蛋白质相互作用研究方法
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• • • • 高效瞬时过表达系统 大量表达，增加复合物的量 标签 抗体
Figure 3. The Cys→Ser mutation of HPO destroying its enzyme activity disturbed neither HPO dimerization nor HPO-JAB1 interaction in vivo. COS 7 cells were cotransfected with JAB1 and either Myc-tagged HPOs (wild type or mutants) or Myc control vector. The cells lysates were incubated with a rabbit anti-JAB1 antibody then with protein A/G–Agarose. The immuno-complex was resolved on 15% SDS-PAGE and analyzed by immunoblotting with anti-Myc antibody. As an indication of the relative expression level for MycHPO, some of the total cell lysate used in immuno-precipitation was loaded onto lanes 8 (pCMV-Myc-HPOwt) and 9 (pCMV-Myc). Lanes 2 to 7 are from cells expressing JAB1/Myc and JAB1/Myc-HPO (HPOwt, HPOC67S, HPOC70S, HPOC67S/C70S and HPOC90S), respectively. Lane 1 is a control for lane 3 with rabbit mock antibody (normal IgG). A duplicate blot was also probed with anti-JAB1 antibody to monitor the amounts of JAB1 protein (bottom). IP, immuno-precipitation; IB, immuno-blotting.
Fig.21 Cellular localization of HPO and JAB1. COS 7 cells were tranfected with GFP-HPO or RFP-JAB1 constructs, respectively. The nuclei were stained by Hoechst 33342 (blue). All cell samples were visualized by confocal microscopy (Leica).
Co-Immunoprecipitation (co-IP)
免疫共沉淀
co-IP
• 细胞内蛋白质相互作用 • 原理 • 技术
原理
• • • • 形成X,Y 两种蛋白的复合物 用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来 用另一种蛋白的抗体检测 protein A/G agarose
细胞内过表达蛋白的免疫共沉淀
蛋白质相互作用 研究方法简介
• • • • • •
基因组序列测定→后基因组研究时代 编码功能蛋白的基因不到三万条 已知蛋白的功能，新基因的功能探索 蛋白质功能研究或蛋白质组学研究 蛋白质相互作用研究方法作为技术平台 蛋白在发挥作用时都不是孤立的， 而是相互联系的
• 一种蛋白的功能必须借助于其它蛋白的调 节或介导。这种调节或介导作用的实现首 先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。 如果找到与已知蛋白有相互作用的其它蛋 白（不管这种蛋白是已知的还是未知的）， 那么这种已知蛋白的功能研究有可能进入 一个新的天地。对于新基因 情况也 是如此。
• 加入另一种蛋白Y • 复合物 GST-X---Y (HIS-X---Y) • Wash, elution, detection by SDSPAGE and western blotting.
GST/HIS融合蛋白与重组蛋白的相互作用 • 重组蛋白 • X,Y均为原核表达蛋白 • GST-X---Y，用anti-Y antibody 进行 western blotting 检测
Yeast two-hybrid System
酵母双杂交系统
原理
• 把报告基因整合到酵母细胞基因组中，并 受转录因子 GAL4 的调控表达。一旦 GAL4 蛋白结合到报告基因调控序列相应的位点， 则启动其表达。
• 实际应用中，把 GAL4 基因分成两个部分：DNA结 合区（gal4 DNA binding domain, GBD ）和激活 区(gal4 activating domain, GAD ）。分别把 GBD 和 GAD 构建到两个不同的载体上，并能表达 相应的两个融合蛋白（GBD-X 和 GAD-Y）。 • 自激活作用检测： GBD-X和GAD GAD-Y和GBD 阴性对照 GBD 和 GAD GBD-IL2和GAD-IL2R（例如） 阳性对照
1. 随机缺失，制备一系列缺失体。 2. 对已知的 domain 或 motif 进行缺失。 3. 对磷酸化位点进行点突变，检测这些磷 酸化位点是否参与调节蛋白质的结合作 用。
Figure 1. The Cys→Ser mutation of HPO destroying its enzyme activity disturbed neither HPO dimerization nor HPO-JAB1 interaction in vivo. C) The indication of yeast cells containing vectors in each pie slice of the culture plate. D) Growth of transformants coexpressing HPO and JAB1 on selective leu–/trp–medium. E) Growth of transfected yeast cells on leu–/trp–/his– medium.
UASs, upstream activating sequences AD, activating domain BD, binding domain
• AD/library: A fusion of the GAL4 AD with a library cDNA/protein. • DNA-BD/bait: A fusion of the GAL4 DNABD with a bait cDNA/protein.
细胞内源性蛋白的免疫共沉淀
• 生理条件下的蛋白相互作用 • 内源性蛋白含量低 • 条件温和
组织内蛋白的免疫共沉淀
• 组织提取，切碎，匀浆，提取组织蛋白 • co-IP assay
蛋白质细胞内定位实验
• 直观，可以看到两种有相互作用的蛋白质 在细胞内的分布以及共定位的部位 • 蛋白质细胞内定位结果较为直观地反应蛋 白在细胞内的活动状态
应用
一、筛选相互作用的蛋白 可用于对 cDNA 文库的筛选。把你要研 究的蛋白亚克隆到 GBD 载体上，作为 “诱饵”蛋白。把文库蛋白基因亚克隆 到 GAD 载体上。 假阳性: 人为转染重组体 artificial 验证实验:进一步验证实验证明其在生理 情况下是否真的有作用。
Leabharlann Baidu
二.确定参与结合作用的 domain 或 motif
Yeast Phenotypes
• Ade–, His–, Leu–, or Trp– Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients. • Ade+ Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to grow. • His+ Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow. • LacZ+ Expresses the lacZ reporter gene; i.e., is positive for β-galactosidase activity. • Mel1+ Expresses the MEL1 reporter gene; i.e., is positive for α-galactosidase activity.
• 蛋白质定位及共定位研究必不可少。 • 因为相互作用的蛋白在功能上相互关联。 通过蛋白共定位研究，能够确定两种蛋白 在细胞内生理条件下相互作用的区域。
有色荧光蛋白标记技术
• • • • • 也可称为活细胞定位 分别克隆X，Y至荧光蛋白载体中 共转染 表达GFP/RFP，绿/红色荧光蛋白融合蛋白 confocal microscopy 共聚焦显微镜法 • 也可同时进行核染色
30 kD
15 kD
Blot: rHPO GST-JAB1 GST Coomasssie blue stain
GST/HIS 融合蛋白与体外 TNT 系统合成 的多肽或蛋白的相互作用
• 体外TNT系统合成Y，且可在Y上加上标签
• anti-Y antibody 或 标签抗体检测
• X-Y结合力弱时,S32标记 Y,放射自显影
Pull Down Assay
• 细胞外蛋白质相互作用 • 比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物 理的相互作用
• GST-pull down assay • HIS-pull down assay
原理 • 将目的蛋白基因克隆到带有GST或HIS 基因的原核表达载体中，进行原核表 达，得到GST-X或HIS-X融合蛋白。 • 把GST-X挂到Sepharose beads上, 如是 HIS-X 则挂到Ni-chelated agarose上。
GST/HIS融合蛋白与细胞内源性蛋白质的 相互作用
• 细胞提取物中的内源性蛋白（提取细胞总 蛋白与GST/HIS-X融合蛋白孵育） • S32标记
GST融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质 的相互作用
• 构建 Y 的真核表达载体，转染细胞，瞬时 表达（过表达）。
待测蛋白的磷酸化状态可能产生影响
• GST/HIS-X 融合蛋白与待测蛋白的相互作 用有可能与待测蛋白的磷酸化状态有关。
Figure 2. JAB1 binds to rHPO expressed in E.coli in vitro: rHPO were applied to columns of glutathione beads bearing GST or GSTJAB1.The bound rHPO was eluted together with GST-JAB1, was separated by SDS-PAGE, transferred to PVDF, and detected by anti-HPO antibody. The GST and GST-JAB1 were visualized by Coomasssie blue staining.
• 然后把 GBD-X 和 GAD-Y 两种载体共转染 到带有报告基因的酵母细胞中。当 GBD-X 融合蛋白中 X 蛋白与 GAD-Y 融合蛋白中 Y 蛋白发生相互作用时（或结合在一起 时），就使得原本分开的 GBD 和 GAD 蛋 白靠近并具有完整的 GAL4 蛋白的功能， 从而能够激活报告基因的表达。
Figure 3. The Cys→Ser mutation of HPO destroying its enzyme activity disturbed neither HPO dimerization nor HPO-JAB1 interaction in vivo. COS 7 cells were cotransfected with JAB1 and either Myc-tagged HPOs (wild type or mutants) or Myc control vector. The cells lysates were incubated with a rabbit anti-JAB1 antibody then with protein A/G–Agarose. The immuno-complex was resolved on 15% SDS-PAGE and analyzed by immunoblotting with anti-Myc antibody. As an indication of the relative expression level for MycHPO, some of the total cell lysate used in immuno-precipitation was loaded onto lanes 8 (pCMV-Myc-HPOwt) and 9 (pCMV-Myc). Lanes 2 to 7 are from cells expressing JAB1/Myc and JAB1/Myc-HPO (HPOwt, HPOC67S, HPOC70S, HPOC67S/C70S and HPOC90S), respectively. Lane 1 is a control for lane 3 with rabbit mock antibody (normal IgG). A duplicate blot was also probed with anti-JAB1 antibody to monitor the amounts of JAB1 protein (bottom). IP, immuno-precipitation; IB, immuno-blotting.
Fig.21 Cellular localization of HPO and JAB1. COS 7 cells were tranfected with GFP-HPO or RFP-JAB1 constructs, respectively. The nuclei were stained by Hoechst 33342 (blue). All cell samples were visualized by confocal microscopy (Leica).
Co-Immunoprecipitation (co-IP)
免疫共沉淀
co-IP
• 细胞内蛋白质相互作用 • 原理 • 技术
原理
• • • • 形成X,Y 两种蛋白的复合物 用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来 用另一种蛋白的抗体检测 protein A/G agarose
细胞内过表达蛋白的免疫共沉淀
蛋白质相互作用 研究方法简介
• • • • • •
基因组序列测定→后基因组研究时代 编码功能蛋白的基因不到三万条 已知蛋白的功能，新基因的功能探索 蛋白质功能研究或蛋白质组学研究 蛋白质相互作用研究方法作为技术平台 蛋白在发挥作用时都不是孤立的， 而是相互联系的
• 一种蛋白的功能必须借助于其它蛋白的调 节或介导。这种调节或介导作用的实现首 先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。 如果找到与已知蛋白有相互作用的其它蛋 白（不管这种蛋白是已知的还是未知的）， 那么这种已知蛋白的功能研究有可能进入 一个新的天地。对于新基因 情况也 是如此。
• 加入另一种蛋白Y • 复合物 GST-X---Y (HIS-X---Y) • Wash, elution, detection by SDSPAGE and western blotting.
GST/HIS融合蛋白与重组蛋白的相互作用 • 重组蛋白 • X,Y均为原核表达蛋白 • GST-X---Y，用anti-Y antibody 进行 western blotting 检测
Yeast two-hybrid System
酵母双杂交系统
原理
• 把报告基因整合到酵母细胞基因组中，并 受转录因子 GAL4 的调控表达。一旦 GAL4 蛋白结合到报告基因调控序列相应的位点， 则启动其表达。
• 实际应用中，把 GAL4 基因分成两个部分：DNA结 合区（gal4 DNA binding domain, GBD ）和激活 区(gal4 activating domain, GAD ）。分别把 GBD 和 GAD 构建到两个不同的载体上，并能表达 相应的两个融合蛋白（GBD-X 和 GAD-Y）。 • 自激活作用检测： GBD-X和GAD GAD-Y和GBD 阴性对照 GBD 和 GAD GBD-IL2和GAD-IL2R（例如） 阳性对照
1. 随机缺失，制备一系列缺失体。 2. 对已知的 domain 或 motif 进行缺失。 3. 对磷酸化位点进行点突变，检测这些磷 酸化位点是否参与调节蛋白质的结合作 用。
Figure 1. The Cys→Ser mutation of HPO destroying its enzyme activity disturbed neither HPO dimerization nor HPO-JAB1 interaction in vivo. C) The indication of yeast cells containing vectors in each pie slice of the culture plate. D) Growth of transformants coexpressing HPO and JAB1 on selective leu–/trp–medium. E) Growth of transfected yeast cells on leu–/trp–/his– medium.
UASs, upstream activating sequences AD, activating domain BD, binding domain
• AD/library: A fusion of the GAL4 AD with a library cDNA/protein. • DNA-BD/bait: A fusion of the GAL4 DNABD with a bait cDNA/protein.
细胞内源性蛋白的免疫共沉淀
• 生理条件下的蛋白相互作用 • 内源性蛋白含量低 • 条件温和
组织内蛋白的免疫共沉淀
• 组织提取，切碎，匀浆，提取组织蛋白 • co-IP assay
蛋白质细胞内定位实验
• 直观，可以看到两种有相互作用的蛋白质 在细胞内的分布以及共定位的部位 • 蛋白质细胞内定位结果较为直观地反应蛋 白在细胞内的活动状态
应用
一、筛选相互作用的蛋白 可用于对 cDNA 文库的筛选。把你要研 究的蛋白亚克隆到 GBD 载体上，作为 “诱饵”蛋白。把文库蛋白基因亚克隆 到 GAD 载体上。 假阳性: 人为转染重组体 artificial 验证实验:进一步验证实验证明其在生理 情况下是否真的有作用。
Leabharlann Baidu
二.确定参与结合作用的 domain 或 motif
Yeast Phenotypes
• Ade–, His–, Leu–, or Trp– Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients. • Ade+ Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to grow. • His+ Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow. • LacZ+ Expresses the lacZ reporter gene; i.e., is positive for β-galactosidase activity. • Mel1+ Expresses the MEL1 reporter gene; i.e., is positive for α-galactosidase activity.
• 蛋白质定位及共定位研究必不可少。 • 因为相互作用的蛋白在功能上相互关联。 通过蛋白共定位研究，能够确定两种蛋白 在细胞内生理条件下相互作用的区域。
有色荧光蛋白标记技术
• • • • • 也可称为活细胞定位 分别克隆X，Y至荧光蛋白载体中 共转染 表达GFP/RFP，绿/红色荧光蛋白融合蛋白 confocal microscopy 共聚焦显微镜法 • 也可同时进行核染色
30 kD
15 kD
Blot: rHPO GST-JAB1 GST Coomasssie blue stain
GST/HIS 融合蛋白与体外 TNT 系统合成 的多肽或蛋白的相互作用
• 体外TNT系统合成Y，且可在Y上加上标签
• anti-Y antibody 或 标签抗体检测
• X-Y结合力弱时,S32标记 Y,放射自显影
Pull Down Assay
• 细胞外蛋白质相互作用 • 比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物 理的相互作用
• GST-pull down assay • HIS-pull down assay
原理 • 将目的蛋白基因克隆到带有GST或HIS 基因的原核表达载体中，进行原核表 达，得到GST-X或HIS-X融合蛋白。 • 把GST-X挂到Sepharose beads上, 如是 HIS-X 则挂到Ni-chelated agarose上。
GST/HIS融合蛋白与细胞内源性蛋白质的 相互作用
• 细胞提取物中的内源性蛋白（提取细胞总 蛋白与GST/HIS-X融合蛋白孵育） • S32标记
GST融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质 的相互作用
• 构建 Y 的真核表达载体，转染细胞，瞬时 表达（过表达）。
待测蛋白的磷酸化状态可能产生影响
• GST/HIS-X 融合蛋白与待测蛋白的相互作 用有可能与待测蛋白的磷酸化状态有关。
Figure 2. JAB1 binds to rHPO expressed in E.coli in vitro: rHPO were applied to columns of glutathione beads bearing GST or GSTJAB1.The bound rHPO was eluted together with GST-JAB1, was separated by SDS-PAGE, transferred to PVDF, and detected by anti-HPO antibody. The GST and GST-JAB1 were visualized by Coomasssie blue staining.
• 然后把 GBD-X 和 GAD-Y 两种载体共转染 到带有报告基因的酵母细胞中。当 GBD-X 融合蛋白中 X 蛋白与 GAD-Y 融合蛋白中 Y 蛋白发生相互作用时（或结合在一起 时），就使得原本分开的 GBD 和 GAD 蛋 白靠近并具有完整的 GAL4 蛋白的功能， 从而能够激活报告基因的表达。