染色质免疫沉淀讲解
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超声处理的条件通常可以设置为10秒每次，共3-4次，功率 为50W时设置为最大功率的30%，采用2mm超声头。不同的 超声处理仪器的设置不太一样，摸索超声条件时，可以先固 定其他条件，先确定每次超声多长时间不会导致明显发热， 然后摸索不同的超声次数。直至找到比较合适的超声次数可 以使大部分基因组DNA断裂成200-1000bp大小。需要注意的 是每次的超声体积和细胞用量宜固定，否则就不能使用一个 相对比较固定的超声条件用于后续实验。
实验原理
实验流程
一、交联及染色质DNA剪切条件的优化
1. 准备一瓶接近长满的HeLa细胞，向培养液中加入37%的甲醛至终浓 度为1%，轻轻摇匀，在37℃孵育10分钟。 ① 甲醛的作用 ② 细胞的用量 ③ 交联条件对实验结果的影响
2. 弃培养液，用预冷至4℃带蛋白酶抑制剂PMSF的1×PBS洗细胞两 次，刮细胞到一个2ml离心管，2000rpm，4℃离心4min收集细胞。
③ 酶消化与超声消化相比较的区别
Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理 的结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和 DNA-蛋白复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用 于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采用没经 过甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。因为N-ChIP没经过 甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合，所以只能选择酶处 理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，一般选择超声波处理方法。也 有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。Millipore公 司有商品化的Micrococcal Nuclease处理的ChIP试剂盒（EZ-Enzyme） 提供。
Enzyme和sonication处理结果比较
超声处理的条件需要优化，各实验组可采用不同的超声波处理条 件，比较剪切效果。按以下步骤操作比较各种条件下的剪切效果：
实验组 1
2
3
4
5
6
7
8
超声次数 3
6
9 11 3
6
9 11
超声功率 15W 15W 15W 15W 25W 25W 25W 25W
a. 将超声处理过的样品离心收集上清（ 4℃ 13000rpm离心10分钟）， 加入10μl 0.5 M EDTA、20μl 1M Tris-HCl pH6.5、2μl 20mg/ml蛋 白酶K，45℃ 孵育0.5-1 小时；
细胞的用量
通常2.5×108细胞足够进行4次免疫沉淀。因此，一般为了保证用量， 采取培养多瓶细胞，胰酶消化，收集在50ml离心管中，培养液重悬，计
数。（一般分装1х107细胞于一个EP管，用于免疫沉淀反应）。
交联条件对实验结果的影响
对于不同的细胞类型，甲醛的浓度、交联的长度或者交联的温度都 需要调整。如果交联不充分，会导致不完全固定，则DNA片段的平均长 度会小于500bp。交联过度时细胞染色质难以用超声波破碎，就算延长 超声波作用时间也会导致重要原料的丢失。交联时间如果过短，则交联 不完全，产生假阴性，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据 实验而定。
表观遗传修饰
在不影响DNA序列的情况下改变基因组的修饰，不仅 可以影响个体的发育，而且还可以遗传下去。这类变异被 称为“表观遗传修饰”，并被认为是导致遗传物质一致的 孪生子出现个体差异的主要原因。
染色质重塑
• 染色质重塑在广义上是指染色质结构的动态调整或重新塑 造染色质结构。在一些核内因子作用下，染色质DNA与 其包绕的核心组蛋白之间亲和力的变化或相对位置的改变 使得染色质结构变得较为松散，DNA更易于暴露。染色 质重塑就是通过这样的变化来调控基因的转录。
b. 酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μl的ddH2O中，1.2% 琼脂糖 凝胶电泳检查。
酚/氯仿抽提步骤
按照1：1体积比加酚/氯仿充分混匀后离心，取上层水相 至新管，加入1/10体积3M Nacl，2倍体积无水乙醇，大转 数离心5min
二、免疫沉淀染色质DNA片段
5. 将超声处理过的样品在4℃ 13000rpm离心10分钟收集上清，10倍稀 释，将其移入一新的2ml EP管中；
另外，还应根据对ChIP的不同的特殊应用设立不同的实 验对照。例如，试图检测目的蛋白质是否与某一推测的结合 位点结合，则必须将此位点突变后作为对照；又如，欲测定 突变细胞株中目的蛋白质与基因组DNA结合情况时，必须用 野生型细胞株作对照等。
8. 加60μl蛋白A-琼脂糖/鲑精DNA(50%混悬液)，4℃摇1小时； 9. 短暂离心(700-1000rpm，4℃，小于1分钟) 收集沉淀，分别用低
PCR的策略
引物的选择取决于实验目的。如若鉴定目的蛋白质特异结合的位点， 除了必须设计一对能使扩增片段跨过该位点的引物外，至少还应设计一 对扩增的DNA序列中没有目的蛋白质结合位点的对照引物。对于平均长 度为500bp的DNA分子，它的大部分片段长度是500-1000bp，以至远离 真正的结合位点1000bp处的DNA序列很可能被抗体共沉淀下来。所以， 对照引物扩增的DNA区域与实验引物扩增的DNA区域之间的距离必须大 于1000bp。
11.加入10μl 0.5M EDTA、20μl 1M Tris-HCl pH6.5、和2μl 20mg/ml 蛋白酶K，45℃孵育0.5-1小时；
12.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μl的ddH2O中，取1μl作模 板，按以下配方加样，PCR扩增实验组和对照组以及Input组的 GAPDH启动子序列，扩增条件95℃1分钟，95℃30秒、55℃30秒、 72℃30秒、30个循环，72℃5分钟，1.5%琼脂糖电泳检查结果。 ① 此步DNA纯化可以选择适当的DNA纯化试剂盒 ② PCR的策略
① 抗体的选择
② 对照的设置
① Beads的选择
利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA蛋白质-抗体复合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的 DNA片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质后， 用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。Magna beads是近 年来出现的一种新型beads，它使用方便，不像Agarose beads那样容易破裂，所以在操作过程中更简单，而且免去 了离心的步骤，节省不少时间。Millipore公司最新推出的 Magna ChIP试剂盒就是采用这种Magna beads。
超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生 泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。 所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时 断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深 入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时 间也不要太长，以免蛋白降解。
② 设置超声破碎的条件
6. 按照每2ml稀释后液体加入75μl的比例加入蛋白A-琼脂糖/鲑精DNA (50%混悬液)，4℃摇动30分钟，预处理，短暂离心(700-1000rpm 4℃，小于1分钟)，收集上清液；
① Beads的选择
② Input的设置
7. 向2ml上清液中加入适量的抗乙酰化组蛋白H3的抗体(20μl)，4℃摇 动过夜，阴性对照组不加抗体同样摇动过夜；
引物的设计依据通用的引物设计原则。有时为提高扩增产物的特异 性，可将引物终浓度降低5-10倍。大多数引物步需要纯化或特殊处理。 由于实际上扩增效率较低，扩增产物不应过长，以75-300bp为宜。
Co-IP和ChIP的区别
相互作用 检测对象 检测方法 裂解方式
固定剂 对抗体的要求
Co-IP
ChIP
蛋白-蛋白 蛋白质
3. 用500μl预热至室温带有蛋白酶抑制剂的SDS裂解液 重悬并裂解细胞，冰浴10分钟；
4. 超声波处理剪切染色质DNA，使其形成300-1000 bp 即大约相当于2-5个核小体长度的片段；
① 超声条件对实验的影响及超声注意事项 ② 设置超声破碎的条件 ③ 酶消化与超声消化相比较的区别
① 超声条件对实验的影响及超声注意事项
甲醛的作用
在各种交联试剂中，甲醛（HCHO）的应用最为广泛。甲醛的浓度、 作用时间及交联的温度等均可能影响交联的程度。甲醛可以通过赖氨酸、 精氨酸和组氨酸以及那些DNA的氨基和亚氨基基团之间的交联，高效地 在体内交联蛋白质-DNA、蛋白质-RNA以及蛋白质-蛋白质，形成生物复 合体，防止细胞内组分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠实地保留 染色质结构，而且在温和条件下交联很容易逆转。通常交联所用的甲醛 终浓度为1%，在12-37℃作用30min。但是如果反应温度超过30℃，本底 就可能增加。因此，当必须在高温进行交联时，则应减少作用时间或甲 醛浓度。过度交联将影响细胞的裂解，并且在超声处理时不能获得理想 长度的DNA片段及影响DNA的溶解。对于特别容易进行交联的目的蛋白 质（例如，组蛋白）需减少交联时间或甲醛浓度。甲醛的交联反应可被 加入的甘氨酸终止。
• 在狭义上，染色质重塑专指由ATP提供能量的、通过依赖 于ATP的染色质重塑复合物改变组蛋白与DNA的结合状 态，在靠近核心组蛋白的DNA表面建立特殊的构象，使 转录因子较易于接近DNA的过程。
染色质免疫沉淀技术的发展使染色质重塑研究得以进步
Biblioteka Baidu
实验目的
学习掌握染色质免疫沉淀技术的基本原理与关 键的操作步骤。
盐免疫复合物洗液、高盐免疫复合物洗液、LiCl免疫复合物洗 液洗涤沉淀各一次，每种液体每次用1ml，摇动3-5分钟后短暂 离心收集沉淀。然后用同样的方法用TE缓冲液洗涤沉淀两次
三、PCR鉴定结合于乙酰化组蛋白H3的DNA片段
10. 向上步所得沉淀中加入250μl洗脱液(1% SDS, 0.1M NaHCO3)， 震荡，室温孵育15分钟，离心收集上清；
染色质免疫沉淀
Chromatin immunoprecipitation
基因型决定表型
破坏了基因型也就改变了表型
但是，也有一些无法解释的现象
在相应的基因碱基序列没有发生变化的情 况下，一些生物体的表型却发生了改变。
什么是表观遗传学?
是DNA及其染色质环境的稳定改变，这些可遗传的 变化并不涉及DNA序列的突变。
Western blot/质谱 裂解液
蛋白-DNA DNA序列 PCR/芯片 超声；酶解
不需要固定剂
甲醛
比较高
更高（交联对抗原 表位的破坏）
免疫共沉淀和染色质免疫沉淀input设置
在进行免疫沉淀步骤前的样品
染色质免疫沉淀抗体的选择
ChIP Validated
② 对照的设置
ChIP实验至少应设立3种对照：①未经免疫沉淀的超声 处理样本（input）；②阳性对照。一般用组蛋白抗体或antiRNA Polymerase II抗体这些比较保守的在所有细胞中都能 结合基因的蛋白的抗体； ③阴性对照。即用一种无关抗体 （或相应动物的免疫前血清），与抗目的蛋白质抗体同时分 别与交联染色质样本进行免疫沉淀反应；④选择不与目的蛋 白质结合的基因组区域作对照，即“基因组对照”。
实验原理
实验流程
一、交联及染色质DNA剪切条件的优化
1. 准备一瓶接近长满的HeLa细胞，向培养液中加入37%的甲醛至终浓 度为1%，轻轻摇匀，在37℃孵育10分钟。 ① 甲醛的作用 ② 细胞的用量 ③ 交联条件对实验结果的影响
2. 弃培养液，用预冷至4℃带蛋白酶抑制剂PMSF的1×PBS洗细胞两 次，刮细胞到一个2ml离心管，2000rpm，4℃离心4min收集细胞。
③ 酶消化与超声消化相比较的区别
Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理 的结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和 DNA-蛋白复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用 于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采用没经 过甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。因为N-ChIP没经过 甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合，所以只能选择酶处 理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，一般选择超声波处理方法。也 有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。Millipore公 司有商品化的Micrococcal Nuclease处理的ChIP试剂盒（EZ-Enzyme） 提供。
Enzyme和sonication处理结果比较
超声处理的条件需要优化，各实验组可采用不同的超声波处理条 件，比较剪切效果。按以下步骤操作比较各种条件下的剪切效果：
实验组 1
2
3
4
5
6
7
8
超声次数 3
6
9 11 3
6
9 11
超声功率 15W 15W 15W 15W 25W 25W 25W 25W
a. 将超声处理过的样品离心收集上清（ 4℃ 13000rpm离心10分钟）， 加入10μl 0.5 M EDTA、20μl 1M Tris-HCl pH6.5、2μl 20mg/ml蛋 白酶K，45℃ 孵育0.5-1 小时；
细胞的用量
通常2.5×108细胞足够进行4次免疫沉淀。因此，一般为了保证用量， 采取培养多瓶细胞，胰酶消化，收集在50ml离心管中，培养液重悬，计
数。（一般分装1х107细胞于一个EP管，用于免疫沉淀反应）。
交联条件对实验结果的影响
对于不同的细胞类型，甲醛的浓度、交联的长度或者交联的温度都 需要调整。如果交联不充分，会导致不完全固定，则DNA片段的平均长 度会小于500bp。交联过度时细胞染色质难以用超声波破碎，就算延长 超声波作用时间也会导致重要原料的丢失。交联时间如果过短，则交联 不完全，产生假阴性，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据 实验而定。
表观遗传修饰
在不影响DNA序列的情况下改变基因组的修饰，不仅 可以影响个体的发育，而且还可以遗传下去。这类变异被 称为“表观遗传修饰”，并被认为是导致遗传物质一致的 孪生子出现个体差异的主要原因。
染色质重塑
• 染色质重塑在广义上是指染色质结构的动态调整或重新塑 造染色质结构。在一些核内因子作用下，染色质DNA与 其包绕的核心组蛋白之间亲和力的变化或相对位置的改变 使得染色质结构变得较为松散，DNA更易于暴露。染色 质重塑就是通过这样的变化来调控基因的转录。
b. 酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μl的ddH2O中，1.2% 琼脂糖 凝胶电泳检查。
酚/氯仿抽提步骤
按照1：1体积比加酚/氯仿充分混匀后离心，取上层水相 至新管，加入1/10体积3M Nacl，2倍体积无水乙醇，大转 数离心5min
二、免疫沉淀染色质DNA片段
5. 将超声处理过的样品在4℃ 13000rpm离心10分钟收集上清，10倍稀 释，将其移入一新的2ml EP管中；
另外，还应根据对ChIP的不同的特殊应用设立不同的实 验对照。例如，试图检测目的蛋白质是否与某一推测的结合 位点结合，则必须将此位点突变后作为对照；又如，欲测定 突变细胞株中目的蛋白质与基因组DNA结合情况时，必须用 野生型细胞株作对照等。
8. 加60μl蛋白A-琼脂糖/鲑精DNA(50%混悬液)，4℃摇1小时； 9. 短暂离心(700-1000rpm，4℃，小于1分钟) 收集沉淀，分别用低
PCR的策略
引物的选择取决于实验目的。如若鉴定目的蛋白质特异结合的位点， 除了必须设计一对能使扩增片段跨过该位点的引物外，至少还应设计一 对扩增的DNA序列中没有目的蛋白质结合位点的对照引物。对于平均长 度为500bp的DNA分子，它的大部分片段长度是500-1000bp，以至远离 真正的结合位点1000bp处的DNA序列很可能被抗体共沉淀下来。所以， 对照引物扩增的DNA区域与实验引物扩增的DNA区域之间的距离必须大 于1000bp。
11.加入10μl 0.5M EDTA、20μl 1M Tris-HCl pH6.5、和2μl 20mg/ml 蛋白酶K，45℃孵育0.5-1小时；
12.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μl的ddH2O中，取1μl作模 板，按以下配方加样，PCR扩增实验组和对照组以及Input组的 GAPDH启动子序列，扩增条件95℃1分钟，95℃30秒、55℃30秒、 72℃30秒、30个循环，72℃5分钟，1.5%琼脂糖电泳检查结果。 ① 此步DNA纯化可以选择适当的DNA纯化试剂盒 ② PCR的策略
① 抗体的选择
② 对照的设置
① Beads的选择
利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA蛋白质-抗体复合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的 DNA片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质后， 用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。Magna beads是近 年来出现的一种新型beads，它使用方便，不像Agarose beads那样容易破裂，所以在操作过程中更简单，而且免去 了离心的步骤，节省不少时间。Millipore公司最新推出的 Magna ChIP试剂盒就是采用这种Magna beads。
超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生 泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。 所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时 断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深 入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时 间也不要太长，以免蛋白降解。
② 设置超声破碎的条件
6. 按照每2ml稀释后液体加入75μl的比例加入蛋白A-琼脂糖/鲑精DNA (50%混悬液)，4℃摇动30分钟，预处理，短暂离心(700-1000rpm 4℃，小于1分钟)，收集上清液；
① Beads的选择
② Input的设置
7. 向2ml上清液中加入适量的抗乙酰化组蛋白H3的抗体(20μl)，4℃摇 动过夜，阴性对照组不加抗体同样摇动过夜；
引物的设计依据通用的引物设计原则。有时为提高扩增产物的特异 性，可将引物终浓度降低5-10倍。大多数引物步需要纯化或特殊处理。 由于实际上扩增效率较低，扩增产物不应过长，以75-300bp为宜。
Co-IP和ChIP的区别
相互作用 检测对象 检测方法 裂解方式
固定剂 对抗体的要求
Co-IP
ChIP
蛋白-蛋白 蛋白质
3. 用500μl预热至室温带有蛋白酶抑制剂的SDS裂解液 重悬并裂解细胞，冰浴10分钟；
4. 超声波处理剪切染色质DNA，使其形成300-1000 bp 即大约相当于2-5个核小体长度的片段；
① 超声条件对实验的影响及超声注意事项 ② 设置超声破碎的条件 ③ 酶消化与超声消化相比较的区别
① 超声条件对实验的影响及超声注意事项
甲醛的作用
在各种交联试剂中，甲醛（HCHO）的应用最为广泛。甲醛的浓度、 作用时间及交联的温度等均可能影响交联的程度。甲醛可以通过赖氨酸、 精氨酸和组氨酸以及那些DNA的氨基和亚氨基基团之间的交联，高效地 在体内交联蛋白质-DNA、蛋白质-RNA以及蛋白质-蛋白质，形成生物复 合体，防止细胞内组分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠实地保留 染色质结构，而且在温和条件下交联很容易逆转。通常交联所用的甲醛 终浓度为1%，在12-37℃作用30min。但是如果反应温度超过30℃，本底 就可能增加。因此，当必须在高温进行交联时，则应减少作用时间或甲 醛浓度。过度交联将影响细胞的裂解，并且在超声处理时不能获得理想 长度的DNA片段及影响DNA的溶解。对于特别容易进行交联的目的蛋白 质（例如，组蛋白）需减少交联时间或甲醛浓度。甲醛的交联反应可被 加入的甘氨酸终止。
• 在狭义上，染色质重塑专指由ATP提供能量的、通过依赖 于ATP的染色质重塑复合物改变组蛋白与DNA的结合状 态，在靠近核心组蛋白的DNA表面建立特殊的构象，使 转录因子较易于接近DNA的过程。
染色质免疫沉淀技术的发展使染色质重塑研究得以进步
Biblioteka Baidu
实验目的
学习掌握染色质免疫沉淀技术的基本原理与关 键的操作步骤。
盐免疫复合物洗液、高盐免疫复合物洗液、LiCl免疫复合物洗 液洗涤沉淀各一次，每种液体每次用1ml，摇动3-5分钟后短暂 离心收集沉淀。然后用同样的方法用TE缓冲液洗涤沉淀两次
三、PCR鉴定结合于乙酰化组蛋白H3的DNA片段
10. 向上步所得沉淀中加入250μl洗脱液(1% SDS, 0.1M NaHCO3)， 震荡，室温孵育15分钟，离心收集上清；
染色质免疫沉淀
Chromatin immunoprecipitation
基因型决定表型
破坏了基因型也就改变了表型
但是，也有一些无法解释的现象
在相应的基因碱基序列没有发生变化的情 况下，一些生物体的表型却发生了改变。
什么是表观遗传学?
是DNA及其染色质环境的稳定改变，这些可遗传的 变化并不涉及DNA序列的突变。
Western blot/质谱 裂解液
蛋白-DNA DNA序列 PCR/芯片 超声；酶解
不需要固定剂
甲醛
比较高
更高（交联对抗原 表位的破坏）
免疫共沉淀和染色质免疫沉淀input设置
在进行免疫沉淀步骤前的样品
染色质免疫沉淀抗体的选择
ChIP Validated
② 对照的设置
ChIP实验至少应设立3种对照：①未经免疫沉淀的超声 处理样本（input）；②阳性对照。一般用组蛋白抗体或antiRNA Polymerase II抗体这些比较保守的在所有细胞中都能 结合基因的蛋白的抗体； ③阴性对照。即用一种无关抗体 （或相应动物的免疫前血清），与抗目的蛋白质抗体同时分 别与交联染色质样本进行免疫沉淀反应；④选择不与目的蛋 白质结合的基因组区域作对照，即“基因组对照”。