试验一酶蛋白的定量测定及纯度检测
酶的纯度检测方法
酶的纯度检测方法一、SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析技术，可用于检测酶的纯度和分子量。
其原理是将蛋白样品在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，利用SDS对蛋白质进行线性变性，使其保持负电荷，根据蛋白质的分子量和电荷，使其在凝胶中以不同速度移动，最终形成不同大小的条带，根据条带的位置可以确定目标蛋白的分子量和纯度。
在实验操作中，首先将待检测的酶样品与SDS-PAGE样品缓冲液混合，然后将混合溶液加热至95℃，使蛋白质变性，接着将样品加载到SDS-PAGE凝胶槽中，开启电源进行电泳分离，最后用染色剂染色并观察结果。
通过比较目标蛋白与其他蛋白的条带位置和强度，可以确定酶的纯度。
二、凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种分子大小排除原理的层析技术，适用于检测酶的分子量和纯度。
其原理是在凝胶柱中，根据蛋白质的大小进行分级排除，较大的蛋白质会快速通过凝胶柱底部，较小的蛋白质会在凝胶柱中受到阻滞，从而实现蛋白质的分离和检测。
在实验操作中，首先将待检测的酶样品加入到凝胶柱中，然后进行层析分离，最后收集各个分离后的蛋白样品，通过比较目标蛋白的峰形和大小与其他蛋白的区分度，确定目标酶的分子量和纯度。
三、亲和层析亲和层析是利用目标蛋白与配体之间的特异亲和性进行分离和检测的一种技术。
在亲和层析中，通常通过牢固地固定配体在固定基质上，然后将目标蛋白与配体结合，再通过洗涤和洗脱等步骤，最终实现目标蛋白的纯化和检测。
在实验操作中，首先在含有配体的固定基质中将待检测的酶样品加入，然后进行洗涤和洗脱过程，最终收集得到目标酶。
通过比较目标酶的产率和纯度与其他蛋白的区分度，可以确定酶的纯度。
四、离子交换层析离子交换层析是利用蛋白质在不同离子强度和pH值下的电荷性质进行分离和检测的技术。
在离子交换层析中，通常通过固定阴离子或阳离子交换基质，再根据待检测的酶的电荷性质，通过调节离子强度和pH值，实现酶的分离和检测。
在实验操作中，首先将待检测的酶样品加入到含有离子交换基质的柱中，然后通过逐步改变离子强度和pH值，逐步洗脱目标酶，并通过收集得到的分离蛋白检测目标酶的产率和纯度。
抗体纯度鉴定的常用方法
抗体纯度鉴定的常用方法抗体纯度鉴定是指确定抗体制备物中所含目标抗原特异性抗体的纯度和杂质的程度。
合理的抗体纯度鉴定方法可以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将介绍抗体纯度鉴定的常用方法，包括蛋白电泳分析、Western blot、ELISA、免疫沉淀和色谱技术等。
1.蛋白电泳分析蛋白电泳是一种常见的蛋白质分离和分析方法，可以用于鉴定抗体制备物中的纯度和杂质。
常用的蛋白电泳包括SDS-PAGE和非变性凝胶电泳。
SDS-PAGE可以将蛋白质按照大小分离，通过比较目标抗原特异性抗体与其他蛋白质之间的差异，可以初步判断抗体制备物中的纯度。
非变性凝胶电泳则可以用于鉴定抗体制备物中是否存在聚集物和降解产物等杂质。
2. Western blotWestern blot是一种常用的蛋白质检测和定量分析方法，可以用于鉴定抗体制备物中的目标抗原特异性抗体的纯度和特异性。
通过将抗体制备物与目标抗原进行免疫印迹分析，可以确定抗体制备物中是否存在非特异性结合和杂交抗体，从而评估其纯度和特异性。
3. ELISAELISA是一种常用的酶联免疫吸附测定方法，可以用于定量测定抗体制备物中特异性抗体的含量，并进一步评估其纯度。
ELISA的原理是利用抗体与其特异性抗原的结合来检测抗体制备物的纯度和含量，通过比较样品与标准曲线的光学密度值，可以确定抗体制备物的纯度和含量。
4.免疫沉淀免疫沉淀是利用抗体和抗原之间的特异性结合来沉淀目标蛋白质的方法，可以用于鉴定抗体制备物中的目标抗原特异性抗体的纯度和特异性。
免疫沉淀可以通过将抗体制备物与目标抗原一起进行沉淀，然后通过蛋白质分析方法，如Western blot或质谱分析，来确定抗体制备物中特异性抗体的纯度和特异性。
5.色谱技术色谱技术是一种常用的分离和纯化蛋白质的方法，可以用于鉴定抗体制备物中的纯度和杂质。
常用的色谱技术包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和层析和逆流层析等。
这些色谱技术可以通过分离、纯化和定量目标抗原特异性抗体，从而评估抗体制备物的纯度和杂质水平。
如何认识蛋白质类药物纯度检测
如何认识蛋白质类药物纯度检测？
1 从蛋白质制剂中检测出少量的污染蛋白质是 很困难的。因为污染蛋白质的量可能低于很多 测定方法的检测下限。制剂中往往含有大量的 辅料。
2 当用一种方法测定蛋白质纯度时，可能有两 种或更多的蛋白质表现出相似的行为。这种类 似的行为可能会导致本来是混合物的样品也被 认为是均一物质的错误结论。
HPLC法应根据不同的纯化工艺选择不同的方法。 一般尽量采用与SDS- PAGE法原理不同的反相柱或其 他离子交换柱进行分析，而不主张用分子筛分析。在 质量标准中要说明采用的是什么性质的分析柱。如有 些产品不适合用反相柱，要说明原因。
1.3 毛细管电泳
毛细管电泳的方法简便、快速，灵敏度和 分辨率高，但价格昂贵，重现性差，尚未作为 常规检定。
与产品相关的杂质包括：
突变物、错误裂解的产品、二硫化物异构体、 二聚体和多聚体；化学修饰的形态：脱去酰氨 基的或氧化的形态、其他降解产物等。
4.1宿主细胞蛋白含量
概念: 宿主细胞蛋白质一般简称宿主蛋白，是指生产过
程中来自宿主或培养基的残留肽等杂质。基因工程 药物中的宿主蛋白含量，可用 ELISA法(enzymelinked immunosorbent assay)测定。
3 只用一种方法作为纯度试验的标准是很不 可靠的，必须选择多种测定纯度的方法。
最好的纯度标准是建立多种分析方法，从 等电点、相对分子质量、疏水性等不同的角度 来证明了蛋白质样品的均一性。
4 纯度最终取决于所用方法的类型和分辨力， 低分辨率方法检测合格的样品改用高分辨力方 法时就有可能证明它是不纯的。
3.3等电点测定 可以表征药物的理化性质和纯度 均一的重组蛋白质只有一个等电点，有时因加工 修饰等影响可出现多个等电点，但应有一定的范 围。所以等电点测定是控制重组产品生产工艺稳 定性的重要指标。
生物制药技术使用中的监测方法与结果解读指南
生物制药技术使用中的监测方法与结果解读指南随着生物制药技术的不断发展，越来越多的生物药物被开发和应用于临床治疗中。
在生物制药的生产过程中，监测方法的选择和结果的解读至关重要，因为这直接关系到药物的质量和疗效。
本文将介绍一些常见的生物制药技术使用中的监测方法，并提供一些结果解读的指南。
一、细胞培养监测方法在生物药物制造过程中，细胞培养是关键环节之一，因为生物药物通常是使用细胞来产生的。
常见的细胞培养监测方法包括细胞密度测定、细胞活力测定和细胞产物测定。
1. 细胞密度测定：细胞密度是指单位体积内细胞的个数，通常使用显微镜计数法或细胞计数仪来测定。
细胞密度的变化可以提供有关细胞增殖和死亡情况的信息，利于调整培养条件。
2. 细胞活力测定：细胞活力是指细胞的活动状态和功能活跃程度，通常使用细胞染色法、酶活性测定或细胞内特定蛋白的表达来测定。
细胞活力的监测可以评估细胞的健康状况，以及细胞内代谢产物的表达和积累情况。
3. 细胞产物测定：细胞产物是指细胞培养过程中产生的目标蛋白或其他生物活性物质。
常用的测定方法包括酶活性测定、免疫学方法（如ELISA或Western blot）和质谱分析等。
细胞产物的测定有助于评估生产过程中产物的质量和纯度。
二、病原体检测方法生物制药过程中使用的细胞培养系统可能存在病原体污染风险，因此对病原体的监测非常重要。
常见的病原体检测方法包括核酸检测、免疫学检测和生物学检测。
1. 核酸检测：核酸检测是一种直接检测病原体核酸序列的方法，包括PCR、实时荧光PCR和基因芯片等。
核酸检测方法具有高度的敏感性和特异性，可以快速准确地检测到病原体的存在。
2. 免疫学检测：免疫学检测通过检测体液中的病原体特异性抗体或抗原来间接地检测病原体的存在。
常用的免疫学检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光分析和免疫印迹等。
3. 生物学检测：生物学检测主要包括细菌培养和病毒滴度测定等。
通过对样品进行培养或使用细胞系进行感染，可以检测到病原体的存在，并测定其数量。
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法（ELISA）1.定义 (3)2.原理 (3)2.1抗原抗体反应 (3)2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5)3.ELISA的类型 (5)3.1双抗体夹心法测抗原： (6)3.2双抗原夹心法测抗体 (6)3.3间接法测抗体 (6)3.4竞争法测抗体 (7)3.5竞争性测抗原 (7)3.6捕获包被法测抗体 (7)3.7ABS-ELISA法 (8)4.ELISA试剂的组成 (9)4.1固相载体： (9)4.2包被的方式 (9)4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。
(10)4.4包被的条件： (10)4.5洗涤液： (10)4.7酶的催化性； (11)4.8结合物的制备 (11)4.9结合物的保存 (12)4.10酶的底物 (12)4.11酶反应终止液 (12)4.12参考标准品 (13)4.13加样： (13)4.14保温 (13)4.15保温方式： (13)4.16室温温育的反应 (13)4.17洗涤 (14)4.18显色 (14)4.19比色 (14)4.20酶标比色仪 (15)4.21结果判定 (15)4.22定量测定 (16)4.23ELISA的操作要点 (16)1.定义酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。
2.原理采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。
2.1抗原抗体反应2.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab 的解离程度与K值有关。
实验一、血液标本提取DNA(蛋白酶K-酚抽提法)
实验一、血液标本提取DNA（蛋白酶K-酚抽提法）一、实验原理离心分离到外周血的白细胞层；用细胞裂解液溶解细胞膜、核膜，使组蛋白与DNA分离，再用酚、三氯甲烷/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀即可得到基因组DNA片段。
二、实验步骤：1、血液标本处理 1.0ml抗凝全血(ACD、EDTA抗凝均可)2000rpm离心10min（1.5mlEP管）。
轻轻去上清液（血浆），吸出淡黄色悬浮液（白细胞层）置于另一2.0mlEP管中。
（约50μl）2、细胞裂解加入10倍体积组织细胞裂解液，37℃1h，3、加入蛋白酶K消化加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml（约4μl），充分混匀，37℃震荡12-24h或37℃1h后，56℃水浴3h。
保温过程中不时摇动，混匀反应液。
液体逐渐变粘稠，表明已有DNA释放出来，操作应轻柔。
4、酚抽提：将上述溶液冷却至室温，加等体积的Tris饱和酚（pH8.0）溶液，温和缓慢颠倒离心管10min，混匀两相成乳液。
12000rpm 5分钟，两相分层。
用宽口径移液管小心吸出上层粘稠的水相，移至一新的2.0mlEP管中。
（小心一点，不要吸入蛋白层。
如交界处有白色沉淀，需重新抽提有机相，用酚重新抽提两次，合并水相）5、三氯甲烷/异戊醇抽提上清液加等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上层水相0.5ml入另一新的2.0mlEP管；6、DNA沉淀上清液中加0.2倍体积3.0mol/L 醋酸钠，再加2倍体积的4℃冰箱冷却后的无水乙醇，轻柔振摇，充分混匀；应可看到白色絮状物（DNA）。
12000rpm 5分钟，弃上清液；7、纯化：加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 离心5分钟，去上清夜，重复1次；（此过程不得振荡摇动）8、溶解：弃上清液后，自然干燥（挥发痕量乙醇）后，用30μl pH8.0TE完全溶解，保存在-20℃备用。
三、注意事项1、加样准确，操作轻柔；微量加样器绝对不能超过最大量程；2、加酚试剂时，不要接触到皮肤上，有腐蚀性；如不小心弄到，立即用清水冲洗；3、取上清液时，不可吸到下层溶液；4、加TE液后轻摇10min溶解DNA或-4˚C保存待用。
胰蛋白酶比活力测定的实验操作
胰蛋白酶比活力测定的实验操作胰蛋白酶（trypsin）是一种重要的消化酶，用于蛋白质的降解。
测定胰蛋白酶的比活力可以评估其酶活性及纯度。
下面是测定胰蛋白酶比活力的实验操作步骤。
实验所需材料：1.胰酶溶液2. Brain Heart Infusion (BHI)培养基3. 丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对(L-Tyr-L-Phe)4.0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液5.0.1M硫酸（H2SO4）溶液实验步骤：1.准备酶样品：取适量的胰酶溶液，可以是商业制备的纯胰蛋白酶或者胰腺提取物。
2. 酶样品稀释：将胰酶溶液与BHI培养基按照一定比例混合，使得最终浓度在0.5-1.2mg/mL之间。
3.加入底物：向每个试管中加入20μL的丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对底物。
4.孵育反应：将试管置于37℃恒温培养箱中，在设定的时间内进行酶催化反应。
5.终止反应：用加入2NNaOH溶液终止酶反应，使底物水解停止。
6.酶解产物的提取：将反应液离心，取上清液转移到新的离心管中。
实验测量方法：1. 分光光度计法：利用胰酶催化底物水解产生的对分光光度计可见吸收的产物进行测定。
用1cm光程的比色皿，将底物水解产物的吸光度读数记录下来。
2. pH差比色法：用pH差比色法测量胰酶反应液中产生的酪氨酸分解产物。
黄色小麦胚芽酪氨酸（Tyr）的醛缩反应，其产物具有红色或紫色，在526nm处吸收峰。
通过比较不同样品的吸收度可以得出胰酶比活力。
数据处理：1.分光光度计法：根据底物水解产物的吸光度，绘制标准吸光度-底物浓度曲线，利用该曲线确定底物浓度，进一步计算胰酶的比活力。
2.pH差比色法：计算样品吸收值，将其与标准吸光度曲线相对应的底物浓度进行比较，计算胰酶的比活力。
注意事项：1.操作要严格遵守无菌技术，以避免细菌或其他污染物对实验结果的干扰。
2.实验过程中可以选择不同的底物和测量方法，以适应实验目的和条件。
3.实验操作需谨慎，避免接触眼睛和口腔，注意个人安全。
蛋白质纯化后的评价标准
蛋白质纯化后的评价标准在评价样品纯度之前，首-先需要鉴定待测杂质的类型，如核酸、碳水化合物、脂质、无关蛋白质、同工酶类、失活蛋白质，进而确定在特定溶液条件中, 能够区分假定杂质和目标蛋白质的理化特性(化学分析或物理特征）。
而纯度则是指待测杂质含量低于某个特定水平。
需要注意的是，上述说明中并没有要求描述杂质的性质。
纯化过程可能已将某一杂质的浓度降低到检测下限以下，但色谱峰中还有残留。
毫无疑问，表观纯度取决于所选择的测定方法及其灵敏度。
由于大多数分离方法都能够有效地去除非蛋白质类杂质，因此本文将主要介绍蛋白质样品中蛋白质类杂质的检测方法。
目前有一些高灵敏度的方法可用于检测样品中的杂质。
其中每种方法测定分子的一种特定物理特性。
方法的选择依赖于以下标准:①可用于检测的蛋白质的量；②待测杂质的性质;③所需的检测精度;④所需的检测灵敏度;⑤可能干扰到该方法的蛋白质及其溶剂特性。
蕞为简单和常用的方法是，经一次或多次分离后证实只有一种组分可被检测到。
若纯度标准为只可以存在一种可检测物质，则需用多种分离手段检测杂质。
当所选择的某种检测方法无法从主要分析物中分辨出一种未知杂质时，推荐使用正交的方法(orthogonal)。
蕞后，谨慎处理样品非常重要，这样可以防止在制备分析所用的样品过程中改变其杂质谱。
并且，洁净的环境、适宜的温度及适当材质的容器都会为分析提供帮助。
一、蛋白质的组成和活性分析一些方法能够量化氨基酸、特定辅基团或活性位点的摩尔数，可以用来评价蛋白质样品的纯度。
如果已知纯蛋白质的活性，那么单位活性测量可以用来检测相对纯度。
这些方法是间接的，因为总要将分析物假设为不含杂质的纯品，并将该假设纯品的量作为参照。
这些方法主要适用于纯化过程早期的多相系统，或适用于需要特殊环境来保持活性的分子(如膜蛋白）。
一般需要检测两项: 第1项是分析所用样品中蛋白质(或原料）的总量; 第二项是定量已知的活性对象或其他特殊的分析对象。
蛋白质测定方法
蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法(microKjeldahlmethod) 生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。
生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。
凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.实验原理生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。
生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。
凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。
其原理如下：1.消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。
为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。
这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。
2.加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH,加热后生成NH3,通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。
3.滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。
此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。
HCl＋NaOHNaCl+H2O本法适用于0.2~2.0mg的氮量测定。
1.热源2.烧瓶3.玻璃管4.橡皮管5．玻璃杯6.棒状玻塞7.反应室8.反应室外壳9.夹子10.反应室中插管11.冷凝管12.锥形瓶13.石棉网微量凯氏蒸馏装置示意图试剂和器材一、试剂浓硫酸；30％过氧化氢溶液；10M氢氧化钠；0.01M的标准盐酸；标准硫酸铵（0.3mg氮/mL）催化剂：硫酸铜：硫酸钾＝1：4混合，研细。
指示剂：0.1％甲基红乙醇溶液。
二、测试样品牛血清白蛋白。
蛋白酶活性的测定方法
结果分析
酶活性计算
根据实验数据，计算蛋白酶的活性，包括比活力和米氏常数等参 数。
显著性检验
通过t检验、方差分析等方法，对实验组和对照组之间的差异进行 显著性检验，确定实验结果是否具有统计学意义。
可重复性评估
评估实验结果的重复性，判断实验方法的可靠性和稳定性。
误差分析
误差来源
分析实验过程中可能存在的误差来源，如试剂不纯、 操作误差、仪器误差等。
电化学法
总结词
电化学法是一种快速、简便的蛋白酶活性测定方法，通过电化学信号的变化来检 测酶的活性。
详细描述
电化学法利用电化学探针或电极检测酶反应过程中产生的电化学信号，如电流、 电位等，通过分析这些信号的变化可以计算酶的活性。该方法具有快速、简便和 实时监测等优点。
核磁共振法
总结词
核磁共振法是一种高分辨率、高灵敏度的蛋白酶活性测定方法，通过检测核自旋磁矩的变化来计算酶的活性。
酶液的保存
选择适当的保存条件，如温度、pH值和添加稳定 剂等，以确保酶液的活性。
反应条件优化
温度对酶活性的影响
通过在不同温度下测定酶活性，找到最适温度范围，确保酶活性 的最大化。
pH对酶活性的影响
在不同pH条件下测定酶活性，找到最适pH值，确保酶活性的最大 化。
底物浓度对酶活性的影响
通过改变底物浓度，观察酶活性的变化，找到最佳底物浓度。
在测定过程中，可能存 在异常值、缺失值或重 复数据，需要进行数据 清洗，确保数据准确性 和可靠性。
图表绘制
通过绘制图表，如柱状 图、折线图或散点图， 可以直观地展示蛋白酶 活性随时间、温度、pH 等参数的变化趋势。
数据转换
根据需要，对数据进行 适当的数学转换，如对 数转换或归一化处理， 以便更好地分析数据。
蛋白质的定量测定实验报告
蛋白质的定量测定实验报告实验目的：本实验旨在学习如何通过定量分析方法来测定蛋白质的含量，并了解其原理与步骤，掌握实验技能。
实验原理：本实验采用了伯威尔法来测定蛋白质的含量，其原理是使用布莱德福试剂与蛋白质反应，得到紫色化合物，再通过光度计量测光密度，最后根据光密度与标准曲线得出蛋白质含量。
实验步骤：1. 制备标准蛋白质溶液：取不同浓度的酪蛋白标准品称取相应的质量，加入去离子水中定容制成相应浓度的标准蛋白质溶液。
2. 取待测样品加入少许的生理盐水加以均匀悬浮后，以PBS （Phosphate Buffer Saline）定容到一定的浓度。
3. 取10ml的试管，依次加入不同浓度的标准蛋白质溶液分别制成标准曲线，其中最高的浓度为2mg/ml。
4. 在本次实验中样品大部分成分已知，加入生理盐水的原因是为了将待测浓度控制在标准曲线范围内，以保证准确度，同样的超出标准曲线的部分需要稀释。
5. 向标准曲线上各试管加入1ml的布莱德福试剂，摇晃后静置5分钟。
6. 在550nm波长下使用光度计测光密度。
7. 记录测得的各标准点吸光值，并作图得到标准曲线。
8. 根据待测样品的吸光值和标准曲线，计算出样品中的蛋白质浓度。
实验结果：根据标准曲线，以及不同待测样品的吸光值，我们成功计算并得出各样品中蛋白质的浓度如下：样品编号蛋白质浓度(mg/ml)1 0.82 1.23 0.54 0.65 0.9实验结论：通过以上实验步骤，我们成功运用伯威尔法测定出了待测样品中蛋白质的含量。
实验结果表明，实验仪器操作规范，数据准确可靠。
蛋白质是生命体中重要的物质，其定量测定对于生物化学研究至关重要。
此次实验，我们不仅掌握了具体测定方法，而且也深化了我们对蛋白质含量分析的理解和认识。
酶的分离纯化
酶的分离纯化摘要：本文概述了在实验中由于酶浓度、饱和度等不同条件下对酶进行分离纯化的适用方法。
酶的分离纯化有很多种方法，在纯化的工艺上有很大的不同，不同来源的酶在分离纯化中表现出不同的洗脱特性。
现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。
关键词：酶；分离；纯化；方法前言：酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
酶的纯化过程在目前来说仍是一门实验科学。
一个特定酶的提纯往往需要经过多个实验的探索才能总结出一般经验规律。
酶的分离纯化又与其他蛋白质的纯化过程存在很大的差异，酶的分离纯化有其自己独有的特点：一是特定酶在细胞中的含量少，二是酶通过测定活力的方法可以加以跟踪，前者给实验带来困难，后者为实验提供了捷径。
正文：1. 酶的分离与纯化的概念[1]酶的分离与纯化是指将酶从细胞或其他含酶材料中提取出来，再与杂质分开，从而获得符合使用目的、有一定纯度和浓度的酶制剂的过程。
酶分离纯化的一般原则：①防止酶变性失活1．）酶纯化一般在低温条件下进行（0~4℃）2.）各种溶液应该用缓冲液，PH应调到使酶最稳定的PH3.）各种溶液中还可以加入酶保护剂②建立一个可靠和快速的测活方法方法专一、灵敏、精确、简便、经济③酶原料的选取选择目的酶含量丰富的原料，且要考虑取材方便、经济节约等因素2. 酶的分离纯化 2.1 细胞破碎[2]各种生物组织的细胞具有不同的特点，在采用破碎方法时，要根据细胞的性质，酶的性质来选取合适的破碎方法。
1.）机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
研磨法：用研钵直接研磨。
常用于微生物的微生物材料的破碎。
匀浆法：利用高压匀浆泵、玻璃或Teflon加研棒匀浆器高速球磨机将细胞破碎。
蛋白酶活力测定
3
在实际应用中，蛋白酶活力测定具有广泛的应用 价值，如食品工业中蛋白质水解、洗涤剂生产中 的酶催化反应等。
研究展望
随着生物技术的不断发展，蛋白酶活力测定技术也在不断改进和完善。未来，可以通过开发 新型的蛋白酶活力测定方法，提高测定灵敏度和特异性，进一步拓展其应用范围。
在研究蛋白酶的底物特异性、抑制剂作用机制等方面，可以结合计算机模拟技术、光谱学技 术等手段，深入探究酶的催化机制和作用机理。
随着蛋白质组学和代谢组学研究的深入，蛋白酶活力测定在生物标志物发现、疾病诊断和治 疗等方面的应用将更加广泛。同时，随着人类对生物大分子结构和功能的认识不断深入，蛋 白酶活力测定在药物设计和发现等领域也将发挥更加重要的作用。
THANKS
感谢观看
数据记录与处理
06 详细记录实验数据，并进行必
要的计算和处理，以得出实验 结论。
实验操作技巧
温度控制
确保酶反应在恒温条件下进行，以减 少温度对酶活力的影响。
02
pH调节
使用适当的缓冲液调节反应液的pH值， 以保证酶活力的稳定。
01
03
避免污染
在整个实验过程中，要严格控制实验 环境，避免样品和试剂受到污染。
对照实验
进行对照实验时，要确保对照组与实 验组条件一致，以消除误差对实验结 果的影响。
05
04
精确测量
在实验过程中，要使用精确的测量工 具和方法，确保实验数据的准确性。
05
结果分析与解读
结果分析
酶活力单位
通过实验数据，计算出蛋白酶的酶活力单位， 以评估酶的催化活性。
酶促反应速率
分析酶促反应速率，了解酶促反应的进程和 快慢。
底物浓度与酶活力的关系
蛋白质纯度测定
沉降速度法，能够简单并且快速非破坏性的来测定蛋白质的纯度，同时对分子质量和分子大小的比值非常灵敏。该方法的优点在于，测定范围非常的广；但局限在于，对相对分子质量相差小的样品做测定时，灵敏度低于电泳技术。
4、质谱法
质谱法可以直接测定一个样品中共价质量的分布，此方法能够方便简便、灵敏的测定杂质。质谱法不仅可以检测杂质的存在，还可以描述杂质的质量特征，因此质谱法常被用于鉴定杂质的来源。通过串联质谱法（MS/MS），可以鉴定共价改性修饰特征和位点。由于杂质可能与主要目标物有相似的质荷比，将质谱法与其他方法(如凝胶分离色谱)联用，可以增加样品纯度测定的准确性，达到最佳的效果。
1、电泳法
电泳法最简单、成本最低，并且在确定样品中蛋白质组分数目方面灵敏度最高，因此最为常见。通常被用于蛋白质纯度鉴定的第一步筛选，甚至应用于初期高异质性的样品鉴定。如果预期杂质与目标蛋白的分子量有差距，SDS凝胶电泳可以分辨出杂质。对于分子量相近但氨基酸组成不同的分子，SDS凝胶电泳一般分不开，但在非变性凝胶电泳中可以根据其不同的电泳迁移率进行鉴定。
5、光散射法
目前一些仪器能够通过静态或动态光散射来测定单个样品，或者监测高效液相色谱和场级分离过程。通过对分子大小和表观分子质量的连续测定，增强鉴定洗脱蛋白质的能力，以区分待分析物、待分析物的多聚体或杂质。光散射法非常简单且无破坏性，同时能够提供洗脱时间函数的分子质量图。如果紫外检测峰不对称，通过多角度光散射（multiple angle light scattering，MALS）分析，有可能表现峰的主要部分表观分子量为mol/L，而边缘为2mol/L，说明可能存在二聚体。但出现倍数分子质量不一定能证明一定存在自身结合，还需要采用不同的方法验证此结果。
胰蛋白酶的纯化实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握胰蛋白酶的纯化方法。
2. 了解胰蛋白酶的理化性质和生物学功能。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理胰蛋白酶是一种广泛存在于胰腺中的丝氨酸蛋白酶，具有水解蛋白质的能力。
本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，该方法具有操作简便、成本低廉、纯度较高等优点。
三、实验材料1. 胰蛋白酶粗品：由动物胰腺提取。
2. 硫酸铵：分析纯。
3. 氯化钠：分析纯。
4. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）：0.1 mol/L。
5. 其他试剂：三氯乙酸、硫酸、氢氧化钠等。
四、实验方法1. 胰蛋白酶粗品预处理：将胰蛋白酶粗品溶解于磷酸盐缓冲液（pH 7.0），搅拌使其充分溶解。
2. 盐析：向胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵，使其饱和，充分搅拌，室温静置过夜。
3. 沉淀收集：用布氏漏斗抽滤，收集沉淀，并用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤沉淀。
4. 脱盐：将沉淀溶于适量的水，加入适量的三氯乙酸，使蛋白质变性，去除杂质。
5. 纯化：将变性后的蛋白质溶液透析，去除三氯乙酸和硫酸铵。
6. 蛋白质复性：将透析后的蛋白质溶液加入适量的磷酸盐缓冲液（pH7.0），使蛋白质复性。
7. 检测：采用SDS-PAGE方法检测纯化后的胰蛋白酶。
五、实验结果与分析1. 盐析：在胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵后，溶液出现白色沉淀，说明胰蛋白酶已经盐析。
2. 沉淀收集：通过抽滤，收集到白色沉淀，表明胰蛋白酶已经沉淀。
3. 脱盐：加入三氯乙酸后，沉淀溶解，表明蛋白质已经变性。
4. 纯化：透析后的蛋白质溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，只有一个明显的条带，说明胰蛋白酶已经纯化。
5. 蛋白质复性：复性后的胰蛋白酶溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，蛋白条带清晰，说明蛋白质已经复性。
六、实验结论本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，成功地将胰蛋白酶从粗品中分离出来，并通过SDS-PAGE电泳检测，证明纯化后的胰蛋白酶具有较高的纯度。
蛋白浓度纯度计算公式
蛋白浓度纯度计算公式在生物化学和分子生物学领域，蛋白质是研究的重要对象之一。
蛋白质的浓度和纯度是影响实验结果的重要因素，因此准确地计算蛋白质的浓度和纯度是非常重要的。
本文将介绍蛋白浓度纯度计算公式及其应用。
一、蛋白浓度计算公式。
蛋白质的浓度通常是以毫克/毫升（mg/mL）或者克/升（g/L）为单位。
蛋白质的浓度可以通过比色法或者BCA蛋白定量试剂盒进行测定。
在进行测定时，需要用标准曲线法来计算蛋白质的浓度。
标准曲线法是通过测定不同浓度的标准蛋白溶液的吸光度，然后利用吸光度与浓度之间的线性关系来计算待测样品的蛋白质浓度。
蛋白质的浓度计算公式如下：蛋白质浓度 (mg/mL) = (A A0) / (ε d)。
其中，A为待测样品的吸光度值，A0为空白对照的吸光度值，ε为蛋白质的摩尔吸光系数（通常为1.1），d为光程（通常为1厘米）。
二、蛋白纯度计算公式。
蛋白质的纯度是指蛋白质样品中所含目标蛋白的百分比。
蛋白质的纯度可以通过SDS-PAGE凝胶电泳或者Western blot进行检测。
在进行检测时，需要用目标蛋白的强度与总蛋白的强度之比来计算蛋白质的纯度。
蛋白质的纯度计算公式如下：蛋白质纯度 (%) = (目标蛋白的强度 / 总蛋白的强度) 100%。
其中，目标蛋白的强度是指目标蛋白在凝胶电泳或者Western blot中的强度，总蛋白的强度是指所有蛋白在凝胶电泳或者Western blot中的总强度。
三、蛋白浓度纯度计算的应用。
蛋白质的浓度和纯度是影响实验结果的重要因素。
在进行酶活性测定、蛋白质结构分析、蛋白质相互作用等实验时，需要准确地计算蛋白质的浓度和纯度。
只有获得准确的蛋白质浓度和纯度数据，才能保证实验结果的准确性和可靠性。
在药物研发领域，蛋白质的浓度和纯度也是非常重要的。
药物研发过程中需要大量的蛋白质样品进行药效和毒性的研究，因此需要对蛋白质的浓度和纯度进行严格的控制和检测。
此外，蛋白质的浓度和纯度也是蛋白质结晶和结构解析的重要参数。
ELISA原理
ELISA 原理－－操作规则（新手适用）一．实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques ）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA 过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）, 生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比。
二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin ）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml 含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5 ）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl ）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在 3.0 左右，最高可达 3.4 。
用于ELISA 检测的HRP的RZ值要求在 3.0 以上。
ELISA 的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度) 0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
体外诊断试剂原料鉴定基础技能
（一）仪器和试剂
仪器：酶标仪，96孔板，微量移液器，洗板机。
试剂：
1.包被液（CBS）：碳酸盐缓冲液
pH9.6（Na2CO3 1.59g/L NaHCO3 2.93g/L ）
2.封闭液&抗体稀释液、：含0.1%酪蛋白的PBS溶液
3.底物缓冲液：醋酸钠-柠檬酸缓冲液
酶标显色液2
p H 3 . 6 （ N a A c . 3 H 2 O 1 . 1 3 g / L C 6 H 8 O 7 H 2 O 1 . 0 5 g物/料L名）称
2.纯度检测：SDS凝胶电泳
1 实验所需试剂、材料和仪器 10孔预制胶、电泳缓冲液，待测抗体、蛋白分子量标准、样品缓冲液（5*loading bμffer）、 染色液、电泳仪、电泳槽、水平摇床、照相机。 2 操作步骤 2.1样品处理 每10μL（含2ug蛋白量）抗体加入2.5μL 5x loading bμffer,震荡混匀,水浴加热10min,3000 转离心轻甩,取上清点样。 2.2 安装预制胶，点样 按照要求装好预制胶，将样品缓慢加入胶孔，上样量统一为2μg/孔。 2.3 恒压电泳 盖好电泳槽，正确安插电源正负极，打开电源仪的电源，初始电压为80V电泳5min后调至 120V，待溴酚蓝跑至胶的最下面，方可关闭电源。 2.4 染色 电泳完毕，将卸下来的胶放入染色液中，置于水平摇床上40rpm ，30min。 2.5脱色 倒出染色液，加入双蒸水至没过胶，置于水平摇床上40rpm，至胶上条带清晰，背景透明。 2.6 照胶 将蛋白胶平放在白色背景板上，进行拍照保存。 3 结果分析 处理胶图，根据蛋白分子量标准确定蛋白分子量，目测评估蛋白纯度和分子量。
3.加工作液： 将A液与B液按照A:B=50:1的比例混合摇匀配成工作液，临用前现配。每孔加入200ul工作液，吹匀。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
§2. SDS-凝胶电泳检测木瓜 凝乳蛋白酶的纯度
❖一、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶：是由丙烯酰胺和交联剂甲叉 丙烯酰胺在催化剂作用下，聚合而成的凝胶， 凝胶具有网状立体结构和具有分子筛效应， 因此可用此凝胶为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有2种形式：
第一种，非变性聚丙烯酰胺凝胶：蛋白质在电 泳中保持完整的状态，在电泳过程中影响蛋 白迁移速率的因子包括：蛋白大小、蛋白形 状和蛋白所带电荷。
二、试剂与材料 1、10%过硫酸铵溶液 （新鲜配制） 2、 TEMED（四甲基乙二胺）（避光保存） 3、分离胶缓冲液：1.5M Tris-HCl,pH8.8 4、浓缩胶缓冲液：0.5M Tris-HCl, pH6.8 5、染色液：0.05%考马斯亮蓝甲醇溶液 6、脱色液：7%冰醋酸 7、蛋白标准、木瓜凝乳蛋白酶样品 8、材料：电泳仪电源、 垂直电泳槽
实验目的 ❖ 1、掌握考马斯亮蓝法测定酶蛋白含量的原理
和方法 ❖ 2、掌握SDS-凝胶电泳检测酶蛋白纯度的原
理和方法
§1 木瓜凝乳蛋白酶含量测定
一、实验原理 考马斯亮蓝法：根据蛋白质与染料特异性结 合原理设计的。考马斯亮蓝G-250 （Coomassie brilliant blue G-250）在游离 状态下呈红色，最大光吸收在488nm处；当 它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为蓝色， 这个结合主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 （特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结 合。
❖ 第二种，变性聚丙烯酰胺凝胶：在非变性 凝胶电泳中加入SDS和巯基乙醇变性剂， SDS能破坏蛋白质分子之间的非共价键， 在巯基乙醇或二硫苏糖醇的作用下，蛋白 质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。
❖ 蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS复合物，该复合物具有3个特点:
❖ A.所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷 量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差 异；
❖ B.在溶液中的形状像一个长椭圆棒，消除了蛋白质 间分子形状的差异。
❖ C.不同蛋白质所形成的椭圆棒的短轴是相同的（约 18μm），但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小 成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电 泳迁移率主要取决于蛋白质分子量的大小。
❖ 当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移 率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDSPAGE可以分离、鉴定蛋白质，也可检测其纯度。
其结合物在595nm左右波长下有最大光吸收, 而且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此 可用于蛋白质的定量测定。该结合反应在 2min左右的时间内达到平衡，且在室温下 1h内保持稳定。
该法具有操作简便、反应灵敏、稳定性强的 优点。
适用测定蛋白质浓度的范围为0～1 000μg／ mL。
❖ 二、实验材料 ❖ 1.考马斯亮蓝G-250 ❖ 2.标准蛋白液：0.5mg/mL牛血清白蛋白 ❖ 3.NaCl溶液 ❖ 4.木瓜凝乳蛋白酶纯化酶 ❖ 5.分光光度计
（µg/mL）0
上述溶液摇匀，室温反应2分钟，在595nm处测定吸光度， 以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线； 并同时测定木瓜凝乳蛋白酶的吸光度，在标准曲线上求出 木瓜凝乳蛋白酶的含量。
v 四、实验结果
v 1、做出标准曲线并求出其相关系数
v 2、求出木瓜凝乳蛋白酶含量 （µg/mL ）
要求 1、蛋白含量测定：2人/组 2、SDS-凝胶电泳：每人做一块胶，2人/套电泳槽 3、实验完毕，所有器皿必须清洗后收到实验柜中
值日：第1-3组
四配、制电实泳验凝方胶（法包括分离胶和浓缩胶）
上样（上样量为10 µl ,注意不留空槽） 电泳（浓缩胶150V电压，分离胶180V） 电泳胶处理（染色、脱色、拍照保存）
分光光度计PC3100使用注意事项： 测蛋白含量用“含量测定”模式
注意事项： 1、制胶时操作戴PE手套 2、玻璃板必须擦干净再做胶
三、实验方法
试管
CK 1
2
3
4
5
6 样品 样品 ……
BSA（µl）
50 100 200 300 400 500
0.5mMNaCl(µl)
450 400 300 200 100 0
0.15 mMNaCl(µl) 500
样品（µl）
500 500
考马斯亮蓝（mL） 5
5
5
5
SA 稀释后浓度