贝类中麻痹性贝类毒素的测定 编制说明
贝类毒素的测定
用相当乙醚半量的蒸馏水洗乙醚层两次，再将乙醚层移入 250mL的磨口烧瓶中，减压浓缩 (旋转蒸发器， 35℃) 去除 乙醚
提取
以少量乙醚将浓缩物移入100mL磨口烧瓶中，再次减压 浓缩去除乙醚 以 1% 吐温 60 生理盐水将全部浓缩物在刻度试管中稀释 到 10mL 。此时 1mL 试液相当于 20g 去壳贝肉的重量，以 此悬浮液做为试验原液
小白鼠试验
振荡使试液或其稀释液成为均匀的悬浮液 将每只小白鼠称重，每三只小白鼠为一组，分别将1mL 试液注射到小白鼠腹腔中 同时，另取三只小白鼠作为对照组，注射1mL 1%吐温60生理盐水于腹腔中 观察自注射开始到24h后的小白鼠 存活情况，求出一组三只中死亡两 只及两只以上的最小注射量
样品的测定
检样的制备
贝类 洗净外壳，切断闭壳 肌，开壳，用清水淋 洗内部去除泥沙及其 他外来杂质，仔细取 贝肉，收集沥水 5min （避免贝肉堆积）， 捡出碎壳等杂物，将 贝肉均质
注意：取肉时切勿 割破肉体，开壳前 不能加热或用麻醉 剂
样品的测定
检样的制备
贝类罐头 1. 将罐内所有内容物（包括贝肉组织及汁液）， 于均质器中均质 2. 大容量的罐头，则过滤分离贝肉及汁液，分别 称重，将固形物和汤汁按比例混合，充分均质 冷冻贝类 在室温下，使冷冻的样品（带壳或脱壳的）呈 半冷冻状态，按上述规定的方法清洗、开壳、 淋洗、取肉、均质
将混合物加热，并徐徐煮沸 5min ，冷却至室温， 调节 pH 至 2.0-4.0 （切勿＞ 4.5 ）。将混合物移至 量筒中并稀释至200mL
样品的测定
提取
将混合物倒回烧杯，搅拌至均质状，使其沉降至 上清液呈半透明状，不能堵塞注射针头即可
水产品中麻痹性贝类毒素(PSP)检测论文
水产品中麻痹性贝类毒素（PSP）检测探析[摘要]目的：使用美国abraxis麻痹性贝类毒素试剂盒对40个北海海域的文蛤样品进行psp检测。
方法：使用酶联免疫试剂盒对文蛤麻痹性贝类毒素进行检测，检测限为0.02ng/g，灵敏度为为0.015 ng/g。
通过建立psp纯溶液的标准曲线测定，待测水产品的psp浓度。
结果：建立标准曲线后，最终测得水产品样品psp的平均含量为1.7ng/g结论：应用elisa法检测麻痹性贝类毒素，具有简便、快捷、成本低廉等特点，适用于快速检测的样品。
可以应用于水产品质量的快速检测以及对贝类进行质量监控。
麻痹性贝类毒素（psp）指存在于贝类体内，摄食后可以产生麻痹作用的一种海洋生物毒性物质。
psp的化学结构主要是石房蛤毒索（saxitoxin），是目前世界上一类分布最广、食物中毒频率最高、危害度最大的毒素。
关键词：水产品；麻痹性毒素；检测中图分类号：s9 文献标识码：a 文章编号：1009-914x（2013）02-01-011 资料与方法1.1 样品随机选取40个北海海域的文蛤样品，用于后续psp检测使用。
1.2 试剂美国abraxis贝类毒素试剂盒，甲醇。
1.3仪器酶标比色仪（bio一tek）、均质器、微量进样器、离心机、电子天平。
1.4方法1.4.1测定原理用特异性抗体同石房蛤毒素进行结合。
样本中的石房蛤毒素可与石房蛤毒素一酶的结合物进行竞争，与微孔板上的兔抗一石房蛤毒素抗体发生特异性结合。
石房蛤毒素抗体和微孔底部的二抗发生结合，洗板后加入底物，此时会产生蓝色物质。
颜色的深度同样本中的石房蛤毒素浓度成反比。
在规定时间内终止颜色反应，用酶标仪进行读值。
每个孔内的样本浓度通过做出标准曲线来读取。
1.3.2样品前处理除去样品的贝壳，用蒸馏水洗净后放入均质器中。
称取15g均质后的样品，加入15ml0.1 mol/l的盐酸溶液，并煮沸5min。
煮沸过程中需要不断搅拌。
冷却均质后，以3500r/min 的速度进行10分钟离心。
贝类中麻痹性贝类毒素的测定 标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定1 范围本标准适用于贝类及其制品中麻痹性贝类毒素的测定。
第一法为小鼠生物法，适用于麻痹性贝类毒素的总量测定；第二法为酶联免疫吸附法，适用于麻痹性贝类毒素的筛查检测；第三法为高效液相色谱法，适用于麻痹性贝类毒素总量(STXeq)，以及GTX4、GTX1、dcGTX3、B1、dcGTX2、GTX3、GTX2、neoSTX、dcSTX、STX等组分含量的常规检测；第四法为液相色谱-串联质谱测定法，适用于GTX1、GTX 4、GTX2、GTX 3、dcGTX2、dcGTX 3、neoSTX、STX、dcSTX、GTX5等10种麻痹性贝类毒素组分含量的测定及确证。
第一法小鼠生物法2 原理方法采用小鼠生物法对PSP予以定量。
根据小鼠腹腔注射贝类提取液后的死亡时间，查出鼠单位，并按小鼠体重，校正鼠单位(corrected mouse unit，CMU)，计算确定每100 g样品中PSP的鼠单位。
以石房蛤毒素作为标准，将鼠单位换算成毒素的微克数，计算确定每100 g贝肉内的PSP微克数。
所测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的PSP毒素总量。
3 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 氢氧化钠（NaOH）：将4.0 g氢氧化钠（NaOH）溶于1 L蒸馏水中。
3.2 盐酸（HCl）：分析纯。
3.2.1盐酸溶液（0.18 mol/L）：将15 mL浓盐酸（HCL）用蒸馏水稀释至1 L。
3.2.2盐酸溶液（5 mol/L）：将41.7 mL浓盐酸用蒸馏水稀释至100 mL。
3.3 无水乙醇（CH3CH2OH）：分析纯。
3.4 石房蛤毒素标准品（Saxitoxin，STX,C10H17N7O4·2HCl）：纯度≥98.0％。
3.5 标准溶液的配制3.5.1 石房蛤毒素贮备液（100 μg/mL）：用蒸馏水配制20％（v/v）的乙醇溶液，用5 mol/L盐酸调节pH到2.0～4.0之间，备用。
贝类中麻痹性贝类毒素的测定编制说明
贝类中麻痹性贝类毒素的测定编制说明《食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定》(征求意见稿)编制说明一、标准起草的基本情况（包括简要的起草过程、主要起草单位、起草人等）根据国卫办食品函〔2014〕386号文件“国家卫生计生委办公厅关于印发食品安全国家标准整合工作方案的通知”中附件4食品安全国家标准整合项目计划，由辽宁出入境检验检疫局负责中华人民共和国国家标准《贝类中麻痹性贝类毒素检验方法》（即本标准）的起草工作。
被修订标准号：GB/T 5009.213-2008《贝类中麻痹性贝类毒素的测定》、GB/T 23215-2008《贝类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定液相色谱-荧光检测法》、SC3023-2004《无公害食品麻痹性贝类毒素的测定生物法》、SN/T 0352-95《出口贝类麻痹性贝类毒素检验方法》、SN/T 1735-2006《进出口贝类产品中麻痹性贝类毒素检验方法高效液相色谱法》。
修订根据以被测指标为基础，对相同的被测指标有多个检测方法的，应进行整合的原则，建议整合制定《食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定》，其中包含四种检测方法：1.小鼠生物法；2.酶联免疫吸附法；3. 高效液相色谱法；4. 液相色谱-荧光检测法。
标准的制定过程主要分为标准方法整合、标准编写、不同方法之间互相验证等阶段，形成了标准征求意见稿。
标准根据GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求进行编写。
主要起草单位：辽宁出入境检验检疫局、深圳出入境检验检疫局、中国水产科学研究院东海水产研究所。
二、标准的重要内容及主要修改情况本标准适用于贝类及其制品中麻痹性贝类毒素的测定。
第一法适用于小鼠生物法测定麻痹性贝类毒素总量；第二法适用于采用酶联免疫吸附法进行麻痹性贝类毒素筛选检测；第三法为常规检测方法，适用于采用高效液相色谱法测定麻痹性贝类毒素总量(STXeq)，以及GTX4、GTX1、dcGTX3、B1、dcGTX2、GTX3、GTX2、neoSTX、dcSTX、STX等组分含量。
麻痹性贝类毒素标准样品的研制
Ｗａ ｇ ｕ ａ ， ｈ ｏＪ ｇ ｏ ｇ Ｘｕ ａ ｇＺ ｅｇＱ ｕ ｕ ， ｈ ｏｘｉ ｎ ｙ ｎ Ｚ ａ ｎ ｈ ｎ ， ｎ ， ｈｎ ｉｙ ｅＺ ａ ｎ Ｑｉ ｉ Ｙ
（ ｉ ｎｎ ｎｒ— ｘｔｎｐｃｉｎａｄＱｕｒ ｔ ｅ ｕｅｕ Ｄ ｌ １６ ０ ， ｈｎ ） Ｌａ ｉｇＥ ｔ Ｅ ｉＩｓｅｔ ａａ ｉ ｒａ ， ａｉ ｏ ｙ ｏ ｎ ｎ ｎＢ ｎ ａ １０ １Ｃ ｉａ
ｍｅ ｈ ｄ ｅ ａｕ ｔ ｎ ａ ｄ ｑ ａ ｉ ｏ ｔｏ ｅｄ ｔ ｒ ｎ ｔ ｎ ｏ Ｐ ｔ ｏ ｖ ｌ ａ ｉ ｕ ｌ ｙ ｃ ｎ ｒ ｌｎ ｔ ｅ ｅ ｍｉ ａ ｉ ｆ ｏ ｎ ｔ ｉ ｈ ｏ ＰＳ ．
Ｋｅ ｗｏ ｄ ｐ ｒ ｌ ｔ ｈ ｌ ｓ ｏ ｓ ｎ ｒ ｆ ｒ ｎ ｅ ｍａｅ ａ ； ｕ ｅｂ ｏ ｏ ｉ ａ ｅｈ ｄ ｓ ａｌ ｐ ｙ ｒｓ ａ ａｙ ｉ ｓ ｅ ｌ ｈ ｐ ｉｏ ； ｅ ｅ ｅ ｃ ｔｒ ｌ ｍｏ ｓ ｉ ｌ ｇ ｃ ｌ ｔ ｏ ； ｃ ｌ ｃ ｉ ｆ ｉ ｍ ｏ
ｍＬ， ４ ０ ／ ｉ 心 ５ｍｉ， 上清 液 作 为待 测 以 ０ ０ｒ ｒ ｎ离 ａ ｎ取 液 （ 液 ） 照标 准 方 法 ， 行 检测 ， 果 报 告单 原 ， 按 进 结
位为 ＭＵ／ 。 ｇ ２ 均 匀性检 验
０
２ ４ ７ ｌ Ｏ
表 ３ 麻 痹性 贝 类 毒 素 标 准样 品 稳 定性 检 验 结 果 （ ） 一
Ｔ ｅ Ｓ ｎｅｔ ｎ ｓ ｘ ａｄ ｄ ｎ ｅ ａ ｔ ｓ ５ ９± ２ ＭＵ／ ｋ ２）Ｔ ｅＰ Ｐｒｆｒｎｅｍａ ｒ ｌ ａ ｅ ｓｄｉ ｅ ｈ Ｐｃ ｔｎ ｄｉ ｐｎ ｅ ｃｒ ｉｙ ｗａ （８ ４ ） Ｐ ｏ ａ ｔｅ ｕ ｔ ｎ ｇ（ ＝ ． ｈ Ｓ ｅｅｃ ｔ ａｃｎｂ ｅ ｔ ｅ ｅ ｉ ｕ ｎｈ
贝类中失忆性贝类毒素的测定 标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定1范围本标准适用于贝类及制品中失忆性贝类毒素的检测。
第一法为酶联免疫吸附法，适用于失忆性贝类毒素筛查检测；第二法为高效液相色谱法，适用于贝类可食部分及其制品（不包括盐渍制品）中软骨藻酸的常规检测；第三法为液相色谱-串联质谱法，适用于贝类可食部分及其制品（不包括盐渍制品）中软骨藻酸的确证。
第一法酶联免疫吸附法2 原理本方法测定基础是竞争性酶联免疫反应，酶标板上包被有针对软骨藻酸抗体的捕捉抗体，加入抗软骨藻酸抗体、标准液或样品溶液及软骨藻酸酶标记物，游离的失忆性贝类毒素与软骨藻酸酶标记物竞争软骨藻酸抗体，同时软骨藻酸抗体与捕捉抗体连接。
没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。
将酶基质和显色剂加入到孔中并且孵育。
结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。
加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。
在450 nm测量微孔溶液的吸光度值，样品中的失忆性贝类毒素溶液与吸光度值成反比，按绘制的标准曲线定量计算。
3试剂和材料注: 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1无水甲醇（CH3OH）。
3.2 DA标准物质。
3.3 DA酶标记物。
3.4抗DA抗体。
3.5 包被有捕捉抗体的微孔板。
3.6基质（过氧化氢）/发色剂（四甲基联苯胺）。
3.7洗脱液：0.5％吐温20－PBS。
3.8反应终止液:6mol/L硫酸。
3.9半对数坐标纸。
3.10 商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准（附录A）。
4 仪器和设备4.1酶标仪：450 nm。
4.2 均质器。
4.3离心机：转速≥2000 转/分钟。
4.4微量加样器：50 μL, 100 μL，200 μL,1000 μL。
4.5 微量多通道加样器：50 μL～300 μL。
4.6 天平：感量为0.01 g。
4.7滤器：0.45 μm5 分析步骤5.1 试样制备5.1.1样品采集5.1.1.1分析样品要有充分的代表性，样品至少要10个以上，尽可能没有个体差异。
贝类毒素的测定
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1
一、麻痹性贝类毒素（PSP）
Para1ytical shellfish poisoning
PSP中毒是最常见的食用贝类中毒 PSP由一组石房蛤毒及其衍生物组成，PSP与涡
鞭毛藻的水华有关（＞106个细胞／升） PSP在世界范围内分布 PSP中毒引起神经系统紊乱，呼吸困难，感觉
记录注射完毕时间，仔细观察 并用秒表记录小鼠停止呼吸时 的死亡时间（到小鼠呼出最 后一口气止）
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13
样品的测定
小鼠试验
若注射样品原液后，1只或2只小鼠的死亡时间 大于7min，则需再注射至少3只小鼠以确定样 品的毒力
若小鼠的死亡时间小于5min，则要稀释样品提 取液后，再注射另一组小鼠（3只），得到 5min-7min的死亡时间
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9
样品的测定
提取
取 100g 样 品 于 800mL 烧 杯 中 ， 加 0.1mol/L HCl溶液100mL充分搅拌， 检 查 pH （ pH 应 为 2.0-4.0 ） 。 需 要 时，可逐滴加入5mol/L HCl溶液或 0.1mol/L NaOH溶液调整pH，加碱 时速度要慢，同时需不断搅拌，防 止局部碱化破坏毒素
8倍稀释液
0.5
1.25
16倍稀释液
1.0
1.25
16倍稀释液
0.5
0.625
1）以中肠腺为检样时，相当于含有中肠腺的去壳贝肉量。
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毒力MU/g 0.05 0.1 0.1 0.2 0.2 0.4 0.4 0.8 0.8 1.6
30
谢谢 ！
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31
原理
根据小鼠注射贝类提取液后的死亡时间，查出 鼠单位，计算确定每100g贝肉中PSP的含量
贝类中麻痹性贝类毒素的测定 标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定1 范围本标准适用于贝类及其制品中麻痹性贝类毒素的测定。
第一法为小鼠生物法，适用于麻痹性贝类毒素的总量测定；第二法为酶联免疫吸附法，适用于麻痹性贝类毒素的筛查检测；第三法为高效液相色谱法，适用于麻痹性贝类毒素总量(STXeq)，以及GTX4、GTX1、dcGTX3、B1、dcGTX2、GTX3、GTX2、neoSTX、dcSTX、STX等组分含量的常规检测；第四法为液相色谱-串联质谱测定法，适用于GTX1、GTX 4、GTX2、GTX 3、dcGTX2、dcGTX 3、neoSTX、STX、dcSTX、GTX5等10种麻痹性贝类毒素组分含量的测定及确证。
第一法小鼠生物法2 原理方法采用小鼠生物法对PSP予以定量。
根据小鼠腹腔注射贝类提取液后的死亡时间，查出鼠单位，并按小鼠体重，校正鼠单位(corrected mouse unit，CMU)，计算确定每100 g样品中PSP的鼠单位。
以石房蛤毒素作为标准，将鼠单位换算成毒素的微克数，计算确定每100 g贝肉内的PSP微克数。
所测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的PSP毒素总量。
3 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 氢氧化钠（NaOH）：将4.0 g氢氧化钠（NaOH）溶于1 L蒸馏水中。
3.2 盐酸（HCl）：分析纯。
3.2.1盐酸溶液（0.18 mol/L）：将15 mL浓盐酸（HCL）用蒸馏水稀释至1 L。
3.2.2盐酸溶液（5 mol/L）：将41.7 mL浓盐酸用蒸馏水稀释至100 mL。
3.3 无水乙醇（CH3CH2OH）：分析纯。
3.4 石房蛤毒素标准品（Saxitoxin，STX,C10H17N7O4·2HCl）：纯度≥98.0％。
3.5 标准溶液的配制3.5.1 石房蛤毒素贮备液（100 μg/mL）：用蒸馏水配制20％（v/v）的乙醇溶液，用5 mol/L盐酸调节pH到2.0～4.0之间，备用。
麻痹性贝毒素的毒理效应及检测技术
麻痹性贝毒素的毒理效应及检测技术
张杭君;张建英
【期刊名称】《海洋环境科学》
【年(卷),期】2003(22)4
【摘要】近年来世界各地,特别是我国浙江、广东等沿海地区赤潮发生过度频繁,许多赤潮生物分泌的毒素不但使其他海洋生物中毒,更会对人类健康造成潜在的危害。
因此对赤潮毒素的研究已成为海洋环境科学研究的重要内容。
麻痹性贝毒素是其中重要的一类赤潮藻毒素。
它们毒性大,作用强,在全球的分布越来越广泛,并且已经在世界范围内造成了严重的危害,引起了国内外科学家的高度重视。
本文详细综述了
近年来国外在麻痹性贝毒素检测技术方面最新的研究进展,重点介绍了麻痹性贝毒
素的化学结构、前处理技术和分析检测新技术及其毒性作用机理。
【总页数】5页(P76-80)
【关键词】麻痹性贝毒素;检测;毒性
【作者】张杭君;张建英
【作者单位】浙江大学环境与资源学院
【正文语种】中文
【中图分类】X171.5;X55
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超高效液相色谱-串联质谱法测定水产中10种麻痹性贝类毒素
超高效液相色谱-串联质谱法测定水产中10种麻痹性贝类毒素冯静;陈曦;邹淼;华正罡【摘要】建立超高效液相色谱-串联质谱法测定贝类中麻痹性贝类毒素的方法.样品经0.5％甲酸加热提取,石墨化炭黑固相萃取柱净化后,用超高效液相色谱-串联质谱法测定.采用TSK-Gel Amide-80色谱柱(150 mm×2.0 mm,5μm),以水溶液(含2 mmol/L甲酸铵,50 mmol/L甲酸)A,95％乙腈水溶液(含2 mmol/L甲酸铵,50 mmol/L甲酸)B为流动相,梯度洗脱,流量为0.3 mL/min,进样体积为10μL,多反应监测(MRM)模式检测.藤沟藻毒素3、4(GTX3、GTX4)、脱氧藤沟藻毒素3(dcGTX3)的检出限为8μg/kg,藤沟藻毒素5(GTX5)、新石房蛤毒素(neoSTX)、石房蛤毒素(STX)、脱氧甲酰基类毒素(dcSTX)的检出限为20μg/kg,藤沟藻毒素1,2(GTX1,GTX2)的检出限为24μg/kg,脱氧藤沟藻毒素2(dcGTX2)的检出限为28μg/kg.GTX3,dcGTX3,GTX4的线性范围为4～80μg/L,GTX5,neoSTX,STX,d eSTX的线性范围为10～200μg/L,GTX1的线性范围为12～240μg/L,GTX2的线性范围为11～220μg/L,dcGTX2的线性范围为14～280μg/L,线性相关系数均大于0.99,平均回收率为82.5％～115.1％,测定结果的相对标准偏差为0.6％～7.5％(n=6).该方法检出限低,精确度高,适用于水产品中麻痹性贝类毒素的检测.【期刊名称】《化学分析计量》【年(卷),期】2019(028)004【总页数】6页(P42-47)【关键词】超高效液相色谱-串联质谱;贝类;毒素【作者】冯静;陈曦;邹淼;华正罡【作者单位】辽宁省疾病预防控制中心,沈阳 110005;辽宁省疾病预防控制中心,沈阳 110005;辽宁省疾病预防控制中心,沈阳 110005;辽宁省疾病预防控制中心,沈阳110005【正文语种】中文【中图分类】O657.7麻痹性贝类毒素(Paralytic shell fish poisoning toxins, PSTs)是生物毒素中危害最大［1］，分布范围最广，事故发生频率最高的一种海洋生物毒素［2-3］，是由甲藻产生的一类四氢嘌呤类化合物的总称，目前已经分离出20余种［4］。
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麻痹性贝类毒素体外生物毒性检测方法的建立于志强;孙运;陈小青;刘汉伟;马中春【摘要】目的:建立麻痹性贝类毒素体外生物毒性检测方法.方法:小鼠神经干细胞(NSC)培养于96孔培养板中,至对数生长期,每孔加入170μL培养液和10μL石房蛤毒素(STX)标准品(分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 ng),再加入10 mmol/L的乌本苷10μL及1 mmol/L的藜芦碱10μL.同时设置乌本苷及藜芦碱对照孔,以及空白对照孔.CCK-8溶液孵育后用酶标仪测定各孔D(450)值,根据石房蛤毒素标准液含量与D(450)值之间的剂量反应关系,建立标准曲线.结果:培养的正常NSC第1天为单细胞悬液,第2～3天聚集成为小神经球,第4天为大神经球;加入乌本苷及藜芦碱后较多细胞出现肿胀破裂,加入STX后可见肿胀或破裂死亡的细胞,但细胞形态多为正常.并于0.2～1.0 ng范围内建立了麻痹性贝类毒素体外生物毒性检测方法并建立了标准曲线,其回归方程为y=1.252+0.495x(r=0.9980,P<0.01).结论:成功建立了麻痹性贝类毒素体外生物毒性检测方法,该研究为神经性贝类毒素的体外检测相关研究奠定了基础.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2019(031)004【总页数】4页(P323-326)【关键词】麻痹性贝类毒素;小鼠神经干细胞;体外检测方法;乌本苷;藜芦碱【作者】于志强;孙运;陈小青;刘汉伟;马中春【作者单位】宁波中盛产品检测有限公司/宁波海关技术中心,浙江宁波 315000;宁波中盛产品检测有限公司/宁波海关技术中心,浙江宁波 315000;宁波中盛产品检测有限公司/宁波海关技术中心,浙江宁波 315000;宁波中盛产品检测有限公司/宁波海关技术中心,浙江宁波 315000;宁波中盛产品检测有限公司/宁波海关技术中心,浙江宁波 315000【正文语种】中文【中图分类】R991贝类毒素是由海洋中的有毒藻类通过食物链传递给藻食性的贝类，并在其体内蓄积、放大、转化形成的有毒高分子化合物[1]。
贝类毒素的测定
精品课件
样品的测定
小鼠试验
若注射样品原液后，1只或2只小鼠的死亡时间 大于7min，则需再注射至少3只小鼠以确定样 品的毒力
若小鼠的死亡时间小于5min，则要稀释样品提 取液后，再注射另一组小鼠（3只），得到 5min-7min的死亡时间
将混合物加热，并徐徐煮沸5min，冷却至室温， 调节pH至2.0-4.0（切勿＞4.5）。将混合物移至 量筒中并稀释至200mL
精品课件
样品的测定
提取
将混合物倒回烧杯，搅拌至均质状，使其沉降至 上清液呈半透明状，不能堵塞注射针头即可
必要时将混合物或上清液以3000r/min离心5min， 或用滤纸过滤
DSP是由于双壳贝类滤食含毒的涡鞭毛藻而引起 影响较严重的地区主要是日本和欧洲沿海国家，
发病率高，引起许多国家地区的关注 受DSP中毒的症状表现为消化功能紊乱（腹泻、
呕吐、腹痛），食用含毒贝类后30分钟至几小 时出现症状，中毒者一般在3-4天康复，尚无死 亡病例
精品课件
腹泻性贝类毒素的测定方法
试剂
盐酸溶液：0.1 mol/L 盐酸溶液：5 mol/L 氢氧化钠溶液：0.1 mol/L
精品课件
仪器和设备
均质器 天平（感量0.1g） 离心机 pH计 秒表 玻璃皿；烧杯、量筒、容量瓶、搅拌棒等 注射器：1mL 注射器针头：8#
精品课件
小白鼠：
体重为19-21g的健康ICR系雄性小白鼠 若体重＜19g或＞21g，查表中的校正系
精品课件
剂
样品的测定
检样的制备
贝类罐头 1.将罐内所有内容物（包括贝肉组织及汁液），
麻痹性贝类毒素GTX14和GTX23标准样品的制备技术
摘要:贝类毒素标准样品的制备是保障贝类质量安全的基础ꎬ本研究以有毒贻贝( Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ) 为原料ꎬ探究麻痹性 贝类毒素标准样品的制备技术ꎮ 以 １％ 乙酸溶液提取贻贝中的麻痹性贝类毒素ꎬ采用羟丙基葡聚糖凝胶柱( Ｓｅｐｈａｒｄｅｘ ＬＨ２０) 净化后收集目标馏分ꎬ再经高效液相色谱以 ＴＳＫ － ＧＥＬ Ｈｉｌｌｉｃ Ａｍｉｄｅ － ８０ 色谱柱(４. ６ ｍｍ × ２５０. ０ ｍｍꎬ５. ０ μｍ) 分离、纯化ꎬ根据麻痹性贝类毒素的保留时间收集色谱峰流出液ꎬ连续制备合并馏分ꎬ４０ ℃ 减压蒸馏浓缩近干ꎬ用 ７５％ 乙腈水( 含 ０. ２５％ 甲酸) 溶解ꎬ即制得毒素标准样品溶液ꎮ 分别采用四极杆 / 离子阱复合质谱与标准物质的多级质谱 信息进行匹配ꎬ以高分辨质谱获得的精确质量数进行定性确证ꎬ样品溶液所含的麻痹性贝类毒素为 ４ 种膝沟藻毒素ꎬ 分别为膝沟 藻 毒 素 － １＆ － ４ ( Ｇｏｎｙａｕｔｘｉｎｓ － １＆ － ４ꎬ ＧＴＸ１＆４ ) 和 膝 沟 藻 毒 素 － ２＆ － ３ ( Ｇｏｎｙａｕｔｘｉｎｓ － ２＆ － ３ꎬ ＧＴＸ２＆３) ꎮ 均匀性实验中ꎬ经 Ｆ 检验表明在 ９５％ 的置信区间范围内样品均匀性良好ꎮ 稳定性考察实验中ꎬ标准样品 在 ４ ℃ 和 － １８ ℃ 两种环境条件下储存 ６ 个月稳定性较好ꎮ 标准样品经 ８ 家实验室联合定值ꎬ并评定了定值结果的不 确定度ꎮ 本研究制得的麻痹性贝类毒素标准样品为 ＧＴＸ １(３ ６６３ μｇ / Ｌ) ＆ＧＴＸ４(１ １４７ μｇ / Ｌ) 和 ＧＴＸ ２(１ ８８４ μｇ / Ｌ) ＆ＧＴＸ３(７９７ μｇ / Ｌ) 的混合溶液ꎬ溶剂为 ７５％ 乙腈水( 含 ０. ２５％ 甲酸) ꎬ为国内贝类毒素标准样品研发提供了技术支 撑ꎮ [ 中国渔业质量与标准ꎬ２０１９ꎬ９(２) :６２ － ７０] 关键词:麻痹性贝类毒素ꎻ膝沟藻毒素ꎻ标准样品ꎻ高效液相色谱ꎻ制备ꎻ均匀性ꎻ稳定性ꎻ不确定度 中图分类号:Ｓ９４ 文献标志码:Ａ 文章编号:２０９５ － １８３３(２０１９)０２ － ００６２ － ０９
贝类体内麻痹性贝类毒素的提取方法研究
贝类体内麻痹性贝类毒素的提取方法研究摘要：采用浓度系列为0．04、0．07、0．10、0．15、0．20、0．25、0．30、0．40、0．50、0．70、1．0 mol／L的HCI和HAc溶液作为提取液，分别取10 mL提取液与10 g栉孔扇贝性腺混合，在沸水浴中加热5 min提取麻痹性贝类毒素(PsP)；同时采用0．3 mol／L HAc 和0．2 mol／L HCl，于冰水浴中进行超声波提取麻痹性贝类毒素5—30 min。
提取完成后将混合物于4℃冷冻离心机内离心5 min(3500 r／min)，取上清液并以0．1 mol／L NaOH或5 moL／L HCl调整至pH为2．0～4．0。
经超滤膜过滤后的提取液以高效液相色谱柱后衍生荧光检测法进行毒素分析，研究毒素组分间的转化关系和提取效率，并与超声波提取法进行了比较。
结果表明，采用0．04～0．25 mol／L HCl和0．04—1．0 moVL HAc从贝肉中提取PSP毒素。
各毒素组分浓度差异不大，当HCI浓度大于0．25 mol／L时，Ⅳ一磺酰氨甲酰基类毒素cl浓度急剧降低，HCI浓度大于0．5 mol／L时，～．磺酰氨甲酰基类毒素C2和GTX5浓度急剧降低，j者在酸度过大的情况下分解或转化为膝沟藻毒素-2(GTX2)，膝沟藻毒索-3(GTX3)和石房蛤毒素(STX)。
在相同浓度酸的情况下，超声波提取液中c1毒素的浓度显著低于沸水浴提取法，但c2的浓度略高于沸水浴提取液。
1 引言麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning toxins，PSP)是一类对人体神经系统产生麻痹作用的海洋生物毒素，主要由有毒甲藻产生，可通过食物链在贝类等生物体内累积放大【1l。
当人们误食这些染毒的海产品时，就会发生中毒或死亡。
PsP是一类四氢嘌呤的衍生物，现已发现该类毒素有20余种成分，分为四类：氨基甲酸酯类毒素(Carbamate toxins)，包括石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)，新石房蛤毒素(Neosaxitoxin，NEO)，膝沟藻毒素(Gonyautoxin)，包括膝沟藻毒素GTXI，GTX2，GTX3和GTX4；N一磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)，包括C1、C2、C3、C4、GTX5(B1)和GTX6(B2)；脱氨甲酰基类毒素(Decarbamoyl toxins)，包括Decarbamoyl saxitoxin(dcSTX)，Decarbamoyl neosaxitoxin(dcneoSTX)，Decarbamoyl gonyautoxins l 4(dcGTXl-4)；脱氧脱氨甲酰基类毒素(Deoxydecarbamoyltoxins)。
贝类毒素的测定
使用
BG
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样品的测定
检样的制备
贝类
洗净外壳，切断闭壳 肌，开壳，用清水淋 洗内部去除泥沙及其 他外来杂质，仔细取 贝 肉 ， 收 集 沥 水 5min （避免贝肉堆积）， 捡出碎壳等杂物，将 贝肉均质
BG
注意：取肉时切勿
割破肉体，开壳前
贝类毒素的测定 生物法
BG
1
一、麻痹性贝类毒素（PSP）
Para1ytical shellfish poisoning
PSP中毒是最常见的食用贝类中毒 PSP由一组石房蛤毒及其衍生物组成，PSP与涡
鞭毛藻的水华有关（＞106个细胞／升） PSP在世界范围内分布 PSP中毒引起神经系统紊乱，呼吸困难，感觉
生物法(即小白鼠法)，系采用ICR系列的小白鼠作为检验 动物，进行贝类毒素分析
生物法(即小白鼠法)优势：当使用生物法检测法时，一旦 发现超标样品，则本批样品不得食用，这说明所检测贝类
中相关的毒素含量已经影响到人们的食用安全，不适合食
用。
BG
3
麻痹性贝类毒素的测定 生物法
(SC/T 3023-2003)
BG
9பைடு நூலகம்
样品的测定
提取
取 100g 样 品 于 800mL 烧 杯 中 ， 加 0.1mol/L HCl溶液100mL充分搅拌， 检 查 pH （ pH 应 为 2.0-4.0 ） 。 需 要 时，可逐滴加入5mol/L HCl溶液或 0.1mol/L NaOH溶液调整pH，加碱 时速度要慢，同时需不断搅拌，防 止局部碱化破坏毒素
BG
14
结果的计算与判断
毒力的计算
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《食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定》
(征求意见稿)编制说明
一、标准起草的基本情况（包括简要的起草过程、主要起草单位、起草人等）
根据国卫办食品函〔2014〕386号文件“国家卫生计生委办公厅关于印发食品安全国家标准整合工作方案的通知”中附件4食品安全国家标准整合项目计划，由辽宁出入境检验检疫局负责中华人民共和国国家标准《贝类中麻痹性贝类毒素检验方法》（即本标准）的起草工作。
被修订标准号：GB/T 5009.213-2008《贝类中麻痹性贝类毒素的测定》、GB/T 23215-2008《贝类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定液相色谱-荧光检测法》、SC3023-2004《无公害食品麻痹性贝类毒素的测定生物法》、SN/T 0352-95《出口贝类麻痹性贝类毒素检验方法》、SN/T 1735-2006《进出口贝类产品中麻痹性贝类毒素检验方法高效液相色谱法》。
修订根据以被测指标为基础，对相同的被测指标有多个检测方法的，应进行整合的原则，建议整合制定《食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定》，其中包含四种检测方法：1.小鼠生物法；2.酶联免疫吸附法；3. 高效液相色谱法；4. 液相色谱-荧光检测法。
标准的制定过程主要分为标准方法整合、标准编写、不同方法之间互相验证等阶段，形成了标准征求意见稿。
标准根据GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求进行编写。
主要起草单位：辽宁出入境检验检疫局、深圳出入境检验检疫局、中国水产科学研究院东海水产研究所。
二、标准的重要内容及主要修改情况
本标准适用于贝类及其制品中麻痹性贝类毒素的测定。
第一法适用于小鼠生物法测定麻痹性贝类毒素总量；第二法适用于采用酶联免疫吸附法进行麻痹性贝类毒素筛选检测；第三法为常规检测方法，适用于采用高效液相色谱法测定麻痹性贝类毒素总量(STXeq)，以及GTX4、GTX1、dcGTX3、B1、dcGTX2、GTX3、GTX2、neoSTX、dcSTX、STX等组分含量。
第四法液相色谱-串联质谱法，作为麻痹性贝类毒素确证方法。
本标准是按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第四部分：化学分析方法》的要求进行编写的。
标准的编制工作系统研究了国内外标准和相关文献，小鼠生物法等同采用了GB/T 5009.213-2008《贝类中麻痹性贝
类毒素的测定》标准；高效液相色谱法修改采用了美国官方分析化学师学会（AOAC）的标准49.10.03 AOAC Official Method 2005.06 Paralytic Shellfish Poisoning Toxinsin Shellfish。
标准第一法小鼠生物法，等同采用了GB/T 5009.213-2008《贝类中麻痹性贝类毒素的测定》标准。
标准第二法酶联免疫吸附法，修改采用了SN/T 1773-2006《进出口贝类中麻痹性贝类毒素检验方法酶联免疫吸附试验法》标准。
与SN/T 1773-2006标准相比，增加了“商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准”内容；在附录中，规定了商业化试剂盒评价技术参数要求。
标准第三法高效液相色谱法，等同采用GB/T 23215-2008《贝类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定液相色谱-荧光检测法》。
方法回收率和精密度实验，以不含PSP的元贝和扇贝的食用部分为添加基质，设定了125μg/kg（STXeq）、250μg/kg（STXeq）、750μg/kg（STXeq）、1250μg/kg（STXeq）四个添加浓度，每个浓度进行十次实验，测得各种麻痹性贝类毒素的平均回收率为80.9% —89.3 %，变异系数为1.1%—13.3%，符合《基本规定》的要求。
验证结果表明，方法平均回收率72.3%—92.1%，实验室间变异系数为0.68%~9.2 % ，完全满足《基本规定》的要求
标准第四法液相色谱-串联质谱法，运用液相色谱-三重四级杆串联质谱技术建立了贝类中10种PSP测定方法，能够提供准确的化合物结构信息，提高了定性和定量的准确性。
室内和室间验证试验结果表明，方法加标回收率在79%-101%，实验室间相对标准偏差＜15%，方法样品前处理方法合理，可操作性强，重现性好，检出限、回收率、精密度方面均能满足分析检测的要求。
三、国际标准情况
小鼠生物测定法被美国公职分析化学家协会AOAC（959.08）推广为PSP的标准检
验方法，同时也是唯一国际大多数国家普遍接受的统一方法。
在测定方法上，除荷兰采用高效液相色谱法以外的其他国家和组织均用小鼠生物测定法，其中日本、韩国和丹麦三国采用小鼠生物测定法和高效液相色谱法两种方法。
现有的对PSP的仪器分析方法中，高效液相色谱（HPLC）法较为成熟，已经有一些国家将HPLC法作为检测PSP的标准方法，如荷兰；而丹麦、英国、日本和韩国则将HPLC法作为小鼠生物测定法的补充验证。
欧洲议会、理事会第2004/853/EC号法规及食品法典委员会CAC CODEX STAN 292法规均规定了麻痹性贝类毒素的限量800微克/千克。
食品法典委员会CAC CODEX STAN 292法规中明确规定了麻痹性贝类毒素的官方检测方法为AOAC 49.10.03 Official Method 2005.06 Paralytic Shellfish Poisoning Toxinsin Shellfish（美国官方分析化学师学会的贝类中麻痹性贝类毒素含量的测定柱前衍生
化液相色谱-荧光检测法）。
四、其他需要在网上公开说明的事项
无。