CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介
染色质免疫沉淀法
染色质免疫沉淀法
染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质上特定蛋白质与DNA相互作用的实验方法。
该方法主要包括以下几个步骤：
1. 交联：将细胞或组织交联以固定染色质结构，一般使用甲醛作为交联剂。
2. 酶切：使用限制酶或超声波等方法将染色质切割成适当的片段。
3. 免疫沉淀：将特定抗体与染色质混合，使其与特定蛋白质结合。
随后使用蛋白A/G磁珠等材料将抗体结合的染色质选择性地沉淀下来。
4. 解交联：将染色质与抗体复合物从蛋白质上解离，并解开DNA与蛋白质之间的交联结构。
5. DNA纯化：将沉淀下来的DNA纯化出来，以供后续实验分析，如PCR、测序等。
通过染色质免疫沉淀法，可以研究特定蛋白质与DNA的相互作用、染色质结构与功能以及基因表达的调控机制等。
该方法在生物学研究中广泛应用，为研究基因组学、表观遗传学等领域提供了重要工具。
染色质免疫共沉淀测序技术
染色质免疫共沉淀测序技术
1染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀（ChIP-seq）是一种使用测序技术来研究染色质蛋白结合DNA及与基因表达的调控的新兴基因组学技术。
它是染色质免疫沉淀（ChIP）技术与高通量测序技术的结合。
通过染色质免疫共沉淀测序技术，可以确定细胞中的基因组上的结合位点，研究特定的蛋白质和DNA，及基因转录的调控机制，以及参与蛋白质-DNA结合的相关机制。
染色质免疫共沉淀测序是将蛋白质-DNA复合物通过染色质免疫沉淀（ChIP）技术进行收集，然后根据分子标记的位点将其测序，并且将其无功的部分暴露出来进行测序分析。
依靠ChIP-seq，可以以一种高效的方式查看某种特定蛋白质在基因组上结合的位置，并且可以分析复杂结构DNA区域位点间结合关系，也可以确定转录因子调控基因表达的路径。
染色质免疫共沉淀技术在进行基因组组学研究、基因组区域结构分析、功能元件检测、基因调控研究及转录组分析中发挥着重要作用。
传统的ChIP技术是所有细胞中的结合位点的相对分析，它们的数据可以用于描述和验证转录调控的路径，但是不能给出定性的结论，而ChIP-Seq则能够获得定性的位置并进行深入的分析。
染色质免疫共沉淀测序技术在研究复杂基因调控网络中发挥了重要作用，它可以更有效地捕捉基因表达状态，帮助研究者对研究对象
的基因表达调控进行深入的研究，使科研数据更为准确可靠，揭示出机体细胞调控的生物学机制。
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。
以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤：
1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。
这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。
2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。
这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。
3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。
免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。
4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。
5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。
6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。
7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。
这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。
实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。
因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
可重复性。
染色质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP
染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP ChIP简介：ChIP是染⾊质免疫沉淀技术（Chromatin ImmunoPrecipitation assay）的简称，属于免疫沉淀技术的⼀种，⽤于检测蛋⽩质与DNA的相互作⽤。
染⾊质免疫沉淀技术的⼀个重要⽤途是研究某个转录因⼦A（可以是发⽣某些特定修饰，如磷酸化、⼄酰化等修饰的蛋⽩）是否调控其预期靶基因B的特定转录调控区（主要是启动⼦区域）。
下⾯就以利⽤ChIP研究转录因⼦对基因的调控为例进⾏阐释。
检测⽔平：转录⽔平调控原理及操作流程：染⾊质免疫沉淀技术的原理及⼀般操作流程为：1. 在活细胞状态下，使⽤交联剂（常为甲醛）将蛋⽩质-DNA复合物固定下来；2. 然后通过理化⽅法（常为酶消化法或者超声破碎）将这种复合物中的DNA随机切割为⼀定长度范围内的染⾊质⼩⽚段；3. 继续使⽤蛋⽩质A的特异性抗体I（⼀般要求ChIP级别）处理，将含有蛋⽩质A的蛋⽩质-DNA⽚段特异性标记；4. 再利⽤⼀种可以结合抗体的Protein A（⼀般偶联到分选柱和磁珠上，便于分离），将含有抗体的复合物从作⽤体系中富集分离出来，未被抗体标记的蛋⽩质-DNA则被洗脱去除；5. 将得到的抗体-蛋⽩质-DNA复合物解交联，纯化富集其中的DNA⽚段；6. 利⽤针对⽬的基因B转录调控区的特异性引物（⼀般设计多个位点，覆盖多个区域）进⾏PCR（以前多为半定量PCR，现在随着设备的升级，使⽤荧光定量PCR也逐渐普及）等⼿段检测，如果其中有PCR检出阳性则表明蛋⽩质A可以与基因B的转录调控区有结合（可以是直接也可以是间接结合，具体区分还需要进⾏进⼀步的EMSA检测），⽽具体的结合位点就在引物覆盖区域及其周边位置。
ChIP-on-chip衍⽣技术：ChIP-on-chip有时也称ChIP-chip，要注意其中的⼤⼩写因为它们代表的意义不同，其中前⼀个ChIP表⽰染⾊质免疫沉淀技术，后⼀个chip表⽰基因芯⽚技术。
ChIP染色质免疫沉淀技术
染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，简称ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。
它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。
特别是近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用;从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用;从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。
随着对基因功能研究的不断深入，这项技术正越来越多的被应用于科研的各个领域。
chip技术的原理染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。
因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。
对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说，使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果，比如millipore公司的EZ-ChIP试剂盒就是专门为初学者设计的入门产品。
下面我们就最基本的实验步骤，实验中的小技巧以及需要注意的问题简单介绍一下。
1. 细胞固定甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。
甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。
交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。
值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。
02 CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介
Ago----argonaute蛋白
谢 谢！
概述 原理 方法 比较 举例
Saleh A, Alvarez-Venegas R, Avramova Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 2008;3(6):1018-1025.
概述
原理 染色质免疫沉淀实验(CHIP)
方法 比较
举例 ➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要 工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋 白与特异DNA 片段的结合情况，还可以 用来研究组蛋白与基因表达的关系。
概述
原理 CHIP原理
方法
比较 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物
举例
将其随机切断为一定长度范围内的染色质
概述
原理 应用举例
方法
比较
举例
Mantovani F, Tocco F, Girardini J, et al. The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP. Nat Struct Mol Biol. 2007 Oct;14(10):912-920.
方法
比较
举例
条 超声波破碎条件的选择
件 选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
照 设
阳性对照：如组蛋白抗体
置 阴性对照：阴性引物
染色质免疫共沉淀技术(ChIP)
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。
因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA 与蛋白质相互作用的方法。
它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP 用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。
这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。
ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
近年来，这种技术得到不断的发展和完善。
采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。
它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种常用的分子生物学技术，也是
研究细胞基因组结构和功能的重要方法。
该技术可以用来鉴定某个转录因
子或其他核蛋白与某个特定DNA序列的结合关系，从而确定这个DNA序列
在基因表达调控中的重要性。
该技术包括以下步骤：（1）交联；（2）裂解；（3）免疫沉淀；（4）洗涤；（5）离解交联；（6）DNA提取。
在这个过程中，首先将细胞进行交联，使得染色质固定在原位。
之后，将染色质进行裂解并进行免疫沉淀，这里是将特定的抗体与目标蛋白质结合，从而使得目标蛋白质与某些DNA序列结合，并保持在染色质中。
然后
对免疫沉淀后的复合物进行洗涤，去除杂质物质，以提高免疫沉淀的特异
性和纯度。
之后，对免疫沉淀后的复合物进行离解交联，使免疫沉淀的蛋
白质与DNA分别被分解为单独的分子。
最后，从免疫沉淀复合物中提取DNA，用于进一步的分析，例如PCR扩增、Southern blotting、测序等。
该技术的优点是可以在整个基因组范围内寻找目标DNA序列的结合蛋白，相对快速、成本低、灵敏度高，并且可以直接从原位染色质富集DNA
序列。
缺点是免疫沉淀的特异性和纯度可能受到影响，需要对实验进行严
谨控制。
染色质免疫共沉淀步骤
染色质免疫共沉淀步骤
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究蛋白质与DNA 相互作用的技术。
以下是一般的染色质免疫共沉淀的基本步骤：
1. 细胞固定：将细胞培养物在适当的条件下进行固定，以维持DNA-蛋白质复合物的结构。
2. 细胞裂解：使用细胞裂解液将细胞破碎，释放出染色质。
3. 抗体结合：将特异性抗体加入到裂解液中，使其与目标蛋白质结合。
4. 免疫沉淀：使用抗体-抗原复合物的特异性结合，通过免疫沉淀的方法将与抗体结合的染色质-蛋白质复合物沉淀下来。
5. 洗涤：对沉淀进行多次洗涤，以去除非特异性结合的物质。
6. DNA 提取：将沉淀中的DNA 提取出来。
7. DNA 分析：对提取的DNA 进行分析，例如PCR、芯片分析或高通量测序等，以确定与目标蛋白质结合的DNA 区域或基因。
需要注意的是，具体的实验步骤可能会因实验目的、细胞类型和使用的试剂而有所不同。
在进行染色质免疫共沉淀实验时，建议遵循相关的实验方案和标准操作流程，并根据实际情况进行优化和调整。
此外，染色质免疫共沉淀技术需要一定的实验技能和经验，包括细胞培养、抗体选择、洗涤条件的优化等。
chip—seq原理
chip—seq原理Chip-seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing，染色质免疫沉淀测序）是一种用于研究染色质上的转录因子结合位点和组蛋白修饰的方法。
该方法首先对细胞进行染色质交联，使得DNA与染色质蛋白交联在一起。
然后使用适当的抗体选择性地免疫沉淀目标转录因子或组蛋白修饰。
接下来，将沉淀物中的DNA进行解交联，并通过DNA纯化获取目标DNA片段。
之后，对目标DNA片段进行测序。
通过高通量测序技术，可以得到很多短序列片段，这些片段对应于染色体上的不同位置。
这些测序片段可以与参考基因组进行比对，从而确定它们在基因组上的位置。
最后，通过对比实验组和对照组的测序数据，可以鉴定转录因子结合位点或组蛋白修饰位点的位置和富集情况，进而研究染色质的功能和调控机制。
总结起来，Chip-seq的原理可以简化为以下几个步骤：1. 染色质交联：将DNA与染色质蛋白交联在一起。
2. 免疫沉淀：使用抗体选择性地沉淀目标转录因子或组蛋白修饰。
3. DNA解交联：将沉淀物中的DNA解除交联，并进行纯化。
4. DNA测序：对纯化后的DNA片段进行高通量测序。
5. 数据分析：通过比对测序数据，确定DNA片段在基因组上的位置，并进行ChIP峰检测和差异分析等。
当使用Chip-seq技术进行染色质免疫沉淀测序时，还可以进一步进行数据分析来获得更多的信息。
1. Peak calling（峰检测）：通过对测序数据进行分析和统计，可以识别出在特定条件下与目标蛋白结合的区域，称为峰。
峰通常表示转录因子结合位点或组蛋白修饰位点。
2. Motif analysis（基序分析）：对峰区域进行进一步分析，可以识别出其中的共有序列模式，称为基序。
这些基序可能与特定转录因子的结合相关，从而可以推断特定转录因子在染色质上的结合位点。
3. Differential binding analysis（差异结合分析）：比较不同实验条件下的Chip-seq数据，可以发现转录因子的结合差异。
CHIP(染色质免疫共沉淀)
一、超声剪切染色质1.用37℃预温的1%PFA固定10-20min，使DNA与蛋白质交联2.终止交联，加入终浓度为0.125M的甘氨酸3.用预冷的PBS洗2次4.用PBS将细胞刮下（5mlPBS+1mMPMSF+1mg/ml抑肽酶）5.4500rpm5min（此阶段细胞沉淀可储存于-80℃）6.弃上清，按200ul/106个细胞加入SDS lysis buffer（现加PMSF&coktail），冰上10min（4℃rotation 30min）7.27G针头注射器吹打3遍，若有气泡离心8.超声：不可有气泡，超两次后放到冰上9.离心：4℃，12000rpm，20min，上清转移到15ml离心管二、Ab沉淀目的染色质1.用dilution buffer稀释至1ml2.取50ul Input（也可取少量做lgG阴性对照，RNaseⅡ阴性对照）备注：取450ul做lgGcontrol，剩余500ul3.剩下的加一抗（5ul/ml），4℃rotate过夜4.向样品中加入50ul ProteinA+Gbeads，4℃rotate2h，之后可在冰上沉淀一会5.离心，1000rpm1min，留上清6.洗珠子，1ml/5min/次，在4℃rotate，再在冰上静置5min，1000rpm1min。
洗涤顺序为：低盐溶液→高盐溶液→LicL（之前在4℃）→TE→TE（室温）三、去除蛋白质1.Elution buffer（1%SDS、0.1MNaHCO3；0.5gSDS，0.42gNaHCO3 in 50ml ddH20）+250uL RT15min rotate →离心1000rpm1min→上清（收集）→+250ulRT 10min →金属65℃5min→上清（收集）2.上清+20ul5M NaClInput+450ul elution buffer+20ul 5M NaCl65℃6-7h或过夜3.10ul0.5MEDTA,20ul1MTris-HCl +2ul 10mg/ml 蛋白酶K（50℃1h）？四、提纯DNA1.加等体积（500ul）Tris-饱和酚，剧烈混匀，14500rpm10min，取上清，加入500ulCHCl3混匀后14500rpm10min，取上清后再加入tRNA60ug （200ug/ml，3ul），加异丙醇500ul，离心14500rpm20min 弃上清2.加70%酒精洗一遍，14500rpm5min，（要去掉上清，先倒掉，倒掉之后离心一下再扔掉液体）将管子倒扣空气晾干。
染色质免疫共沉淀技术原理
染色质免疫共沉淀技术原理一、前言染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是生物学研究中常用的一种方法，它通过利用抗体特异性识别染色质上的特定蛋白质，进而从复杂的细胞核提取物中富集这些蛋白质，并对其进行鉴定和分析。
本文将详细介绍染色质免疫共沉淀技术的原理。
二、实验步骤1. 交联首先，需要对活细胞进行交联处理，以稳定染色质和蛋白质之间的相互作用。
常用的交联剂有甲醛和二氧化硅等。
2. 染色质片段化接下来，需要将交联后的细胞进行裂解，并将DNA片段化。
这可以通过超声波或者限制性内切酶等方法实现。
3. 免疫共沉淀然后，在裂解液中加入与目标蛋白特异性结合的抗体，并进行免疫共沉淀。
在共沉淀过程中，目标蛋白和与其结合的DNA片段会被富集到抗体上。
4. 分离DNA片段接下来，需要将DNA片段从抗体上分离出来。
这可以通过加入盐或者进行热处理等方法实现。
5. 鉴定和分析最后，对富集的DNA片段进行鉴定和分析。
这可以通过PCR扩增、测序或者芯片技术等方法实现，以确定目标蛋白在染色质中的作用位置和作用方式。
三、原理解析1. 抗体选择ChIP技术的核心是抗体的选择。
抗体需要特异性识别目标蛋白，并保持其活性。
通常情况下，使用多个不同来源的抗体可以提高富集效率和准确性。
2. 交联原理交联是通过甲醛或二氧化硅等化学物质与细胞核内的DNA、蛋白质发生共价结合而实现的。
交联后的染色质会更加稳定，避免了在裂解过程中DNA和蛋白质之间失去相互作用。
3. 片段化原理染色质片段化是为了将长链DNA切成适当大小的小片段，以便于后续步骤中与抗体结合并富集目标蛋白。
超声波法利用高频声波震荡使DNA分子破碎，而限制性内切酶法则利用特定的酶切割位点切割DNA分子。
4. 免疫共沉淀原理免疫共沉淀是利用抗体与目标蛋白之间的特异性结合，将目标蛋白及其相关DNA片段从裂解液中富集到抗体上。
这一步骤需要注意选择合适的抗体和免疫共沉淀条件，以提高富集效率和准确性。
5. DNA片段分离原理将DNA片段从抗体上分离出来是为了进一步进行后续鉴定和分析。
染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南
染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。
由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。
这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。
当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA 或RNA）之间会产生共价键。
细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。
但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。
此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。
例如RIP （其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。
第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。
（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介
概述
原理
方法 比较 举例
染色质免疫沉淀实验(CHIP)
研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要 工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋 白与特异DNA 片段的结合情况，还可以 用来研究组蛋白与基因表达的关系。
概述
原理
方法 比较 举例
CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物 将其随机切断为一定长度范围内的染色质 小片段 通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地 富集目的蛋白结合的DNA片段 对目的片断的纯化与检测
概述
原理
方法 比较 举例
应用举例
Mantovani F, Tocco F, Girardini J, et al. The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP. Nat Struct Mol Biol. 2007 Oct;14(10):912-920.
概述
原理
方法 比较 举例
比较：
蛋白质-DNA相互作用常用方法
凝胶电泳迁移率改变分析 （EMSA）
体 外
体 内
DNaseⅠ足迹法（foot printing）
染色质免疫沉淀实验(CHIP)
概述
原理
方法 比较 举例
EMSA
CHIP
由于许多转录调控蛋 能真实完整地反映结 白有相似或相同的DNA 合在DNA序列上的调控 结合位点，EMSA获取 蛋白，是目前确定与 的结果不一定能真实 特定蛋白结合的基因 地反映体内转录调控 组区域或确定与特定 蛋白和DNA结合的状况。基因组区域结合的蛋 白质的最好方法。
CHIP染色质免疫共沉淀实验 Protocol
CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种在全基因组水平上研究蛋白质与DNA相互作用的技术方法。
其实验原理是基于抗原抗体反应的特异性，从而实现对DNA结合蛋白及其DNA靶标的富集。
实验所需试剂和耗材包括：细胞培养及提取试剂、生物素标记试剂盒、抗体、蛋白质A琼脂糖珠、Triton X-100、ECL显影液等。
实验仪器包括：二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机、染色质免疫沉淀仪等。
实验准备工作的要点包括：首先，要确认所用试剂和耗材的型号和保质期；其次，要确保细胞株和抗体的选择合适；最后，准备好实验所需的仪器设备并调试至最佳状态。
实验方法主要包括以下步骤：1.将细胞进行培养并提取染色质。
2.在染色质中加入对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，并用Triton X-100将抗原抗体混合物进行稀释。
3.在混合物中加入蛋白质A琼脂糖珠，以便吸附多余的抗体和未结合的蛋白质。
4.用洗涤液洗涤沉淀物，去除未结合的蛋白质和抗体，最后用变性液洗脱DNA。
5.用电泳法和显影法检测提取出的DNA片段。
注意事项包括：要保持细胞生长状态良好，并确保抗原抗体反应的时间和温度准确适宜；在加入蛋白质A琼脂糖珠后，要充分混匀以避免影响实验结果；最后，要注意控制好电泳参数和显影条件以保证结果的准确性和可靠性。
常见问题及解决方法包括：如果抗原抗体反应不充分，可以尝试增加抗体浓度或延长反应时间；如果未结合的蛋白质不能被有效清除，可以尝试增加洗涤次数或更换洗涤液；如果电泳条带不清晰或出现异常，可以尝试调整电泳参数或更换电泳液。
总之，CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种研究蛋白质与DNA相互作用的有效方法，需要注意保持细胞生长状态良好、准确控制抗原抗体反应条件、充分洗涤未结合的蛋白质等关键点。
同时，针对实验中可能遇到的问题，要积极采取相应的解决方法，以保证实验结果的准确性和可靠性。
染色质免疫共沉淀(ChIP)实验
染色质免疫共沉淀（ChIP）染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。
1实验方法原理：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
2实验材料、试剂、仪器耗材：细胞样品甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒等离心管、超声仪、电泳仪、离心机等3实验步骤：一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。
预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。
这样每100 ul溶液含1×106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4×106个细胞。
因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。
染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 DNA实验技术方法汇总
染色质免疫共沉淀（ChIP）染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。
1实验方法原理：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
2实验材料、试剂、仪器耗材：细胞样品甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒等离心管、超声仪、电泳仪、离心机等3实验步骤：一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。
预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。
这样每100 ul溶液含1×106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4×106个细胞。
因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。
染色质免疫共沉淀实验方法
染色质免疫共沉淀实验方法
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质调控因子与DNA结合的实验技术，主要用于研究转录因子与DNA结合位点的相互作用。
以下是染色质免疫共沉淀实验的主要步骤：
1. **样品准备**：对细胞进行特殊处理，使之成为适合进行基因转录的“活动”状态，然后进行细胞裂解，使染色体变得更为疏松，同时加入抗体。
2. **免疫沉淀**：将处理过的细胞裂解物与特异性抗体混合，利用免疫沉淀将与该抗体结合的DNA片段富集。
3. **DNA回收**：利用纯化的ChIP-enrich样品中是否含有待检定的靶基因的DNA片段。
4. **基因组DNA的回收和鉴定**：通过PCR或测序等方法对ChIP产物进行检测，鉴定是否存在靶基因的DNA片段。
如果存在，即可说明该转录因子能够结合到该基因的DNA上。
5. **基因组DNA的再次检测**：可以通过QPCR或高通量测序等方法，进一步验证ChIP实验结果的准确性。
需要注意的是，在实验过程中，抗体的选择非常重要，通常使用针对蛋白质的特异性抗体，如针对转录因子的抗体。
同时，实验需要严谨的操作流程和质量控制，以确保实验结果的准确性。
此外，染色质免疫共沉淀技术也可通过使用特异性核酸探针或引物进行高通量测序的方法进行大规模基因组研究。
以上内容仅供参考，建议咨询专业人士以获得更准确的信息。
组蛋白染色质免疫共沉淀
组蛋白染色质免疫共沉淀
组蛋白染色质免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的分子生物学技术，用于研究染色质上特定的蛋白质与DNA的相互作用。
这项技术可以帮助研究者寻找与基因调控相关的蛋白质，在基因表达、染色质修饰和细胞发育等方面提供重要信息。
组蛋白是一种细胞核内最主要的蛋白质，因为它们可以在DNA上形成一种高度有序、紧密排列的结构，称为染色质。
组蛋白可以被修饰，如磷酸化、甲基化、酰化等，这些修饰可以影响染色质结构和转录因子的结合，进而影响基因表达。
ChIP技术涉及到将免疫球蛋白与DNA交联、裂解、精选和扩增，最终可以实现对染色质蛋白质的鉴定和分析。
通过这种方法，可以确定特定蛋白质与DNA序列的相互作用，并评估这种相互作用对基因表达的影响。
ChIP技术在生物学研究中发挥着重要的作用，尤其是在基因调控、细胞分化和癌症研究方面。
它可以帮助科学家深入了解细胞内分子之间的相互作用，从而为治疗疾病提供更多理论支持。
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体外 体内
CHIP
举例 由于许多转录调控蛋 能真实完整地反映结 白有相似或相同的DNA 合在DNA序列上的调控
结合位点，EMSA获取 蛋白，是目前确定与
的结果不一定能真实 特定蛋白结合的基因
地反映体内转录调控 组区域或确定与特定
蛋白和DNA结合的状况。 基因组区域结合的蛋
白质的最好方法。
概述
原理 扩展应用举例
方法
比较 CHIP-on-chip
举例
概述
原理 crosslinking immunoprecipitation
方法 (CLIP)
比较
举例
For microRNA–mRNA
interaction
Chi SW, Zang JB, Mele A, Darnell RB. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNAmRNA interaction maps. Nature. 2009 Jul 23;460(7254):479-486.
概述
原理 应用举例
方法
比较
举例
Mantovani F, Tocco F, Girardini J, et al. The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP. Nat Struct Mol Biol. 2007 Oct;14(10):912-920.
Ago----argonaute蛋白
谢 谢！
概述
原理 染色质免疫沉淀实验(CHIP)
方法 比较
举例 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要 工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋 白与特异DNA 片段的结合情况，还可以 用来研究组蛋白与基因表达的关系。
概述
原理 CHIP原理
方法
比较 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物
举例
将其随机切断为一定长度范围内的染色质
概述 原理 方法 比较 举例
Saleh A, Alvarez-Venegas R, Avramova Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 2008;3(6):1018-1025.
小片段
通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地 富集目的蛋白结合的DNA片段
对目的片断的纯化与检测
概述 原理 方法 比较 举例
概述
原理 操作步骤
方法
比较 一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－
举例 DNA复合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声 波）的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质 小片段。
Chromatin Immunoprecipitation Assay (ChIP)
染色质免疫沉淀实验
概述
原理 功能基因组学基因表达调控
方法
比较
基因表达:反式因子和顺式作用元件之
举例
间相互作用。
真核生物的基因组DNA以染色质的形式 存在。
研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相 互作用是阐明真核基因表达机制的基 本途径。
二、免疫沉淀 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原
-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此 复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。
三、纯化与检测 经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段
纯化等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合 情况.
概述 原理 方法 比较 举例
概述
原理 注意事项
方法
比较
举例
条 超声波破碎条件的选择
件 选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
照 设
阳性对照：如组蛋白抗体
置 阴性对照：阴性引物
概述
原理 比较：
方法
比较 蛋白质-DNA相互作用常用方法
举例
凝胶电泳迁移率改变分析 （EMSA） DNaseⅠ足迹法（foot printing） 染色质免疫沉淀实验(CHIP)