠 称重：以感量为 0.1g 的天平将小鼠称重并 记录重量
样品的测定
小鼠试验

每个样品注射3只小鼠，每只小鼠腹腔注射1mL 提取液。注射时若有一滴以上提取液溢出，须 将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠 记录注射完毕时间，仔细观察 并用秒表记录小鼠停止呼吸时 的死亡时间（到小鼠呼出最 后一口气止）

腹泻性贝类毒素的测定方法
在国际上对腹泻性贝类毒素的检测方法较 多，主要有生物法、高效液相色谱法、酶 联免疫法、放射性免疫法等 生物法（小白鼠法， Mouse bioassay ）是 最常用的一种方法

腹泻性贝类毒素的测定 生物法
(SC/T 3024-2004)
原理

用丙酮提取贝类中毒素，再转移至乙醚中，经减压浓 缩蒸干后，再以 1% 吐温－ 60 生理盐水溶解残留物，注 射小白鼠观察存活情况，计算其毒力