贝类中腹泻性贝类毒素的测定

食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定1范围本标准规定了贝类中腹泻性贝类毒素测定的小鼠生物法,酶联免疫吸附法和液相色谱-串联质谱法㊂本标准中小鼠生物法和酶联免疫吸附法适用于贝类及其制品中腹泻性贝类毒素的测定,液相色谱-串联质谱法适用于贝类可食部分及其制品(不包括盐渍制品)中腹泻性贝类毒素大田软海绵酸(O A)㊁鳍藻毒素-1(D T X-1)和鳍藻毒素-2(D T X-2)的测定㊂小鼠生物法2原理用丙酮提取贝类中腹泻性贝类毒素(D S P),经无水乙醚分配,减压蒸干后,再以含1%吐温-60的生理盐水为分散介质,制成D S P混悬液㊂将该混悬液注射入小鼠腹腔,观察小鼠存活情况,计算其毒力㊂3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的一级水㊂3.1试剂3.1.1丙酮(C3H6O)㊂3.1.2无水乙醚(C4H10O)㊂3.1.3吐温-60(C64H126O26)㊂3.1.4氯化钠(N a C l)㊂3.2试剂配制3.2.1氯化钠溶液(0.85%):称取0.85g N a C l,加水溶解并定容至100m L㊂3.2.2吐温-60(1%):称取1.0g吐温-60,用氯化钠溶液(0.85%)溶解并定容至100m L㊂3.3材料3.3.1小鼠:体重为16g~20g的健康I C R品系雄性小鼠㊂3.3.2金属筛网:孔径约2mm㊂4仪器和设备4.1旋转蒸发器㊂4.2均质器㊂4.3天平:感量为0.1g㊂5分析步骤注:为避免毒素的危害,应戴手套进行操作㊂移液管及移液器吸头等用过的器材㊁废弃的提取液等应在次氯酸钠溶液(5%)浸泡1h以上以使毒素分解㊂对于动物实验过程中产生的污水㊁废弃物及动物尸体处理,应参照G B14925执行㊂5.1样品采集采取足够的贝类样品个数,并使贝肉达400g以上㊂远离实验室不能及时送检的样品,除了在常温下品质不会发生变化的,应将样品置于保温盒中冷冻送检,或采取必要措施保证其处于低温状态(0ħ~10ħ)送检㊂如为带壳样品,应开壳,去除水分后冷冻送检㊂5.2试样制备5.2.1生鲜带壳样品用清水彻底洗净贝类样品外表,切断闭壳肌,开壳,用清水淋洗内部去除泥沙及其他异物,取出贝肉㊂严禁以加热或药物方法开壳㊂注意不要破坏闭壳肌以外的组织,尤其是中肠腺(中肠腺又称消化盲囊,组织呈暗绿色或褐绿色)㊂将去壳贝肉置于孔径约2mm的金属筛网上,沥水5m i n㊂将贝肉剪碎㊂5.2.2冷冻样品在室温下使冷冻样品融化呈半冷冻状态㊂带壳冷冻的样品按5.2.1方法清洗㊁开壳㊁淋洗取肉,除去贝肉外部附着的冰片,抹去水分㊂将贝肉剪碎㊂5.3试样提取称取200g剪碎的贝肉试样置于均质杯中,按体积比加3倍量丙酮后均质2m i n以上㊂将均质好的物质倒入布氏漏斗中抽滤,收集滤液㊂分别用残渣2倍量的丙酮再清洗残渣两次,滤液与上述滤液合并㊂将滤液移入500m L的圆底烧瓶中,56ħʃ1ħ下,减压浓缩去除丙酮直至在液体表面分离出油状物㊂用100m L~200m L无水乙醚溶解油状物,倒入分液漏斗内,再用少量无水乙醚清洗圆底烧瓶,合并倒入分液漏斗内,以少量的水洗下粘壁部分,轻轻振荡(不能生成乳浊液),静置分层后去除水层(下层)㊂用相当乙醚半量的水洗乙醚层两次,去除水层,再将乙醚层移入250m L或500m L的圆底烧瓶中,于35ħʃ1ħ减压浓缩去除乙醚㊂用少量无水乙醚将浓缩物移入50m L或100m L圆底烧瓶中,再次减压浓缩去除乙醚㊂用1%吐温-60的生理盐水将全部浓缩物转移至刻度试管中稀释到10m L,充分振摇,制成均匀混悬液㊂1m L该混悬液相当于20g试样,以此混悬液为试验原液㊂以试验原液注射小鼠,当24h内2只或3只小鼠死亡时,需振荡试验原液使成均匀混悬液,用1%吐温-60生理盐水按表1逐步稀释成4倍或16倍的稀释液,充分混匀,按表1注射小鼠㊂5.4小鼠试验选择16g~20g健康I C R雄性小鼠6只,随机分为实验组和溶剂对照组两组,每组3只㊂实验组将腹腔注射试验原液或其稀释液,溶剂对照组将腹腔注射1%吐温-60生理盐水㊂分别取1m L待测液或1%吐温-60生理盐水腹腔注射小鼠㊂注射过程中若有提取液溢出,须将该只小鼠丢弃,并重新注射一只小鼠㊂仔细观察并记录死亡时间㊂死亡时间计算从注射完毕开始至小鼠停止呼吸(小鼠呼出最后一口气止)为止㊂存活动物应连续观察24h㊂观察时限24h内,在溶剂对照组小鼠正常的情况下,实验组若出现2只或3只小鼠死亡,则按表1进一步实验,以确定一组3只小鼠中死亡2只或2只以上的最小染毒量或最大稀释度㊂表1注射量㊁稀释度与毒力的关系注射液注射量m L相对应的试样量g毒力MU/g试验原液11.0200.05试验原液20.5100.14倍稀释液11.050.24倍稀释液20.52.50.416倍稀释液11.01.250.816倍稀释液20.50.6251.66分析结果的表述观察时限24h内,在溶剂对照组小鼠正常情况下,若实验组无小鼠死亡或仅有1只小鼠死亡,则报告样品中D S P毒力为:<0.05MU/g㊂观察时限24h内,在溶剂对照组小鼠正常情况下,若实验组有2只或3只小鼠死亡,则按5.4进行动物实验,并根据表1计算样品中D S P毒力,报告样品中D S P毒力为:ˑˑˑMU/g㊂酶联免疫吸附法7原理根据竞争性酶联免疫反应,游离的腹泻性贝类毒素与其酶标记物竞争腹泻性贝类毒素抗体㊂没有被结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去㊂将酶底物和显色剂加入到孔中并且孵育㊂结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物㊂加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色㊂用酶标仪在450n m波长下测量微孔溶液的吸光度值,试样中的腹泻性贝类毒素含量与吸光度值成反比,按绘制的标准曲线定量计算㊂8试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的一级水㊂8.1试剂8.1.1甲醇(C H3O H)㊂8.1.2十二水合磷酸氢二钠(N a2H P O4㊃12H2O)㊂8.1.3氯化钠(N a C l)㊂8.1.4氯化钾(K C l)㊂8.1.5磷酸二氢钾(K H2P O4)㊂8.1.6吐温-20(C58H114O26)㊂8.1.7牛血清白蛋白(B S A)㊂8.1.8酶标记物㊂8.1.9过氧化氢(H2O2)㊂8.1.103,3,5,5-四甲基联苯胺(TM B,C16H20N2)㊂8.1.11硫酸(H2S O4)㊂8.2试剂配制8.2.1甲醇溶液(90%):量取90m L甲醇,加入10m L水,混合均匀㊂8.2.2磷酸盐缓冲液(P B S溶液,p H7.4):分别称取磷酸二氢钾0.20g㊁十二水合磷酸氢二钠2.90g㊁氯化钠8.00g㊁氯化钾0.20g,加水溶解并定容至1000m L㊂8.2.3酶标记物稀释液:称取1.0g B S A,加P B S溶液溶解并定容至1000m L㊂8.2.4酶标记物工作液:用酶标记物稀释液将酶标记物稀释至工作浓度㊂8.2.5洗脱液:吸取0.5m L吐温-20加入P B S溶液中,并稀释至1000m L㊂8.2.6硫酸溶液(1m o l/L):吸取53.2m L硫酸,缓缓加至900m L水中,并用水稀释至1000m L㊂8.3标准品大田软海绵酸(O A,C44H68O13,C A S号78111-17-8)标准溶液㊂8.4标准溶液配制标准系列工作液:将大田软海绵酸标准溶液用P B S溶液稀释,配制成浓度分别为0μg/L㊁5μg/L㊁10μg/L㊁25μg/L㊁50μg/L㊁100μg/L㊁150μg/L和200μg/L的D S P标准系列工作液㊂现用现配㊂8.5材料包被有腹泻性贝类毒素抗体的微孔板㊂注:商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准,参见附录A㊂9仪器和设备9.1酶标仪㊂9.2均质器㊂9.3离心机:转速ȡ6000r/m i n㊂10分析步骤10.1样品采集同5.1㊂10.2试样制备同5.2㊂10.3 试样提取将剪碎的试样均质,准确称取10g (精确至0.1g ),加入50m L 甲醇溶液(90%),均质1m i n ~2m i n ,6000r /m i n 离心10m i n ,转移出上清液,根据上清液体积加入2倍体积的P B S 溶液,混合均匀,吸取50μL 试样稀释液进行测定㊂10.4 测定将包被有腹泻性贝类毒素抗体的微孔条插入微孔架并做好标记,其中包括空白对照孔㊁标准液孔和样液孔,分别做平行孔㊂向空白对照孔加入50μLP B S 溶液,标准液孔加入50μL 腹泻性贝类毒素标准系列工作液,样液孔加入50μL 样液㊂加入50μL 腹泻性贝类毒素酶标记物至每个微孔,迅速充分混合,22ħ~25ħ避光孵育10m i n ㊂孵育结束后,倒去孔中液体,每个微孔注入250μL 洗脱液冲洗,翻转微孔板,倾去孔内液体,再重复以上洗板操作4次,在吸水纸上拍干㊂每孔加50μL 过氧化氢和T M B ,充分混合,室温避光孵育6m i n ㊂每孔加入50μL 硫酸溶液(1m o l /L )迅速混匀,终止反应,在10m i n 内测量并记录450n m 波长下的吸光度值㊂若提取液经测定后的质量浓度超出标准曲线的线性范围,应适当稀释后重新测定㊂10.5 标准曲线的制作以腹泻性贝类毒素标准工作液质量浓度以10为底的对数值为横坐标,以式(1)计算的标准液的百分比吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线㊂腹泻性贝类毒素标准液或样液的百分比吸光度值按式(1)计算:A =SS 0ˑ100%(1)式中:A百分比吸光度值;S腹泻性贝类毒素标准液或样液的平均吸光度值;S 0 0μg/L 的腹泻性贝类毒素标准液的平均吸光度值㊂11 分析结果的表述试样中腹泻性贝类毒素的含量按式(2)计算:X =ρˑV ˑf m(2)式中:X 试样中腹泻性贝类毒素的含量,单位为微克每克(μg /g );ρ 由标准曲线得到的试样待测液中腹泻性贝类毒素的质量浓度,单位为微克每毫升(μg /m L );V 试样提取液的体积,单位为毫升(m L );f稀释倍数;m 试样的称样量,单位为克(g)㊂注:任何腹泻性贝类毒素含量大于16μg/100g 的样品即被认为是有害的,对人类食用不安全㊂12 其他本方法的定量限为10μg /k g㊂液相色谱-串联质谱法13原理试样经甲醇提取,碱性条件下水解释放出酯化态腹泻性贝类毒素,液相色谱分离,串联质谱法测定,以基质标准曲线进行外标法定量㊂14试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为优级纯,水为G B/T6682规定的一级水㊂14.1试剂14.1.1甲醇(C H3O H):色谱纯㊂14.1.2乙腈(C H3C N):色谱纯㊂14.1.3氨水(N H3㊃H2O)㊂14.1.4氢氧化钠(N a O H)㊂14.1.5盐酸(H C l)14.1.6甲酸铵(N H4C O O H):色谱纯㊂14.1.7甲酸(H C O O H):色谱纯㊂14.2试剂配制14.2.1甲醇溶液(30%):量取30m L甲醇,用水稀释至100m L㊂14.2.2甲醇溶液(20%):量取20m L甲醇,用水稀释至100m L㊂14.2.3氨水-甲醇溶液(0.3%):吸取0.3m L氨水,用甲醇稀释至100m L㊂14.2.4氢氧化钠溶液(2.5m o l/L):准确称取50g氢氧化钠,用水溶解并稀释至500m L㊂14.2.5盐酸溶液(2.5m o l/L):准确量取104.5m L盐酸,用水稀释至500m L㊂14.2.6流动相A[甲酸铵溶液(2mm o l/L)]:准确称取126m g甲酸铵,用50m L水将其全部溶解,加入2m L甲酸,加水定容至1000m L,室温下可保存48h㊂14.2.7流动相B[乙腈-甲酸铵溶液(2mm o l/L)(95+5)]:准确称取126m g甲酸铵,用30m L水溶解,加入2m L甲酸,加水稀释至50m L,再加入950m L乙腈,室温下可保存48h㊂14.3标准品14.3.1大田软海绵酸(O A,C44H68O13,C A S号78111-17-8)标准溶液:14.24μg/m L,或经国家认证并授予标准物质证书的一定浓度的O A标准溶液㊂14.3.2鳍藻毒素-1(D T X-1,C45H70O13,C A S号81720-10-7)标准溶液:15.15μg/m L,或经国家认证并授予标准物质证书的一定浓度的D T X-1标准溶液㊂14.3.3鳍藻毒素-2(D T X-2,C44H68O13,C A S号139933-46-3)标准溶液:7.80μg/m L,或经国家认证并授予标准物质证书的一定浓度的D T X-2标准溶液㊂14.4标准溶液配制14.4.1腹泻性贝类毒素混合标准中间液:分别吸取适量的各腹泻性贝类毒素标准溶液于5m L棕色容量瓶中,用甲醇稀释并定容,使各腹泻性贝类毒素浓度分别为:O A1.0μg/m L,D T X-11.0μg/m L,D T X-21.0μg/m L㊂-18ħ以下避光保存,保存期1个月㊂14.4.2腹泻性贝类毒素基质标准系列工作液:取5份空白试样,分别加入适量上述各浓度腹泻性贝类毒素混合标准中间液,按与试样相同的分析步骤处理,制成O A㊁D T X-1㊁D T X-2的质量浓度为0.8n g/ m L㊁1.6n g/m L㊁4.0n g/m L㊁8.0n g/m L和16.0n g/m L的基质标准系列工作液,过0.22μm的有机相微孔滤膜后备用㊂14.5材料14.5.1固相萃取柱:硅胶表面修饰苯乙烯二乙烯基苯聚合物型固相萃取柱,60m g/3m L,或性能相当者㊂使用前依次用1m L甲醇㊁1m L甲醇溶液(30%)活化㊂14.5.2微孔滤膜:0.22μm,有机相㊂15仪器和设备15.1液相色谱-串联质谱仪:配电喷雾离子源㊂15.2天平:感量为0.01g㊂15.3组织均质器:转速ȡ10000r/m i n㊂15.4涡旋振荡器㊂15.5离心机:转速ȡ8000r/m i n㊂15.6超声波清洗器㊂15.7恒温干燥箱㊂15.8固相萃取装置㊂15.9真空泵㊂15.10氮吹仪㊂15.11p H计㊂16分析步骤16.1样品采集同5.1㊂16.2试样制备同5.2㊂16.3试样提取16.3.1腹泻性贝类毒素提取将剪碎的试样均质,准确称取2g(精确至0.01g)于50m L具塞离心管中,加入9m L甲醇,涡旋混合1m i n,超声提取10m i n,8000r/m i n下离心5m i n,移出上清液于20m L刻度玻璃管中㊂残渣中加入9m L甲醇,重复提取一次,合并提取液,用甲醇定容至20m L㊂16.3.2酯化态腹泻性贝类毒素水解释放准确吸取提取液1m L置于螺纹口样品瓶中,加入氢氧化钠溶液(2.5m o l/L)125μL,混匀后用密封膜将瓶密封,于76ħ下温育40m i n,冷至室温后,加入盐酸溶液(2.5m o l/L)125μL并混匀,所得水解液(1.25m L相当于0.1g试样)可直接过0.22μm有机相微孔滤膜后,供液相色谱-串联质谱测定,或者必要时进行净化处理㊂16.4试样净化所得水解液用3m L水稀释,涡旋混匀后,移入已预活化的聚合物型固相萃取柱,待液体以1m L/ m i n的流速流出后,再用1m L甲醇溶液(20%)淋洗,弃去流出液,保持抽气2m i n,最后用1m L氨水-甲醇溶液(0.3%)洗脱,保持抽气2m i n,收集洗脱液,用甲醇定容至1m L(相当于0.1g试样),过0.22μm的有机相微孔滤膜后,供液相色谱-串联质谱测定㊂16.5空白试验除不加试样外,采用与试样相同的操作步骤,得到空白溶液㊂16.6仪器参考条件16.6.1液相色谱参考条件:a)色谱柱:C18柱,柱长100mm,内径2.1mm,粒径3.5μm,或性能相当者;b)流速:0.2m L/m i n;c)柱温:35ħ;d)进样量:10μL;e)流动相:流动相A为甲酸铵溶液(2mm o l/L),B为乙腈+甲酸铵溶液(2mm o l/L)(95+5),梯度洗脱,梯度洗脱条件见表2㊂表2流动相梯度洗脱条件时间/m i n A/%B/%0.070301.070303.010906.010906.170308.0703016.6.2质谱参考条件a)离子源:电喷雾离子源;b)扫描模式:负离子扫描;c)检测方式:多反应监测模式,O A㊁D T X-1㊁D T X-2母离子㊁子离子及去簇电压和碰撞能见表3;d)电喷雾电压(I S):-4000V;e)雾化气压力(G S1):414k P a;f)气帘气压力(C U R):104k P a;g)碰撞气压力(C A D):83k P a;h)辅助气流速(G S2):70L/m i n;i)离子源温度(T E M):550ħ㊂表3腹泻性贝类毒素多反应监测模式下母离子㊁子离子㊁去簇电压和碰撞能量目标化合物母离子m/z子离子m/z去簇电压V碰撞能量e V大田软海绵酸(O A)803255.3*-130-65 113.1-130-90鳍藻毒素-1(D T X-1)817255.2*-90-48 150.8-90-48鳍藻毒素-2(D T X-2)803255.0*113.0-130-130-65-90*代表定量离子㊂16.7基质校正标准曲线的制作将基质标准系列工作液分别注入液相色谱-串联质谱仪中,测定相应的峰面积,以标准工作液的质量浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线㊂腹泻性贝类毒素标准溶液的多反应监测色谱图参见图C.1㊂16.8试样溶液的测定将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中,得到峰面积,根据基质标准曲线得到试样溶液中腹泻性贝类毒素的质量浓度㊂在同样测试条件下,试样溶液中腹泻性贝类毒素的保留时间与基质标准工作液中腹泻性贝类毒素的保留时间之间的偏差在ʃ2.5%以内,且试样溶液中腹泻性贝类毒素的定性离子的相对丰度应与质量浓度相近的基质标准工作液中腹泻性贝类毒素的定性离子的相对丰度一致,其丰度比偏差应符合表4要求,则可判定试样溶液中存在被测化合物㊂表4定性离子相对丰度的最大允许偏差定性离子相对丰度>50%>20%~50%>10%~20%ɤ10%允许的相对偏差ʃ20%ʃ25%ʃ30%ʃ50%17分析结果的表述17.1试样中腹泻性贝类毒素的含量按式(3)计算:X i=ρiˑVˑ1000mˑ1000(3)式中:X i 试样中腹泻性贝类毒素的含量,单位为微克每千克(μg/k g);ρi 由基质标准曲线得到的试样溶液中腹泻性贝类毒素的质量浓度,单位为纳克每毫升(n g/m L);V 试样溶液的体积,单位为毫升(m L);1000 换算因子;m 与1m L试样提取液相当的试样质量,单位为克(g)㊂计算结果应扣除空白值㊂计算结果保留三位有效数字㊂17.2总毒力计算试样中腹泻性贝类毒素总毒力按式(4)计算:O A e q=ðn i=1X i㊃r i (4)式中:O A e q 腹泻性贝类毒素总毒力,单位为微克每千克(μg/k g);X i 各种腹泻性贝类毒素的含量,单位为微克每千克(μg/k g);r i 毒性因子㊂注:试样中各种腹泻性贝类毒素的含量需按照附录B中的毒性因子(T E F s),统一转换为总毒力(O A e q)㊂18精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%㊂19其他本方法中O A㊁D T X-1和D T X-2的检出限均为10.0μg/k g,O A㊁D T X-1和D T X-2的定量限均为30.0μg/k g㊂。