冷泉港coip lysis 配方(免疫共沉淀裂解液)

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免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程

免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋⽩-蛋⽩间相互作⽤的经典⽅法，属于免疫沉淀技术的⼀类，常被⽤于鉴定特定蛋⽩复合物的中未知蛋⽩组分。

免疫共沉淀的设计理念是，假设⼀种已知蛋⽩是某个⼤的蛋⽩复合物的组成成员，那么利⽤这种蛋⽩的特异性抗体，就可能将整个蛋⽩复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进⽽可以⽤于鉴定这个蛋⽩复合物中的其他未知成员。

免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第⼀是天然状态，第⼆是蛋⽩复合物。

免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋⽩质相互作⽤技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相⽐，免疫共沉淀鉴定的相互作⽤蛋⽩是在细胞内与⽬的蛋⽩发⽣的天然结合，避免了⼈为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋⽩可信度更⾼。

免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建⽴在蛋⽩复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋⽩组分很可能检测不到；2. 由于蛋⽩质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使⽤某⼀种pull-down抗体，⽆论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到⼀半的⽬标蛋⽩复合物沉淀出来，如有必要最好使⽤多种不同抗体分别进⾏CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋⽩复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋⽩复合物成员也会越来越庞⼤；4. 如果使⽤Western Blot的⽅法检测的蛋⽩复合物中的⽬标蛋⽩，则需要在试验前进⾏预测，具有⼀定的冒险性；当然如果将蛋⽩复合物直接进⾏质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较⾼纯度和浓度的蛋⽩复合物样品也⾮易事，并且成本较⾼；5. CoIP鉴定得到的蛋⽩间相互作⽤可能是直接作⽤也可能是间接作⽤，进⼀步区分还需要进⾏GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使⽤复合物的不同成员分别独⽴进⾏CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使⽤复合物的任⼀成员进⾏CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的⼀般操作流程（中英⽂对照）：成⼲扰。

生物实验免疫共沉淀

完成《WB实战指南》后，朋友曾央分享点免疫共沉淀方面的咚咚；当时不得不回绝。

因为，WB指南是基于这些年的回复的汇总，基本上方方面面的问题都有提及，只需要做些串联；而论及coIP，目前在国内还不太普及，尽管它已经是生化领域最基本的技术之一。

因此，再想写这么个长篇颇耗时间，于我的时间和精力太为难；不过，今天是个特殊的日子，凑凑热闹吧。

——人，如果在某些方面成功了，必然在另外一面有亏欠，也许这就是上帝的公允吧。

——在自己最擅长的地方找点成功的感觉吧，当然我的失败也只是因为没有更多的时间。

哎！扯远了玩coIP也玩了5年多了，因为上手就是最难的B蛋白结合量多少的变化（假定IP A蛋白）而非检测B蛋白的有无，说句吹牛皮的话，在我们这个小领域三家最强的lab唯有我们敢于通篇基于这种检测手段，所以，对于coIP算是非常得有心得了。

以下论述基于最难的B蛋白结合水平变化的检测，所以部分实验操作非常苛求；学会这个，其他就是小菜了；所以，这也算一个进阶篇。

一.样品的制备。

如《WB指南》，在这里我最强调从制备样品开始的一致性。

如果不触及细胞的凋亡或死亡，那么任何处理组样品和ctrl最后的终体积应该保持一致；如果细胞有大量凋亡或死亡，可以通过比对标准体积对样品的体积粗略定量后再加裂解液，一般可以把误差控制在WB的检出范围以下，基本保持样品的均一；组织样品可以通过称重添加相应体积比的裂解液。

裂解液的配方可以采用《WB指南》里给出的，原配方如下：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors（0.5M PMSF)此裂解缓冲液裂解条件相对温和，适合后续的coIP分析。

“不过”用它做coIP有明显的缺陷；要理解此配方的缺陷，我们先聊聊如何在coIP实验中“作伪”。

伪造结果，也分为单纯性造假和技术型伪造。

免疫沉淀IP 免疫共沉淀coIP 染色体免疫沉淀ChIP

楼上说的准确的叫Co-IP。

IP就是免疫沉淀，没有“共”，哈哈。

其实楼主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗体，直接检测western,就可以了，为什么还要用IP以后的样品来检测，这是因为p-Pyk2商业化的抗体特异性不好，可能对p-FAK或其他类似的磷酸化蛋白有交叉，所以我们一般为了准确性，看其磷酸化的变化，就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来，在用4G10抗体来检测。

而且这个方法看的是Pyk2蛋白全部的磷酸化位点的情况，而p-Pyk2商业化抗体一般都是识别某一格Tyr磷酸化位点的，所以这两种试验是有本质区别的，这种方法还应用于很多Tyrosine kinase receptor磷酸化的检测，因为这些蛋白磷酸化位点都特别多哈：)免疫沉淀是指用抗体把抗原（包括单体、复合物）沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来研究蛋白质的相互作用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。

抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose 珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl 的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

整理）Co-IP免疫共沉淀样品制备

整理）Co-IP免疫共沉淀样品制备Co-IP免疫共沉淀样品制备一、所需试剂1、Pierce?交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒（货号88805 4℃保存）（1）Pierce 蛋白A/G 磁珠1 mL，贮存于含有0.05% NaN3的水中，浓度为10 mg/mL （2）Pierce 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液（pH 7.4）<1>0.025M Tris，0.15M NaCl：这个盐浓度可以保持大部分蛋白之间的相互作用<2>0.001M EDTA: 乙二胺四乙酸，螯合金属离子，抑制一些含巯基的酶<3>1% NP40：表面活性剂，可以温和裂解膜，拮抗非特异性的蛋白相互作用<4>5% 甘油: 其粘性可以保护蛋白质之间的相互作用起（3）20×交联缓冲液，25 mL, 稀释后含10 mM 磷酸钠，150 mM NaCl；pH 7.2（4）DSS（辛二酸二琥珀酰亚胺酯，具有胺反应性的同源双功能交联剂，具体见附/1），No-Weigh?形式，每包加217μDM SO溶解成10X储存液（4）中和液，1.0 mL，pH 8.5（5）洗脱液，25 mL，pH 2.0（如需自己配见附录2）（6）电泳上样缓冲液：非还原性，（5×）, 5 mL，pH 6.8，0.3M Tris·HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料（好像不含巯基乙醇，减少IP抗体的变性）2、Protease cocktail（货号：cw2200s）：蛋白酶抑制剂混合物，具体什么就不管了3、IP抗体和IB抗体（两者抗体种属最好不一样！理由见附录3），对照IgG抗体4、ddH2O二、具体步骤（冰上进行）第一天：<一>蛋白样品制备一般用超大皿来提蛋白，裂解蛋白只需10-15min，裂解蛋白离心期间可以进行第<二>和第<三>一部分<二>抗体—A/G蛋白磁珠结合1、1×改良的交联缓冲液制备：0.1 mL的20×交联缓冲液+0.1 mL 的免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液+1.8 mL超纯水2、向离心管中加入25 μL磁珠（使用前涡旋），将离心管置于磁力架上1分钟，收集磁珠。

冷泉港coiplysis配方（免疫共沉淀裂解液）

冷泉港coiplysis配方（免疫共沉淀裂解液）冷泉港coip lysis 配方150mM NaCl（M=58.44，100ml加0.877g）10mM HEPES，PH7.5（M=238.31 100ml加0.2383g）0.2%NP-40（100ml加200uL）5mM焦磷酸钠sodium pyrophosphate（M=265.9，100ml加0.133g）5mM氟化钠Sodium Fluoride（M=41.99，100ml加0.021g）2mM钒酸钠sodium vanadate（M=183.91，100ml加0.0368）10mg/L胰蛋白酶抑制剂Aprotinin（可略）10mg/L亮肽酶素leupeptin（可略）1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）（在裂解前加入）PBS：130mM NaC；20mM磷酸钠中文名：氯化钠外文名：Sodium Chloride 别名：食盐化学式：NaCl 相对分子质量：58.44 化学品类别：无机物--氯化物--钠盐管制类型：不管制储存：密封保存HEPES英文全称：4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid;N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid;2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazine]ethanesulfonic acid中文全称：4-羟乙基哌嗪乙磺酸; N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸分子式：C8H18N2O4S分子量：238.31用途：对细胞无毒性作用。

它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。

使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。

细胞培养常用10mmol/L。

10mmol/L HEPES缓冲液配制方法如下：准确称取HEPES 2.383g，加入新鲜三蒸水定容至1L。

裂解液配制方法

裂解液配制方法 The manuscript was revised on the evening of 20211、红细胞裂解液（去除红细胞）配制试剂所需材料：1. Ammonium Chloride x10 Lysing Concentrate Solutiona) NH4Cl (1.5 M) 80 gb) KHCO3 (100 nM) 10 gc) Na4EDTA (10 nM) 3.7 gd) Distilled H2O 1000 mL2. 1N HCl or 1N NaOH（调节pH值用）配制步骤：1. 将以上a、b、c试剂溶于900ml 去离子水中；2.调节溶液pH值到，加去离子水定容到1000ml；3.在制备工作液时，将此储存液稀释10倍后使用。

保存：储存液储存于2-8°C不能超过半年（六个月）；2.在使用前，工作液每天都应该新鲜配制放置于室温，当日用不完的弃掉。

2、ripa裂解液NP-40 or Triton-100 1%TrisHCl (pH 50mmol/LNaCl 150mmol/LPMSF（苯甲基磺酰氟） L(100μg/ml)Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 μmol/Lμg/ml)Leupeptin（亮抑制肽） mlAprotinin（抑蛋白酶肽）μmol/L(1μg/ml)（注：PMSF 贮存液：100mmol/L即ml于异丙醇中；Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于LHEPES；Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中；Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存）3、细胞裂解液（Tris－HCL）1．1M Tris 溶液的配置取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解。

2．1M Tris－HCL Ph=溶液的配置取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=（需浓盐酸约），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用。

冷泉港-ChIP各种试剂配方

CSH-ChIP-MaterialReagents.Agarose gel.Antibodies to native protein of interest (or a post-translationally modified form).Antibody (control)Cell lysis buffer for ChIP (cold)5 mM PIPES (pH 8.0)85 mM KCl0.5% Nonidet P-40 (NP-40)Store at 4°C.Cells (5x107-1x108 per experiment)Nuclei lysis buffer for ChIP50 mM Tris-Cl (pH 8.0)O. Adjust the pH to the desired value by To prepare a 1 M solution, dissolve 121.1 g of Tris base in 800 mL of H2adding concentrated HCl.7.4 70 mL7.6 60 mL8.0 42 mLAllow the solution to cool to room temperature before making final adjustments to the pH. Adjust the volume of the O. Dispense into aliquots and sterilize by autoclaving.solution to 1 L with H2If the 1 M solution has a yellow color, discard it and obtain Tris of better quality. The pH of Tris solutions is temperature-dependent and decreases ~0.03 pH units for each 1°C increase in temperature. For example, a 0.05 M solution has pH values of 9.5, 8.9, and 8.6 at 5°C, 25°C, and 37°C, respectively.10 mM EDTAEDTA (ethylenediamenetetraacetic acid) NaOHTo prepare EDTA at 0.5 M (pH 8.0): Add 186.1 g of disodium EDTA•2H 2O to 800 mL of H 2O. Stir vigorously on a magnetic stirrer. Adjust the pH to 8.0 with NaOH (~20 g of NaOH pellets). Dispense into aliquots and sterilize by autoclaving. The disodium salt of EDTA will not go into solution until the pH of the solution is adjusted to ~8.0 by the addition of NaOH.1% SDSStore at room temperature.Dilution buffer16.7 mM Tris-Cl (pH 8.0) Tris-ClTris base HClTo prepare a 1 M solution, dissolve 121.1 g of Tris base in 800 mL of H 2O. Adjust the pH to the desired value by adding concentrated HCl.pH HCl 7.4 70 mL 7.6 60 mL 8.042 mLAllow the solution to cool to room temperature before making final adjustments to the pH. Adjust the volume of the solution to 1 L with H 2O. Dispense into aliquots and sterilize by autoclaving.If the 1 M solution has a yellow color, discard it and obtain Tris of better quality. The pH of Tris solutions is temperature-dependent and decreases ~0.03 pH units for each 1°C increase in temperature. For example, a 0.05 M solution has pH values of 9.5, 8.9, and 8.6 at 5°C, 25°C, and 37°C, respectively.167 mM NaCl1.2 mM EDTAEDTA (ethylenediamenetetraacetic acid)NaOHTo prepare EDTA at 0.5 M (pH 8.0): Add 186.1 g of disodium EDTA•2H 2O to 800 mL of H 2O. Stir vigorously on a magnetic stirrer. Adjust the pH to 8.0 with NaOH (~20 g of NaOH pellets). Dispense into aliquots and sterilize by autoclaving. The disodium salt of EDTA will not go into solution until the pH of the solution is adjusted to ~8.0 by the addition of NaOH.0.01% SDS 1.1% Triton X-100Store at 4°C.EDTAElution buffer for ChIP50 mM Tris-Cl (pH 8.0)Tris base HClTo prepare a 1 M solution, dissolve 121.1 g of Tris base in 800 mL of H 2O. Adjust the pH to the desired value by adding concentrated HCl.pH HCl 7.4 70 mL 7.6 60 mL 8.042 mLAllow the solution to cool to room temperature before making final adjustments to the pH. Adjust the volume of the solution to 1 L with H 2O. Dispense into aliquots and sterilize by autoclaving.If the 1 M solution has a yellow color, discard it and obtain Tris of better quality. The pH of Tris solutions is temperature-dependent and decreases ~0.03 pH units for each 1°C increase in temperature. For example, a 0.05 M solution has pH values of 9.5, 8.9, and 8.6 at 5°C, 25°C, and 37°C, respectively.10 mM EDTAEDTA (ethylenediamenetetraacetic acid) NaOHTo prepare EDTA at 0.5 M (pH 8.0): Add 186.1 g of disodium EDTA•2H 2O to 800 mL of H 2O. Stir vigorously on a magnetic stirrer. Adjust the pH to 8.0 with NaOH (~20 g of NaOH pellets). Dispense into aliquots and sterilize byautoclaving. The disodium salt of EDTA will not go into solution until the pH of the solution is adjusted to ~8.0 by the addition of NaOH.1% SDSStore at room temperature.Formaldehyde (37%) Glycine (1.375 M) Growth mediumHigh-salt wash buffer for ChIP50 mM HEPES (pH 7.9) 500 mM NaCl1 mM EDTAEDTA (ethylenediamenetetraacetic acid) NaOHTo prepare EDTA at 0.5 M (pH 8.0): Add 186.1 g of disodium EDTA•2H 2O to 800 mL of H 2O. Stir vigorously on a magnetic stirrer. Adjust the pH to 8.0 with NaOH (~20 g of NaOH pellets). Dispense into aliquots and sterilize by autoclaving. The disodium salt of EDTA will not go into solution until the pH of the solution is adjusted to ~8.0 by the addition of NaOH.0.1% SDS 1% Triton X-100 0.1% deoxycholateStore at 4°C.Micrococcal nuclease (MNase)Micrococcal nuclease digestion buffer (MNase digestionbuffer)Phosphate-buffered saline (PBS) (1X)Reagent Amount to add(for 1X solution) Final concentration (1X) Amount to add (for 10X stock) Final concentration (10X) NaCl 8 g 137 mM 80 g 1.37 M KCl 0.2 g 2.7 mM 2 g 27 mM Na 2HPO 4 1.44 g 10 mM 14.4 g 100 mM KH 2PO 40.24 g1.8 mM2.4 g18 mMIf necessary, PBS may be supplemented with the following: CaCl 2•2H 2O 0.133 g 1 mM 1.33 g 10 mM MgCl 2•6H 2O0.10 g0.5 mM1.0 g5 mMPBS can be made as a 1X solution or as a 10X stock. To prepare 1 L of either 1X or 10X PBS, dissolve the reagents listed above in 800 mL of H 2O. Adjust the pH to 7.4 (or 7.2, if required) with HCl, and then add H 2O to 1 L. Dispense the solution into aliquots and sterilize them by autoclaving for 20 min at 15 psi (1.05 kg/cm 2) on liquid cycle or by filter sterilization. Store PBS at room temperature.Protease inhibitors (Roche)Protein A-agarose/salmon sperm DNA beads (Millipore) or Protein G-agarose/salmon sperm DNA beads (Millipore) Proteinase K (20 μg/uL)TE buffer (optional; see Step 30)ReagentQuantity (for 100 mL) Final concentration EDTA (0.5 M, pH 8.0) 0.2 mL 1 mM Tris-Cl (1 M, pH 8.0)1 mL10 mMReagent Quantity (for 100 mL) Final concentration H2O to 100 mLEquipment。

说明书-Thermo Scientific Pierce 免疫共沉淀(Co-IP)试剂盒

说明书Pierce®免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒26149 2181.6货号描述26149 Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒，包含足够进行50次免疫沉淀反应的试剂（每次使用25 μL树脂固相化抗体）试剂盒组分：加强型AminoLink®偶联树脂，2 mL固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100 μL 50%的浆液含有50 μL固相树脂）20×交联缓冲液，25 mL，使用时稀释至：0.01M Na3PO4，0.15M NaCl；pH 7.2氰基硼氢化钠溶液（5 M），0.5 mL淬灭缓冲液，50 mL ，1M Tris-HCl洗涤缓冲液，60 mL，1M NaClIP裂解/洗涤缓冲液，2 × 50mL，0.025M Tris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP-40，5%甘油；pH 7.4改良型杜氏PBS （20×），25mL，使用时稀释至：0.008M Na3PO4、0.002M K3PO4、0.14M NaCl、0.01M KCl；pH 7100×条件缓冲液，5 mL，中性pH缓冲液洗脱缓冲液，50 mL，pH 2.8，含有伯胺非还原型泳道标记上样缓冲液，（5×），5 mL，0.3M Tris•HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料；pH 6.8Pierce离心柱-带螺帽，100个柱子，包含相应配件微量离心收集管，2 mL，100个微量离心样品管，1.5 mL，50个Pierce对照用琼脂糖树脂（4％琼脂糖珠交联），2 mL固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100 μL 50%的浆液含有50 μL固相树脂）储存：收到试剂盒后将其储存于4°C。

将DSS于4°C干燥保存。

常温运输。

产品简介Thermo Scientific Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒通过将纯化的抗体直接固定在琼脂糖基质上，从细胞裂解液或其它复杂混合物中分离天然蛋白复合体。

免疫共沉淀中文使用说明书（Pierce26149）

免疫共沉淀中⽂使⽤说明书（Pierce26149）Pierce? Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit（26149）中⽂说明书介绍：Thermo 公司的Pierce?免疫共沉淀试剂盒，可通过将铆钉抗体固定在琼脂糖⽀撑物上，从裂解液中或其他复杂混合物中，分离出天然蛋⽩复合物。

Co-IP是⼀种研究蛋⽩与蛋⽩相互作⽤通⽤的⽅法，该⽅法使⽤⼀种诱饵蛋⽩与抗原进⾏免疫沉淀反应，然后可通过免疫共沉淀任何与诱饵蛋⽩具有相互作⽤的猎物蛋⽩。

传统的Co-IP⽅法使⽤蛋⽩A或G共同洗脱抗体的重链和轻链，这很可能导致将相关的蛋⽩⼀起洗脱下来，掩盖⼀些重要的结果。

Pierce?免疫共沉淀试剂盒通过将共价结合抗体固定在⼀个胺类活性反应树脂上解决了这⼀问题。

该试剂盒包含⾜够的⽤于蛋⽩结合和恢复的缓冲液，完成对照试验的⾼校离⼼柱和收集管，这些产品进⼀步缩短了操作实验的时间。

重要产品信息：略Co-IP实验步骤：A.抗体固定注意：以下试验步骤是针对⽤⽆胺和其他载体蛋⽩稀释的10-75µg亲和纯化抗体（参考重要产品信息⼀节）。

根据实际使⽤⽐例参考这⼀协议步骤。

参考重要产品信息节表1中的建议抗体⽤量和树脂体积⽤量。

1.室温平衡胺连接耦合树脂（AminoLink?Plus Coupling Resin）和试剂；2.为每个Co-IP反应准备2ml 1×Coupling Buffer（超纯⽔稀释20×Coupling Buffer）；3.轻轻涡旋混匀装有AminoLink?Plus Coupling Resin的瓶⼦，使其处于悬浮状态。

使⽤⼤⼝径（或剪掉⼀段枪头端），添加50µl树脂悬液到Pierce提供的离⼼柱中，将离⼼柱放⼊微量离⼼管中，1000g离⼼1min，弃滤液；4.添加200µl 1×Coupling Buffer 清洗树脂2次，离⼼弃滤液；5.将离⼼柱放于纸⼱上，轻巧离⼼柱底部，去除剩余的液体，插上底塞；6.准备10-75µg亲和纯化抗体⽤于结合蛋⽩，调整体积⾄200µl，使⽤⾜够的超纯⽔和20×Coupling Buffer来制备1×Coupling Buffer。

免疫共沉淀(Co-IP)

浓缩胶具有堆积作用，将较稀的样品，经过大孔径凝胶迁移作用被浓缩至一个狭窄的区带。
分离胶将不同大小的蛋白分离开来
SDS-PAGE
胶板选择
根据样品数和上样量数选择适合尺寸的胶板和相应的样品梳。
小型垂直电泳系统 14
胶浓度选择
根据待检测样品的分子量，选择合适浓度分离胶，具体配置查阅分子克隆。
分离胶 H2O 30%丙烯酰胺 1.5MTris (pH8.8)
14聚子阴0m%l合筛离（1后效子0 m形应去L）成。污交剂浓H叉，2缩O 网胶作状为结变构性，剂42m.使7和lml其助产溶生试分剂， 3断.3 m裂l 分子内和3分0%丙子烯间酰胺氢键，0.6去7 m折l 叠，消 2除.5 m电l 荷和分子1结M T构ris (的pH6影.8) 响。0.5 ml
淀实验，环状沉淀实验和凝胶内沉淀实验。
3
免疫共沉淀CoIP：
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
CoIP原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
•电泳条件： 70V恒压30 min； 120V恒压1-1.5 h（具体时间根据分子量大
小，及预染Marker指示位置）。
转膜准备工作（湿转法）
•转膜缓冲液配置（预冷） 1 L体系：12.1 g Tris base 14.4 g Glycine 5%-20%甲醇
• 醋酸纤维膜：略比胶大，根据蛋白质分子量可以选择不同规格的，0.22μm；0.45 μm
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coip免疫共沉淀裂解液及凝胶

CoIP（共免疫沉淀）是一种用于检测蛋白质与其相互作用分子的技术。

这种技术需要使用特定的共沉淀裂解液和凝胶来提取目标蛋白质及其相互作用分子。

在CoIP实验中，共沉淀裂解液和凝胶的选择非常重要。

下面将从共沉淀裂解液和凝胶两个方面来介绍CoIP实验中的关键问题。

1. 共沉淀裂解液的选择共沉淀裂解液的选择直接影响CoIP实验的结果。

一般来说，共沉淀裂解液的主要功能是破坏细胞膜和细胞器，并使蛋白质保持其天然的构象和功能。

常用的共沉淀裂解液包括RIPA缓冲液、SDS缓冲液等。

在选择共沉淀裂解液时，需要考虑以下因素：1.1 细胞类型：不同类型的细胞可能需要使用不同的共沉淀裂解液。

对于质膜蛋白的共沉淀，最好选择质膜蛋白提取液。

1.2 目标蛋白的性质：一些蛋白质对共沉淀裂解液的pH值、离子强度等有严格的要求，需要根据蛋白质的性质选择合适的共沉淀裂解液。

1.3 抗蛋白质：一些共沉淀裂解液中可能含有抑制蛋白酶的抗蛋白质，有助于保护目标蛋白不被降解。

2. 凝胶的选择在CoIP实验中，凝胶主要用于分离和检测被共沉淀的蛋白质及其相互作用分子。

凝胶的选择需要考虑以下因素：2.1 分辨率要求：根据实验的需要，选择合适的凝胶类型。

对于分辨率要求较高的CoIP实验，可以选择聚丙烯酰胺凝胶；而对于较为简单的CoIP实验，则可以选择琼脂糖凝胶。

2.2 蛋白质转印：在CoIP实验中，常常需要将凝胶上的蛋白质转印到膜上进行进一步检测。

在选择凝胶时需要考虑其适合蛋白质转印的特性。

2.3 凝胶染色：选择适合的凝胶染色方法，根据实验需要进行选择。

3. CoIP实验中的注意事项除了共沉淀裂解液和凝胶的选择，还有一些CoIP实验中的注意事项需要注意：3.1 样品制备：样品的制备是CoIP实验成功的关键。

需要使用优质的细胞裂解液，并严格控制样品的保存和处理条件。

3.2 抗体的选择：CoIP实验中需要使用特异性良好的抗体，以确保共沉淀的蛋白质和其相互作用分子是真正的目标物。

免疫共沉淀(Co-IP)

1免疫共沉淀一、实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP），是利用抗原A 与蛋白B 结合，通过A 的抗体（钥匙）沉淀A （锁），再利用精制的prorein A/G （钥匙链）预先结合到磁珠上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，磁珠上的prorein A/G 就能吸附抗原，从而获得抗原A 与蛋白B 的复合体，之后就可以对B 进行检测，从而获得蛋白质与蛋白质相互作用的信息。

二、Co-IP 标准化操作流程样品裂解（裂解液）→样品的预纯化（normal IgG/微珠）→与目标蛋白抗体共孵育（IP 抗体、Normal IgG ）→免疫共沉淀（微珠）→微珠清洗（裂解液）→洗脱→WB 分析或其他分析（WB/一抗、二抗）（一）样品裂解 1.温和裂解（1）温和的裂解液进行裂解，常用的去垢剂成分：NP-40、TritonX-100、IGEPAL CA-630、CHAPS ；（2）成品buffer ；（3）添加蛋白酶抑制剂（防止蛋白被降解）。

2.样本制备流程（1）去掉培养基，用冰PBS 清洗一次。

2（2）去掉PBS，每个板（10cm ）中加0.5mL 冰预冷的1×细胞裂解液，在冰上孵育5min 。

（3）将所有细胞刮下，收集到离心管，置于冰上。

（4）冰浴中对样品用超声处理3次，每次5s 。

（此步骤对膜蛋白提取有较好作用）（5）4 ℃，14000g 离心10min ，将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。

（6）BCA 测定浓度。

3.注意事项（1）整个过程冰上操作。

（2）IP 样本一般建议新鲜制备并立即使用，如有需要，可保存在-80 ℃。

（二）预纯化 1.阴性对照的选择与IP 抗体同源同型（亚型）的抗体：如 Rabbit IgG ；Mouse IgG1等。

取与IP 实验等量的裂解液，使用Isotype Control 孵育；与IP 抗体孵育同时进行。

2.Isotype Control 选择3.预纯化的目的（1）减少裂解混合物中的非特异性蛋白的含量。

Co-IP（免疫共沉淀）20140809

Co-IP（免疫共沉淀）Cell lysis buffer（10X）：CST，#9803，非变性蛋白，做IP、蛋白纯化等；Protein G sepharose TM：流式管：<1>裂解细胞，提取蛋白1、依据实验目的处理细胞；2、配备裂解液：用ddH2O配备，10X→1X，用前现配PMSF（1mM），颠倒混匀，不要吹打，否则去污剂会起泡沫，裂解效果减弱。

置于冰上；3、弃去上清培养基，用预冷的PBS洗涤细胞2遍，去除残留培养基，大皿斜靠，使残留的PBS到角落，最后一次吸干PBS，短时间内细胞若干燥是允许的，防止裂解液被PBS稀释；大皿平放在冰上；4、每个大皿添加400ul预冷的细胞裂解液，摇晃，使裂解液漫过整个平皿；5、冰浴平皿5min；6、用预冷的细胞刮子刮细胞，每个角落尽可能刮尽，刮好后可斜靠，使裂解液到角落富集，再吸到预冷无RNase1.5ml EP管中，冰浴30min→1h；或者把裂解液转移到预冷无RNase1.5ml EP管中，4℃，缓慢晃动30 min 。

7、离心，14 000*g 10min 4℃；8、立即将上清转移到一个新的预冷的无RNase1.5ml EP管中，大致计数体积，为蛋白定量做准备；Note：若不提取膜蛋白，可将细胞用胰酶消化离心收集后再用裂解液裂解细胞提取蛋白；<2>蛋白定量据经验，IP的蛋白终浓度一般≤1mg/ml，若过浓，则蛋白非特异性结合多，蛋白较稀，反应则会更好点，但可能所需抗体则会更多，浪费抗体；一般用BCA定量，Nanodrop定量不太准确；举例：D1 D2 R1 R2Con（ng/ul）7844 11682 5634 9280VOL(ul)：430 550 500 550M(pro)（mg）：3.38 6.4 2.8 5.1<3>免疫共沉淀：一般若抗体、蛋白、珠子相互比例不清楚，则一般条件下：要点：20ul PG（beads）/2ug Ab/0.5—1 mg pro/ml，抗体终浓度2ug/ml；本例抗体初浓度0.5mg/ml，说明书上推荐IP浓度比Ab：pro=5ul：1mg，相当2.5ug/ml；人免疫球蛋白重链可与Protein G结合，50KDa，间接作为IP成功标志；Protein G：鼠、兔等动物来源；Protein A：人源；（蛋白纯化珠子可反复用，但IP珠子需要一次性）;最好用圆底带盖管子（无菌流式管）：液体体积：<1/2 VOL；IP前还是IP后再纯化：？纯化部分蛋白时，可用甘氨酸洗脱（酸性），再脱盐····损失约20%；或者直接带着珠子跑电泳；纯化蛋白的超滤管：>1/3抗原分子量；（标准操作时，先加抗体反应2h，37℃？，再加beads 4℃过夜，360°缓慢旋转，胶不沉淀即可；）1、反应液用TBST配备，一般特异性强，加吐温，若特异性弱，可不加吐温；将相应体积的蛋白裂解液500ul左右加入至5ml TBST中，颠倒混匀；2、加入相应量的抗体25ul，混匀；3、吸取Protein G 100ul（每次吸之前摇匀，使之成为悬浊液），吸取的枪头尖端减去少许，使珠子可吸进来，且不会破坏珠子；再混匀，分布均匀，未见有大颗粒（若有大颗粒，说明时间较久，胶凝，不准，予以吹打大颗粒）；4、4℃过夜360°缓慢旋转，使管底不会有沉淀（胶）析出，为防漏，予封口膜密封；5、过夜后，离心，1-2 000rpm 5min 4℃，弃去上清（珠子比细胞更大，更易分离，可用枪吸弃，不易丢失沉淀物，枪头端剪去少许，使吸力不会很大），残留液约300-500ul 左右，防吸弃上清过多丢失沉淀物；注意吸弃上清过程中管子小心取放，因沉淀较易溶解于上清中，只要稍加晃动便会溶解；6、沉淀用预冷TBST反复洗涤3-4遍；沿管壁缓慢添加4ml左右的预冷TBST，勿直接添加向管底，使蛋白间断裂分开，大致添加至离管口1cm左右（最大程度稀释洗涤沉淀，此时沉淀又溶解于TBST中），上下轻轻颠倒混匀4-5下，未见有大颗粒状，若有，应当用枪头（剪去尖端）吹打混匀；7、离心，1-2 000rpm 5min 4℃，重复5-6步骤，共洗涤3-4遍；8、最后弃上清，残留沉淀及胶及少许液体100-200ul左右；9、（个人觉得）先最大程度吸取残留液到新的预冷的无RNase1.5ml EP管中（先吹打混匀再吸取），再添加200ul/100ul 2X/3X SDS-PAGE loading buffer到5ml 流式管中，吹打几下，再吸取到1.5ml EP管中，使蛋白尽可能被回收，减少损耗；（同学做的：200ug 总pro 加2X SDS-PAGE loading buffer 50ul）10、煮沸变性：1.5ml EP管管口破针尖大小空洞，使煮沸过程中压力一样，100℃水浴10min，离心12 000rpm 1min。

免疫共沉淀(CoIP)详细步骤教程(

免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程（转）------一原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer 洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

红细胞裂解液(RBC Lysis Buffer,10×)

红细胞裂解液(RBC Lysis Buffer ,10×)简介：红细胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)是一种从人、鼠或其他哺乳动物等体内的组织样品或血液中裂解并去除无核红细胞的溶液，其主要有效成分为NH 4Cl 。

RBC Lysis Buffer(10×)配方经过优化不同于ACK Lysis Buffer ，在裂解无核红细胞的同时几乎不损伤淋巴细胞(Lymphocyte)或其它有细胞核的细胞。

使用1×RBC Lysis Buffer 处理过的血液或组织细胞样品可以用于后续的细胞培养、细胞融合以及核酸或蛋白的提取及各种常规的分析和检测，尤其适用于流式细胞检测或需要高浓度裂解液的情况。

组成：操作步骤(仅供参考)：注意：绝大多数情况下，应使用无菌去离子水稀释RBC Lysis Buffer(10×)至1×使用，流式细胞术除外。

(一)组织细胞样本的常规操作1、制备细胞悬液，离心弃上清。

2、裂解: 加入1×RBC Lysis Buffer ，轻柔吹打混匀，裂解。

本操作步骤在4℃条件下操作更佳，亦可在室温下操作。

3、离心: 4℃离心，弃红色上清。

本步骤亦可在室温下操作。

4、如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3各一次。

5、洗涤：根据实验要求加入适量PBS 、HBSS 、生理盐水或无血清培养液，轻柔混匀重悬沉淀。

4℃，离心，弃上清，该离心步骤亦可在室温下操作。

6、如有必要，重复上述步骤5一次，共洗涤1～2次。

7、根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀，进行计数、培养等后续实验。

(二)组织细胞样本的快速操作(无需洗涤)1、制备细胞悬液：新鲜组织经胰蛋白酶或胶原酶等消化处理，制备细胞悬液，离心弃上清。

2、裂解：加入1×RBC Lysis Buffer ，轻柔吹打混匀，裂解。

本操作步骤在4℃条件下操作更佳，亦可在室温下操作。

免疫共沉淀裂解液

免疫共沉淀裂解液介绍免疫共沉淀裂解液（immunoprecipitation lysate）是生物学领域常用的一种实验技术。

通过利用抗体的特异结合性，将目标蛋白与周围环境中的其他蛋白分离开来，从而研究蛋白相互作用、信号传导等生物过程。

本文将深入探讨免疫共沉淀裂解液的原理、方法以及其在科研中的应用。

原理免疫共沉淀裂解液的原理基于抗体的选择性结合性。

在免疫共沉淀实验中，首先需要制备兔抗体或小鼠抗体，并与抗原进行免疫反应。

抗体与抗原的结合形成特异性复合物，可用于将目标蛋白与周围环境中的其他蛋白区分开来。

方法1.细胞裂解–收集细胞或组织样品，并迅速冰冻保存以阻止蛋白质的降解。

–加入裂解液（含有蛋白酶抑制剂）并彻底悬浮细胞或组织。

–放入低温培养箱中离心，收集上清液（裂解液）。

2.抗体结合–将收集的裂解液与特异性抗体一起孵育，使抗体与目标蛋白结合形成免疫复合物。

–可根据实验需求是否添加交联剂，如二甲亚砜（DMS）、氯化亚铊（Thio）、二甲亚砜和Thio的混合物等，增强免疫复合物的稳定性。

3.共沉淀及洗涤–添加蛋白A/G琼脂糖或其他蛋白A/G亲和柱材料，促使免疫复合物与之结合。

–将样品加入柱材料中，并反复冲洗以去除非特异性结合的蛋白和其他杂质。

–收集洗涤液中的目标蛋白，可用于进一步的分析和检测。

4.目标蛋白的检测–使用SDS-PAGE分离复合物中的蛋白。

–将蛋白转移到膜上，并进行免疫印迹（Western blotting）或质谱分析等技术，检测目标蛋白。

应用免疫共沉淀裂解液在生物学研究中应用广泛，主要用于以下领域：1.蛋白相互作用研究–免疫共沉淀可以用于鉴定和验证蛋白－蛋白相互作用。

通过将抗体与目标蛋白结合，可以共沉淀与其相互作用的蛋白，进一步阐明细胞中各个蛋白之间的相互关系。

2.信号转导研究–免疫共沉淀可以用于研究信号转导通路中的蛋白质复合物。

通过免疫共沉淀，可以分离出参与信号转导的关键蛋白，进一步了解其在信号传导过程中的功能和调控机制。

裂解液——精选推荐

全蛋白提取试剂盒Tissue or Cell Total Protein Extraction Kit产品说明：本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取全蛋白，用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer匀浆裂解组织或细胞，作用温和，提取过程简便高效,可以提取出培养细胞或动物组织中的决大多数蛋白质。

获得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀，酶活性分析，Pull down,EMSA等后续研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂，可以每次从107个培养细胞或200mg动物组织提取蛋白质，本试剂盒可以使用50次。

储存条件：2～8℃。

产品特点：1．提取的蛋白质包括膜,核,核基质和胞质蛋白,而且最大限度保持蛋白质活性；2．整个操作过程只需要30分钟左右；3．即可以用于培养细胞（50x107个），有可以用于动物组织（50x200mg）蛋白质的提取；4．避免蛋白酶和磷酸酶对蛋白质的降解，保持蛋白质的完整性和天然活性；5．不需要超速度离心，可以同时处理多个样品。

编号包装价格产地BSP003 50 Assays 520 生工RIPA裂解液IIRIPA Lysis Buffer II产品说明：RIPA裂解液II对动物细胞胞膜、胞浆、胞核成分均有中等强度裂解作用，可能是经典但最常用的细胞组织快速裂解液。

使用RIPA Buffer制备用于Western特别是用于免疫共沉淀的裂解产物已经是一种首选的标准操作，适用于大部分抗原表位的检测，特别适用免疫共沉淀检测蛋白质-蛋白质之间的相互作用胞浆磷酸化蛋白和细胞核转录因子检测等。

本产品包括裂解液和蛋白酶和磷酸酶抑制剂组成. 为1倍溶液，可以处理108个细胞或1g 组织。

含有(NaCl,NP-40, deoxycholate, SDS,Tris), proteinase inhibitor and phosphatas inhibitor cocktail 。

组织裂解液和细胞裂解液如何配制？

组织裂解液和细胞裂解液如何配制？一、细胞裂解液配制方法一一、试剂准备1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液:150 mM NaCL1% NP-40 (去垢剂)0.1% SDS (去垢剂)2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂)1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂)1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选)以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。

2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF1.5 mM EDTA1mM NaVanadate （钒酸钠）(任选)3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。

二、实验步骤1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。

加入足够的冷的PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。

在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。

2、向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液(每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮(由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。

3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中（置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。

4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。

如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。

5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在 -70℃。

方法二NP-40 or Triton-100 1%TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/LNaCl 150mmol/LPMSF（苯甲基磺酰氟） 0.1mmol/L(100μg/ml)Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 μmol/L(0.7μg/ml)Leupeptin（亮抑制肽） 0.5mg/mlAprotinin（抑蛋白酶肽） 0.3μmol/L(1μg/ml)（注：PMSF 贮存液：100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中；Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0);Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中；Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存）裂解操作程序：* 离心收集1×107个细胞* 加入4℃预冷1%NP-40裂解液100μl* 剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀（如为组织进行匀浆）* 4℃放置15~30min* 4℃离心，15 000rpm,10min，取上清备用。

冷泉港coip lysis 配方(免疫共沉淀裂解液)

免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程

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免疫沉淀IP 免疫共沉淀coIP 染色体免疫沉淀ChIP

整理）Co-IP免疫共沉淀样品制备

冷泉港coiplysis配方（免疫共沉淀裂解液）

裂解液配制方法

冷泉港-ChIP各种试剂配方

说明书-Thermo Scientific Pierce 免疫共沉淀(Co-IP)试剂盒

免疫共沉淀中文使用说明书（Pierce26149）

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