土壤中细菌总数的测定(精)
细菌总数的测定实验报告
细菌总数的测定实验报告细菌总数的测定实验报告引言：细菌是一类微小的单细胞生物，广泛存在于自然界的各个角落中。
它们在环境中的分布和数量对人类的生活和健康有着重要的影响。
因此，准确测定细菌总数对于环境监测、食品安全等领域具有重要意义。
本实验旨在通过一系列方法，测定细菌总数，并探讨其应用前景。
材料与方法：1. 样品准备：从不同环境中采集样品，如水源、土壤、食品等。
2. 细菌培养基制备：根据不同的需求，选择适宜的培养基，如营养琼脂、大肠杆菌培养基等。
3. 细菌培养：将样品分别接种到不同的培养基上，通过恒温培养，促使细菌生长繁殖。
4. 细菌计数：采用平板计数法，将培养好的细菌涂布于琼脂平板上，以形成菌落。
通过计数菌落的数量，间接测定细菌总数。
结果与讨论：通过实验，我们成功测定了不同样品中的细菌总数。
结果显示，不同环境中的细菌总数存在显著差异。
例如，水源中的细菌总数相对较低，而土壤中的细菌总数较高。
这与细菌在不同环境中的适应能力有关。
水源中的细菌数量较少，可能是由于水中的氧气含量较低，限制了细菌的生长。
而土壤中的细菌数量较多，可能是由于土壤中丰富的有机物质提供了充足的营养。
此外，我们还发现食品样品中的细菌总数也较高。
这一结果提醒我们在食品加工和储存过程中要加强卫生管理，以避免细菌污染对人体健康的威胁。
同时，对于食品行业来说，测定食品中的细菌总数也是保证产品质量和安全的重要手段之一。
细菌总数的测定方法中，平板计数法是最常用的方法之一。
它的优点在于简单易行、结果直观可靠。
然而，平板计数法也存在一定的局限性。
首先，这种方法只能测定可生长的细菌数量，无法测定处于休眠状态或无法在特定培养基上生长的细菌。
其次，平板计数法需要较长的培养时间，通常需要24小时以上。
因此，在紧急情况下，需要快速测定细菌总数时，平板计数法可能不适用。
结论：细菌总数的测定是一项重要的实验工作，它对于环境监测、食品安全等领域具有重要意义。
通过实验，我们成功测定了不同样品中的细菌总数，并发现了不同环境中的细菌总数存在显著差异。
【实验】测定土壤中微生物的数量
[三]微生物的培养与观察
不同菌落的鉴定指标：菌落的形状、大小、 隆起程度、颜色等。
（二）统计菌落数目
每克样品中的菌株数致 C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml) M：稀释倍数
为了测定微生物的数量，接种时应采用_稀__释__涂__布__平__板___ 法，某同学在4个培养基上分别接种稀释倍数为106的土 壤样液0.1 mL，培养后菌落数分别为180、155、176、 129个，则原土壤样液中上述微生物的含量为 __1_.6_×__1_0_9_个__/m__L_______，测定的活菌数比实际活菌数 ____低____(填“低”“高”“基本一致”)。
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌； （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
尿素分子的立体结构
（一）筛选菌株
美国微生物学科布鲁克1966 年发现耐热细菌，从水生耐 热细菌Taq得到耐高温的Taq DNA聚合酶。
一、研究思路
(一)筛选菌种
1 实例：耐高温的DNA聚合酶
PCR技术：要求使用耐高温（930C） 的DNA聚合酶。
稀释度（倍）
106
107
108
平板
1 2 3 12 3 1 2 3
平板菌落数（个） 432 421 445 78 67 74 9 6 8
涂布时应当在酒精灯火焰旁 附近操作，为了保证结果准确，应选 择上述稀释度为 107 倍的平板菌落数作为统计结果，原因是 计数平板的菌落数 ，计算出样品中每毫升乳酸菌数为7.3×。109 量范围为30~300
（1）样品稀释：先将样品稀释10倍，可用无菌移液管吸取25mL 酸奶样品加入盛有 225 mL无菌水的三角瓶中，使样品与水充分混 匀。然后进行系列稀释操作，得到稀释至106、107、108倍的样品。 （2）培养与统计：吸取不同稀释度的样品各1mL，分别置于不同
医学：实验土壤中细菌总数的测定-平板计数
本实验的应用前景
本实验所采用的平板计数法具有广泛的应用前景，可 用于研究不同环境条件下土壤中细菌总数的变化规律。
通过深入探究土壤中细菌总数与环境因素之间的关系， 可以为农业生产、土壤保护和土地资源可持续利用提 供科学依据。
实验误差分析
随机误差
由于随机因素引起的误差，如取样不均匀、计数 误差等。
系统误差
由于实验方法、仪器或操作不当引起的误差，如 培养基质量、培养条件等。
误差来源分析
分析误差的来源，提出相应的改进措施，以提高 实验的准确性和可靠性。
结果可靠性评价
重复性检验
通过重复实验，比较实验结果的一致性和稳定性。
可信度评估
03
CHAPTER
实验步骤
土壤样品的采集与处理
1
ห้องสมุดไป่ตู้
采集具有代表性的土壤样品，并记录采样点的环 境信息。
2
将采集的土壤样品进行筛选和研磨，去除其中的 石块和杂质。
3
将处理后的土壤样品进行称重，记录其质量。
土壤样品的稀释与接种
根据土壤样品的质量， 计算所需的稀释液量。
将稀释后的土壤样品 接种到培养基中，确 保均匀分布。
制备菌悬液
将处理后的土壤样品与无 菌水混合，制备成菌悬液。
稀释菌悬液
将菌悬液进行适当稀释， 使每个菌落来源于一个细 菌。
接种培养
将稀释后的菌悬液接种到 培养基上，放入恒温培养 箱中培养。
掌握平板计数法测定土壤中细菌总数的操作步骤
计数菌落
培养一定时间后，观察并计数培养基 上的菌落数。
结果计算
【实验】测定土壤中微生物的数量
实例：在做该实验时，A同学从对应的106倍稀释 的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同 学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分 析其原因。
原因：⑴土样不同；⑵培养基污染(混入了其他的 含氮物质)；（3）杂菌污染
设置对照
作用：排除任何其他非测试因素的干扰，证明确 实是所测试的条件引起相应的结果。
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农 作物吸收。
2、细菌为什么能够分解尿素？
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
脲酶 CO(NH2ห้องสมุดไป่ตู้ + H2O
NH3 + CO2
常见的分解尿素的微生物
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、 棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌 也能分解尿素。
土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg） 是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中： 好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌 数约为477万，霉菌数约为23.1万。
菌种鉴定——鉴别培养基
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 酚红指示剂。
大肠杆菌在伊 红美蓝琼脂 (EMB)上典型 特征
大肠杆菌呈黑色中心 ,有或无金属光泽
本课题知识小结:
课题2.2 土壤中分解尿素的细菌的
分离与计数
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
如何筛选出能够分解尿素的微生物呢？ 如何统计样品中分解尿素的细菌数目？
二.实验的具体操作
参考教材本节内容，小组讨论出具体的实 验方案
三.结果分析与评价
1. 同一稀释倍数的三个重复的菌落数相 差较大，怎么办？
土壤中细菌总数的测定实验
1 / 6实验四细菌总数的测定——纯种分离一、目的1.掌握从环境（土壤和活性污泥等）微生物群体中获得纯种微生物的分离和培养技术。
2.掌握无菌操作技术。
二、材料和器皿1.扭力天平、取土样工具、涂布棒(接种棒)。
2.无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。
3.无菌水。
4.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
三、实验操作步骤1、取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。
土样取回后应尽快投入实验，同时取10- 15g，称重后经105oC烘干8h，置于干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。
2、倒平板2 / 6熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。
3、编号取5支无菌空试管（15×150mm）依次编号为10- 3、10- 4、10- 5、10- 6、10-7。
4、分装无菌水按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的各无菌空试管中。
5.制备土壤稀释液称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。
用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次、摇匀，此即为10-3浓度。
同样方法，依次稀释到10-7。
稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。
环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
3 / 6代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。
6、培养及计数培养条件：倒置于36±1℃xx箱内培养48±2h 计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。
【实验】测定土壤中微生物的数量
（一）筛选菌株
美国微生物学科布鲁克1966 年发现耐热细菌，从水生耐 热细菌Taq得到耐高温的Taq DNA聚合酶。
一、研究思路
(一)筛选菌种
1 实例：耐高温的DNA聚合酶
PCR技术：要求使用耐高温（930C） 的DNA聚合酶。
Taq细菌
寻找
寻找
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
[一]土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样， 将样品装入事先准备好的信封中。
[二]样品的稀释
为什么分离不同的微生物要 采用不同的稀释度？测定土 壤中细菌的总量和测定土壤 中能分解尿素的细菌的数量， 选用的稀释范围相同吗？
这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的， 例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约 为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此， 为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离， 同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。
（二）设置对照
验证方案： 一、可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结 果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学 存在操作失误或培养基的配制有问题。 二、将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作 为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
实验结果要有说服力，必须设置对照实验。主要目的是排 除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的 可信度。
课题2土壤中分解尿素的来自细菌的分离与计数尿素是一种高浓度氮肥，属中性速效肥料，也可用于 生产多种复合肥料。在土壤中不残留任何有害物质， 长期施用没有不良影响。尿素经过土壤中细菌的脲酶 作用，分解成氨后，才能被作物吸收利用。因此，尿 素要在作物的需肥期前4～8天施用。
土壤细菌总数的测定
实验准备
每个平板需培养液20ml，每个稀释梯度（ 至10-7 ） 需要准备3个平行实验，计算所需材料的量。
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操作步骤
计数报告
计数报告
接种培养
接种培养
稀释
稀释
取样
取样
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制备土壤稀释液
充分振摇或研磨 25g或25ml 检样 1：10稀释液。 225mL无菌水 1ml 1ml 1ml
9ml稀释液 1：100
9ml稀释液 1：1000
9ml稀释液 1：10000
操作要求： “无菌操作”贯彻始终。
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土壤细菌总数测定
实验原理介绍
实验准备
实验流程
操作步骤
数据处理
丢弃处理
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土壤细菌总数测定法
1.原理：
用营养琼脂倾注平板，测定被检物在单位重量或体
积（g或ml）内所含有的活细菌数量，以判明被检物被
细菌污染的程度。
土壤细菌总数的测定
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背景介绍
土壤是微生物生活的良好环境
土壤中的生态环境条件——营养（有机质丰 富）、水分（有一定含量）、空气（含氧气）、 酸碱度（pH5.5-5.8，适宜）、渗透压（0.30.6MPa，等渗或低渗环境）、温度条件（较恒定） 和表面保护层。 故土壤是微生物的大本营，也是人类最丰富 的“菌种资源库”。
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土壤细菌总数测定流程
7. 培养 将涂布后的平板上倒置于恒温箱中，细菌在 37℃下培养24-48h,观察结果。
土壤微生物计数法
土壤微生物计数法土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。
土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。
1.1培养计数法1.1.1概要在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。
因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。
这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。
稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。
最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。
根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。
1.1.2稀释平板法一、试剂配制常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。
按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。
凝固后的培养基可加热溶解后使用。
二、仪器设备广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。
（1）土壤系列稀释液制备取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。
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三 液管10 支、 土壤样品、天平等。
四 操作步骤
无菌平皿编号→制备土壤稀释液→ 倾注 平板→ 培养(48h) → 计数
五 注意事项
倒平板时要注意控制培养基的温度。 稀释操作时，要尽量减少样品稀释误差，而且 每个稀释度的菌液应各用一支无菌吸管。 为使菌落能在平板上均匀分布，样品液加入平 皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀。
六 思考题
要测定某种液体饮料中的活细菌总数，除了采 用平板菌落计数法外，还可采用哪些方法？
实验三
一 教学要求
土壤中细菌总数的测定
通过土壤中细菌总数的测定 ， 了解微生物数量的 测定方法，掌握平板菌落计数的原理和方法 二 实验原理 1、测定微生物生长的方法 Direct methods Direct counting，Coulter counter Indirect methods Viable Cell methods，Membrane filtration ， turbidity methods，most probable number(MPN) ,Detect chemical products or metabolic activity Alternative methods for viable cell counts
2、The plate count (viable count)
The number of bacteria in a given sample is usually too great to be counted directly. However, if the sample is serially diluted and then plated out on an agar surface in such a manner that single isolated bacteria form visible isolated colonies, the number of colonies can be used as a measure of the number of viable (living) cells in that known dilution.
• Colony-Forming Units (CFUs) However, keep in mind that if the organism normally forms multiple cell arrangements, such as chains, the colony-forming unit may consist of a chain of bacteria rather than a single bacterium. In addition, some of the bacteria may be clumped together. Therefore, when doing the plate count technique, we generally say we are determining the number of Colony-Forming Units (CFUs) in that known dilution. By extrapolation, this number can in turn be used to calculate the number of CFUs in the original sample.
• calculate the number of CFUs in the original sample
number of CFUs per ml of sample = number of colonies (30-300 plate) X the dilution factor of the plate counted For a more accurate count it is advisable to plate each dilution in duplicate or triplicate and then find an average count.