ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案

染色质免疫共沉淀(ChIP)实验具体方法及步骤

染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。

2. 37℃孵育10 min。

3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。

450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。

混匀后，在室温下放置5 min即可。

4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。

预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。

按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。

使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。

这样每100 ul溶液含1x106个细胞。

再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5x106个细胞。

本次细胞长得约为80%。

即为4x106个细胞。

因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。

将2管混在一起，共800 ul。

7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。

共14次。

二、除杂及抗体哺育（第一天）1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。

去除不溶物质。

2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。

3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

染色质与蛋白研究：染色质免疫共沉淀（ChIP）实验介绍（一）

染色质与蛋白研究：染色质免疫共沉淀（ChIP）实验介绍（一）前面的文章中已经向大家介绍了免疫共沉淀技术（IP）的原理和方法，这一技术可以帮助我们便捷地探究蛋白与蛋白之间的互相作用。

但若研究的靶蛋白可能发挥组蛋白修饰酶的功能，或是可能作为某种转录因子发挥作用，那么就要应用染色质免疫共沉淀技术（chromatin-immunoprecipitation，ChIP）方法来探究其与DNA 的直接调控了。

ChIP可以真实、完整地反映结合在DNA启动子区上的靶蛋白的调控信息，是目前基于全基因组水平研究DNA-蛋白质相互作用的标准实验技术。

接下来，我们一起来学习一下ChIP技术吧！1ChIP基本原理ChIP是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP不仅可以检测转录因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

基因的转录是从启动子区开始，由一系列的转录因子结合到基因的启动子区，通用转录因子结合在基本启动子区起始转录，而这个过程通常需要一些特异的转录因子结合在上游调节序列，使基因特异表达并维持的合适水平。

此外，基因的转录还会受到表观遗传的调控，如组蛋白甲基化修饰、乙酰化修饰等，组蛋白特异位点的修饰均可以直接影响基因的转录水平。

因此，ChIP主要用于研究特异的转录因子或组蛋白修饰酶与下游基因启动子区的结合，如果ChIP发现二者可以结合，那么这说明该基因可能是其下游基因。

要想进一步证明，还要做高低表达和荧光素酶等实验。

目前，ChIP与一些高通量测序的结合，扩大了其应用范围：比如，ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-ChIP已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP-Seq是将深度测序技术与ChIP实验相结合，可分析全基因组范围内DNA结合蛋白结合位点、组蛋白修饰、核小体定位或DNA甲基化的高通量方法，可以应用到任何基因组序列已知的物种，并能确切得到每一个片段的序列信息；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

免疫沉淀IP 免疫共沉淀coIP 染色体免疫沉淀ChIP

楼上说的准确的叫Co-IP。

IP就是免疫沉淀，没有“共”，哈哈。

其实楼主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗体，直接检测western,就可以了，为什么还要用IP以后的样品来检测，这是因为p-Pyk2商业化的抗体特异性不好，可能对p-FAK或其他类似的磷酸化蛋白有交叉，所以我们一般为了准确性，看其磷酸化的变化，就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来，在用4G10抗体来检测。

而且这个方法看的是Pyk2蛋白全部的磷酸化位点的情况，而p-Pyk2商业化抗体一般都是识别某一格Tyr磷酸化位点的，所以这两种试验是有本质区别的，这种方法还应用于很多Tyrosine kinase receptor磷酸化的检测，因为这些蛋白磷酸化位点都特别多哈：)免疫沉淀是指用抗体把抗原（包括单体、复合物）沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来研究蛋白质的相互作用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。

抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose 珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl 的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

免疫共沉淀实验流程--chip

染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告步骤一：样品准备试剂和仪器：Biopulverizer(biospec)37% formaldehyde甘氨酸(Glycine)PBSprotease inhibitors步骤二：细胞交联1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。

2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。

3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。

4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。

5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。

800Xg，4°C离心5min，小心去掉上清。

步骤三：细胞裂解试剂:裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;Tritonx -100 0.25%。

裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。

步骤:1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。

2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。

3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。

步骤四：超声破碎ＤＮＡ仪器:Bioruptor(Diagenode)步骤:(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。

(2)、在超声池中注入一定量的冰水。

ChIP实验常见问题解析

ChIP实验常见问题解析ChIP实验常见问题解析1.染色质免疫共沉淀(ChIP)实验中使用超声方法断裂染色质温度不易控制，可能会使蛋白变性，如何进行优化？染色质免疫共沉淀(ChIP)实验中超声的优化一般从如下几个方面考虑:（1）重复已发表文献中的剪切方案时建议进行优化。

尤其是当仪器不同于文献中所使用的仪器时。

（2）使用基于探头的超声破碎仪时，探头要适于样品体积。

（3）在任何情况下，剪切参数都应当根据样品体积、细胞密度和细胞类型而优化。

（4）优化应当包括功率设置（超声时间 vs. 间隙时间/休息时间）以及获得长度为200 – 1000 bp的DNA片段所需的剪切循环数，每个优化实验只优化一种参数；（5）注意时间和功率设置。

过度破碎和太高功率设置会损害在免疫沉淀步骤中的表位。

降低染色质免疫共沉淀（ChIP）信号。

（6）始终保持裂解液冰冷，间断超声（而非连续），因为超声处理产生热量会使染色质变性。

（7）在超声破碎过程中避免气泡。

泡沫会导致蛋白质的表面变性，可能使染色质损失在气泡中。

为了避免这种情况，一开始设为较低功率，再逐步提高。

（8）在优化条件时，每个超声破碎循环后通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的长度。

剪切不足所产生大的不溶复合物可能堵塞琼脂糖凝胶的孔，并延缓电泳过程。

通过消化蛋白质、逆转交联、酚:氯仿提取和沉淀来纯化DNA。

2.染色质免疫共沉淀（ChIP）实验研究转录因子，调控因子结合的DNA和组蛋白结合的DNA操作上最大的区别是什么？染色质免疫共沉淀（ChIP）实验中由于组蛋白在染色质中表达相对较高且较稳定，转录调控因子表达水平很低，往往是瞬时表达。

所以组蛋白相对研究起来更为容易，一般需要105-106个细胞即可完成一个染色质免疫共沉淀（ChIP）反应。

研究起始样本量（细胞，组织）要是组蛋白的10倍，一般每个反应至少需要107个细胞。

另外有些转录因子比较大，往往结合多个核小体，因此在染色质断裂的时候，不太适合使用酶法的处理方式，建议使用超声断裂染色质的方法。

染色质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP

染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP ChIP简介：ChIP是染⾊质免疫沉淀技术（Chromatin ImmunoPrecipitation assay）的简称，属于免疫沉淀技术的⼀种，⽤于检测蛋⽩质与DNA的相互作⽤。

染⾊质免疫沉淀技术的⼀个重要⽤途是研究某个转录因⼦A（可以是发⽣某些特定修饰，如磷酸化、⼄酰化等修饰的蛋⽩）是否调控其预期靶基因B的特定转录调控区（主要是启动⼦区域）。

下⾯就以利⽤ChIP研究转录因⼦对基因的调控为例进⾏阐释。

检测⽔平：转录⽔平调控原理及操作流程：染⾊质免疫沉淀技术的原理及⼀般操作流程为：1. 在活细胞状态下，使⽤交联剂（常为甲醛）将蛋⽩质-DNA复合物固定下来；2. 然后通过理化⽅法（常为酶消化法或者超声破碎）将这种复合物中的DNA随机切割为⼀定长度范围内的染⾊质⼩⽚段；3. 继续使⽤蛋⽩质A的特异性抗体I（⼀般要求ChIP级别）处理，将含有蛋⽩质A的蛋⽩质-DNA⽚段特异性标记；4. 再利⽤⼀种可以结合抗体的Protein A（⼀般偶联到分选柱和磁珠上，便于分离），将含有抗体的复合物从作⽤体系中富集分离出来，未被抗体标记的蛋⽩质-DNA则被洗脱去除；5. 将得到的抗体-蛋⽩质-DNA复合物解交联，纯化富集其中的DNA⽚段；6. 利⽤针对⽬的基因B转录调控区的特异性引物（⼀般设计多个位点，覆盖多个区域）进⾏PCR（以前多为半定量PCR，现在随着设备的升级，使⽤荧光定量PCR也逐渐普及）等⼿段检测，如果其中有PCR检出阳性则表明蛋⽩质A可以与基因B的转录调控区有结合（可以是直接也可以是间接结合，具体区分还需要进⾏进⼀步的EMSA检测），⽽具体的结合位点就在引物覆盖区域及其周边位置。

ChIP-on-chip衍⽣技术：ChIP-on-chip有时也称ChIP-chip，要注意其中的⼤⼩写因为它们代表的意义不同，其中前⼀个ChIP表⽰染⾊质免疫沉淀技术，后⼀个chip表⽰基因芯⽚技术。

ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案

ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案染色质免疫沉淀-芯片试剂盒染色质免疫沉淀(芯片)的完整溶液是研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。

其基本原理是将蛋白质-DNA复合物固定在活细胞状态，将其随机切割成一定长度范围内的小染色质片段，然后通过免疫学方法沉淀复合物，特异性富集与靶蛋白结合的DNA片段。

通过目标片段的纯化和检测，可以获得关于蛋白质和DNA之间相互作用的信息。

芯片不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态相互作用，还可以研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

此外，芯片与其他方法的结合扩大了其应用范围:通过芯片与基因芯片的结合建立的芯片-芯片法已广泛用于高通量筛选特异的反式因子靶基因；芯片结合体内足迹法寻找反式因子的体内结合位点；核糖核酸芯片用于研究核糖核酸在基因表达调控中的作用因此，随着ChIP的进一步完善，它必将在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

就目前国内研究状况而言，教师在研究领域有分化、转录、发育、诱导多能性、肿瘤干细胞、表观遗传学等。

会做ChIP实验，一些老师会自己购买抗体，手动配置试剂。

然而，因为实验本身具有复杂的实验步骤，并且其中许多步骤非常关键，需要更多的试剂，所以很容易导致配置之间的错误，并且实验周期长。

如果没有设置阴性和阳性对照，结果就无法分析，从而导致无休止的混乱。

经典染色质免疫沉淀(ChIP)试剂盒(p-2002):提供细胞样品上染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂此外，试剂盒包含阳性对照抗体(核糖核酸聚合酶2抗体)、阴性对照抗体(正常小鼠的IgG)和GAPDH引物(可用作阳性对照，以确保试剂盒中的试剂和操作步骤没有问题)在大多数生长中的哺乳动物细胞中，核酸聚合酶II富集在GAPDH基因启动子上，为启动转录做准备，因此启动子可以与核酸聚合酶II进行免疫沉淀反应，但不能与正常的小鼠IgG进行免疫沉淀反应。

在该染色质免疫沉淀反应中，细胞与甲醛偶联以提取其中的染色质染色质被适当破坏，然后加入微孔中，与吸附在微孔表面的抗体反应特异性结合在微孔上的DNA从抗体-捕获蛋白-DNA复合物中释放出来，通过我们公司专门设计的高速离心柱进行翻转和纯化。

CHIP(染色质免疫共沉淀)

一、超声剪切染色质1.用37℃预温的1%PFA固定10-20min，使DNA与蛋白质交联2.终止交联，加入终浓度为0.125M的甘氨酸3.用预冷的PBS洗2次4.用PBS将细胞刮下（5mlPBS+1mMPMSF+1mg/ml抑肽酶）5.4500rpm5min（此阶段细胞沉淀可储存于-80℃）6.弃上清，按200ul/106个细胞加入SDS lysis buffer（现加PMSF&coktail），冰上10min（4℃rotation 30min）7.27G针头注射器吹打3遍，若有气泡离心8.超声：不可有气泡，超两次后放到冰上9.离心：4℃，12000rpm，20min，上清转移到15ml离心管二、Ab沉淀目的染色质1.用dilution buffer稀释至1ml2.取50ul Input（也可取少量做lgG阴性对照，RNaseⅡ阴性对照）备注：取450ul做lgGcontrol，剩余500ul3.剩下的加一抗（5ul/ml），4℃rotate过夜4.向样品中加入50ul ProteinA+Gbeads，4℃rotate2h，之后可在冰上沉淀一会5.离心，1000rpm1min，留上清6.洗珠子，1ml/5min/次，在4℃rotate，再在冰上静置5min，1000rpm1min。

洗涤顺序为：低盐溶液→高盐溶液→LicL（之前在4℃）→TE→TE（室温）三、去除蛋白质1.Elution buffer（1%SDS、0.1MNaHCO3；0.5gSDS，0.42gNaHCO3 in 50ml ddH20）+250uL RT15min rotate →离心1000rpm1min→上清（收集）→+250ulRT 10min →金属65℃5min→上清（收集）2.上清+20ul5M NaClInput+450ul elution buffer+20ul 5M NaCl65℃6-7h或过夜3.10ul0.5MEDTA,20ul1MTris-HCl +2ul 10mg/ml 蛋白酶K（50℃1h）？四、提纯DNA1.加等体积（500ul）Tris-饱和酚，剧烈混匀，14500rpm10min，取上清，加入500ulCHCl3混匀后14500rpm10min，取上清后再加入tRNA60ug （200ug/ml，3ul），加异丙醇500ul，离心14500rpm20min 弃上清2.加70%酒精洗一遍，14500rpm5min，（要去掉上清，先倒掉，倒掉之后离心一下再扔掉液体）将管子倒扣空气晾干。

植物染色质免疫沉淀分析(CHIP)试剂盒

植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒产品说明书主要用途植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂是一种旨在通过甲醛交联、物理或化学处理细胞核以及染色质，从而运用特异抗体结合免疫沉淀，然后萃取DNA，扩增分析，来确定结合蛋白的目标DNA序列的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。

其适用于DNA复制、重组、修复、转录、病毒组装中的DNA和蛋白质（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的相互作用的研究。

广泛应用于定性检测各种植物组织（花瓣、叶片、种子等）DNA蛋白结合序列和定量检测序列特异性DNA结合蛋白（例如转录因子）及其突变形成等。

产品即到即用，性能稳定，操作便捷，反应敏感，结合显著，重复性好。

技术背景DNA和蛋白质的相互作用是调控细胞反应过程的要素之一。

染色质免疫沉淀分析方法（chromatin immunoprecipitation；CHIP）是研究活体内（in vivo）DNA和蛋白质的相互作用的最新最有力的工具：用于分析染色质结构动力学、转录因子调节、以及表观遗传学变异等。

CHIP技术通过三大步骤实现：第一，甲醛固定后染色质分离和断片；第二，运用特异蛋白之抗体，免疫共沉淀结合蛋白（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的染色质片断；第三，分析目标DNA和蛋白的修饰。

其中转录因子作为调节蛋白，通过结合核DNA，以达到控制基因表达。

产品内容清理液（Reagent A）毫升固着液（Reagent B）毫升终止液（Reagent C）毫升裂解液A（Reagent D）毫升裂解液B（Reagent E）毫升裂解液C（Reagent F）毫升核溶液（Reagent G）毫升稀释液（Reagent H）毫升结合液（Reagent I）毫升低盐液（Reagent J）毫升高盐液（Reagent K）毫升平衡液（Reagent L）毫升缓冲液（Reagent M）毫升洗脱液（Reagent N）毫升解联液（Reagent O）毫升酶解液（Reagent P）微升萃取液（Reagent Q）毫升浓缩液（Reagent R）毫升沉淀液（Reagent S）毫升净化液（Reagent T）毫升扩增液（Reagent U）微升补充液（Reagent V）毫升说明书1份保存方式保存裂解液A（Reagent D）、裂解液B（Reagent E）、裂解液C（Reagent F）、核溶液（Reagent G）、稀释液（Reagent H）、结合液（Reagent I）、解联液（Reagent O）、酶解液（Reagent P）、萃取液（Reagent Q）、浓缩液（Reagent R）和扩增液（Reagent U）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月用户自备特异抗体：用于目标蛋白的结合特异引物：用于目标DNA的扩增或测序1.5毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器2毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器50毫升锥形离心管：用于植物组织处理的容器恒温水槽：用于孵育反应物震荡器：用于混匀反应物4℃微型台式离心机：用于沉淀样品4℃台式离心机：用于沉淀样品平式摇荡仪或摇床：用于孵育和混匀反应DOUNCE匀浆器：用于裂解植物组织细胞超声仪：用于裂解植物组织细胞核PCR仪：用于扩增反应电泳仪：用于检测扩增产物实验步骤实验开始前，准备好待测植物的预处理：药物处理等。

染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。

由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。

这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。

当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA 或RNA）之间会产生共价键。

细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。

但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。

此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。

例如RIP （其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。

第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。

（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。

染色质免疫共沉淀ChIP中文操作流程

染色质免疫共沉淀ChIP中文操作流程1.细胞中加入1%的甲醛，8ml的培养液加入216 ul的甲醛，37度十分钟。

2.配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml3.将细胞拿出来，迅速的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。

胰酶消化20秒，加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。

用细胞刮刀把细胞刮下，收集到1.5ml 的离心管里面。

4.4度2000rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。

吹打重悬细胞，冰上孵育１０分钟。

5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。

6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一个新的2ml的离心管，弃沉淀。

7.稀释超声后的上清液到10X的CHIP稀释液，200ul的上清液加入1.8ml的CHIP稀释液，达到最终体积2ml。

8.为去除非特异性，加入75ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，4度旋转30分钟。

9.1000rpm离心3min沉淀Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，收集上清液。

10.上清液加入1抗，4度振荡过夜。

11.加60ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，沉淀抗体/抗原复合物，4度旋转一小时。

12.1000rpm 4度3min收集沉底，移除上清液，开始洗脱过程。

13.低盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀14.高盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀15.Licl免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀16.TE Buffer，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀，两次17.现在得到的是protein A/antibody/histone/DNA complex，新制备elution buffer (1%SDS,0.1M NaHCO3)。

CHIP染色质免疫共沉淀实验 Protocol

CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种在全基因组水平上研究蛋白质与DNA相互作用的技术方法。

其实验原理是基于抗原抗体反应的特异性，从而实现对DNA结合蛋白及其DNA靶标的富集。

实验所需试剂和耗材包括：细胞培养及提取试剂、生物素标记试剂盒、抗体、蛋白质A琼脂糖珠、Triton X-100、ECL显影液等。

实验仪器包括：二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机、染色质免疫沉淀仪等。

实验准备工作的要点包括：首先，要确认所用试剂和耗材的型号和保质期；其次，要确保细胞株和抗体的选择合适；最后，准备好实验所需的仪器设备并调试至最佳状态。

实验方法主要包括以下步骤：1.将细胞进行培养并提取染色质。

2.在染色质中加入对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，并用Triton X-100将抗原抗体混合物进行稀释。

3.在混合物中加入蛋白质A琼脂糖珠，以便吸附多余的抗体和未结合的蛋白质。

4.用洗涤液洗涤沉淀物，去除未结合的蛋白质和抗体，最后用变性液洗脱DNA。

5.用电泳法和显影法检测提取出的DNA片段。

注意事项包括：要保持细胞生长状态良好，并确保抗原抗体反应的时间和温度准确适宜；在加入蛋白质A琼脂糖珠后，要充分混匀以避免影响实验结果；最后，要注意控制好电泳参数和显影条件以保证结果的准确性和可靠性。

常见问题及解决方法包括：如果抗原抗体反应不充分，可以尝试增加抗体浓度或延长反应时间；如果未结合的蛋白质不能被有效清除，可以尝试增加洗涤次数或更换洗涤液；如果电泳条带不清晰或出现异常，可以尝试调整电泳参数或更换电泳液。

总之，CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种研究蛋白质与DNA相互作用的有效方法，需要注意保持细胞生长状态良好、准确控制抗原抗体反应条件、充分洗涤未结合的蛋白质等关键点。

同时，针对实验中可能遇到的问题，要积极采取相应的解决方法，以保证实验结果的准确性和可靠性。

热点实验：CHIP染色质免疫共沉淀实验案例介绍

背景：真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。

与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP）能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。

原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA复合物，超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA复合物，通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测（PCR分析），从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

应用：1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA损伤与凋亡分析。

步骤：1）甲醛处理细胞2）收集细胞，超声破碎3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合4）加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，沉淀5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物7）解交联，纯化富集的DNA-片断8）PCR或基因芯片分析。

实验案例证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合实验背景：在IL－6诱导条件下,利用CHiP技术提取C/EBP－DNA复合物，以Tmub1基因的碱基序列设计引物，以提取的DNA为底物，进行扩增，从而证明C/EBP结合的DNA含有Tmub1基因，进一步确认C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的相互作用。

实验分组：分2个组进行实验普通PCR检测和WB检测（检测Tmub1蛋白表达水平，抗体嘉美生物实验室提供。

注：嘉美生物实验室提供绝大多数常用国外原装进口抗体，为实验委托者节约大量实验经费。

）第一组：A组第二组：B组转染3天后收集细胞做CHIP-PCR以及WB检测实验对照：设定的对照有1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II）2、INPUT对照（DNA片段在沉淀以前，收集下来的对照）3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附，Normal Mouse IgG）细胞转染流程:略EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀实验检测流程（Upstste Catalog # 17-371)1、Kit Description：试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体2、试剂盒组分：A. Provided Kit ComponentsStore at 4℃:ChIP Blocked Protein G Agarose 1.5 mlChIP Dilution Buffer, One vial containing 24 mlLow Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlHigh Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlLiCl Immune Complex Wash Buffer 24 mlTE Buffer 24 ml0.5 M EDTA 250 ul5 M NaCl 500 ulSDS Lysis Buffer 10 ml1 M Tris-HCl, pH 6.5 500 ul10X Glycine 11 ml10X PBS 24 mlStore at -20℃:Protease Inhibitor Cocktail II（蛋白酶抑制剂） 2×110 ulRNase A 600 ug of RNase A in 60 ulsterile water.Proteinase K 600 ug of Proteinase K in 60 ul 1M NaHCO3 600 ulAnti-RNA Polymerase II 25ug clone CTD4H8.Normal rat IgGStore at Room Temperature:20% SDS 242 ul of 20% SDS.Spin Filters One bag containing 22 Spin Filters with Collection TubesCollection Tubes 22 Collection Tubes.Bind Reagent A 25 ml of Bind Reagent A.Wash Reagent B 12.5 ml of Wash Reagent B.Elution Reagent C 1.5 ml of Elution Reagent C.B. 抗体及血清特异性抗体：Anti-CEBP Beta antibody [E299] (ab32358,嘉美生物提供)Normal rat IgGC. 仪器设备微量混匀器Vortex mixer,震摇器Rotating wheel/platform.计时器Timer,可调微量加样枪以及tip头，Variable volume (5-1000 ml) pipettes + tips高速离心机Microfuge,Variable temperature water bath,细胞刮子Cell scraper,Sonicator,1.5 Ml离心管Microfuge tubes,PCR管PCR tubes,D. 引物设计略4、CHIP 操作流程A. 细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解预先准备：1) 准备细胞，150 mm培养瓶（20ml培养液）密度为80-90%，细胞数量≥1 x 10-7个；2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培养皿以冰块预冷；3) 取出SDS Lysis Buffer，放置至常温确保SDS溶解不析出；4) Protease Inhibitor Cocktail II恢复至室温。

染色质免疫共沉淀(ChIP)实验

染色质免疫共沉淀（ChIP）染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。

1实验方法原理：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

2实验材料、试剂、仪器耗材：细胞样品甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒等离心管、超声仪、电泳仪、离心机等3实验步骤：一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。

2. 37℃孵育10 min。

3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。

450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。

混匀后，在室温下放置5 min即可。

4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。

预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。

按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。

使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。

这样每100 ul溶液含1×106个细胞。

再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5×106个细胞。

本次细胞长得约为80%。

即为4×106个细胞。

因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。

植物染色质免疫沉淀分析(CHIP)试剂盒

植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒产品说明书主要用途植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂是一种旨在通过甲醛交联、物理或化学处理细胞核以及染色质，从而运用特异抗体结合免疫沉淀，然后萃取DNA，扩增分析，来确定结合蛋白的目标DNA序列的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。

其适用于DNA复制、重组、修复、转录、病毒组装中的DNA和蛋白质（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的相互作用的研究。

广泛应用于定性检测各种植物组织（花瓣、叶片、种子等）DNA蛋白结合序列和定量检测序列特异性DNA结合蛋白（例如转录因子）及其突变形成等。

产品即到即用，性能稳定，操作便捷，反应敏感，结合显著，重复性好。

技术背景DNA和蛋白质的相互作用是调控细胞反应过程的要素之一。

染色质免疫沉淀分析方法（chromatin immunoprecipitation；CHIP）是研究活体内（in vivo）DNA和蛋白质的相互作用的最新最有力的工具：用于分析染色质结构动力学、转录因子调节、以及表观遗传学变异等。

CHIP技术通过三大步骤实现：第一，甲醛固定后染色质分离和断片；第二，运用特异蛋白之抗体，免疫共沉淀结合蛋白（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的染色质片断；第三，分析目标DNA和蛋白的修饰。

其中转录因子作为调节蛋白，通过结合核DNA，以达到控制基因表达。

产品内容清理液（Reagent A）毫升固着液（Reagent B）毫升终止液（Reagent C）毫升裂解液A（Reagent D）毫升裂解液B（Reagent E）毫升裂解液C（Reagent F）毫升核溶液（Reagent G）毫升稀释液（Reagent H）毫升结合液（Reagent I）毫升低盐液（Reagent J）毫升高盐液（Reagent K）毫升平衡液（Reagent L）毫升缓冲液（Reagent M）毫升洗脱液（Reagent N）毫升解联液（Reagent O）毫升酶解液（Reagent P）微升萃取液（Reagent Q）毫升浓缩液（Reagent R）毫升沉淀液（Reagent S）毫升净化液（Reagent T）毫升扩增液（Reagent U）微升补充液（Reagent V）毫升说明书1份保存方式保存裂解液A（Reagent D）、裂解液B（Reagent E）、裂解液C（Reagent F）、核溶液（Reagent G）、稀释液（Reagent H）、结合液（Reagent I）、解联液（Reagent O）、酶解液（Reagent P）、萃取液（Reagent Q）、浓缩液（Reagent R）和扩增液（Reagent U）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月用户自备特异抗体：用于目标蛋白的结合特异引物：用于目标DNA的扩增或测序1.5毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器2毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器50毫升锥形离心管：用于植物组织处理的容器恒温水槽：用于孵育反应物震荡器：用于混匀反应物4℃微型台式离心机：用于沉淀样品4℃台式离心机：用于沉淀样品平式摇荡仪或摇床：用于孵育和混匀反应DOUNCE匀浆器：用于裂解植物组织细胞超声仪：用于裂解植物组织细胞核PCR仪：用于扩增反应电泳仪：用于检测扩增产物实验步骤实验开始前，准备好待测植物的预处理：药物处理等。

染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 DNA实验技术方法汇总

染色质免疫共沉淀（ChIP）染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。

1实验方法原理：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

2实验材料、试剂、仪器耗材：细胞样品甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒等离心管、超声仪、电泳仪、离心机等3实验步骤：一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。

2. 37℃孵育10 min。

3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。

450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。

混匀后，在室温下放置5 min即可。

4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。

预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。

按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。

使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。

这样每100 ul溶液含1×106个细胞。

再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5×106个细胞。

本次细胞长得约为80%。

即为4×106个细胞。

因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。

染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验流程（转）

染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）实验流程（转）⼀. 实验前准备：1. 实验设计与分组2. 实验试剂、耗材、仪器准备3. 试剂盒：Pierce™ Agarose chip Kit⼆. 实验开展：(以哺乳动物贴壁细胞为例)A. 交联与细胞裂解1. ⽤15cm培养⽫培养细胞，细胞量达80%-90%，细胞数量约为1x107 个，待⽤。

以下步骤基于1次ChIP试验2. 交联：向每个含有培养液的培养⽫中，加⼊16%的甲醛，使甲醛终浓度为1%. 轻轻晃动培养⽫, 使混匀, 室温孵育10min. (交联时间很重要，过长影响ChIP结果，过短交联不完全，产⽣假阳性)3. 终⽌交联：向上述培养⽫中，加⼊10X的⽢氨酸溶液使其终浓度为1X的。

混匀，室温孵育5min。

4. 吸出培养⽫中含有甲醛-⽢氨酸的混合培养基。

⽤1倍体积预冷的PBS清洗细胞两次。

5. 在1ml预冷的PBS加10ul的Halt Cocktail。

然后将此混合液加⼊清洗后细胞中，再⽤细胞刮搜集细胞，将细胞悬浮液⽤移液器转移到1.5m的微管离⼼管中。

6. 将搜集的细胞于3000g离⼼5min。

除去PBS，将细胞沉淀物保存在-80°，或者直接进⾏⼀下步骤：酶解附：蛋⽩量检测：WBB. 酶解断裂染⾊质1. 准备好上述交联好的细胞。

如果是冻存的，需在冰上解冻。

2.加100ul含蛋⽩酶抑制剂的Lysis Buffer 1⾄细胞沉淀物中吹打混匀，涡漩离⼼管15s，置于冰上孵育10min;9000g离⼼3min，弃除上清。

3. 加0.25ul的Micrococcal Nuclease (ChIP级) (10 U/µL)，涡漩离⼼管，在37°⽔浴锅温浴15min，每5min 颠倒混匀;4. 加10µl的MNase stop 溶液终⽌反应，短暂涡漩混匀，冰上孵育5min。

5. 9000g离⼼5min，去上清，重新获得核酸复合物。

6. ⽤50µl的含(蛋⽩酶/磷酸蛋⽩酶)抑制剂的Lysis Buffer 2重悬核酸复合物，置于冰上15min，每5min涡旋15s。

染色质免疫沉淀分析——植物ChIP解决方案

染色质免疫沉淀分析——植物ChIP解决方案染色质免疫沉淀分析(ChIP) 是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的比较好的一种方法。

so，我们今天来聊聊染色质免疫沉淀分析方法。

染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。

它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。

CHIP技术通过三大步骤实现：第一，甲醛固定后染色质分离和断片；第二，运用特异蛋白质抗体（CHIP级别），免疫共沉淀结合蛋白的染色质片段；第三，分析目标DNA。

这里我们就要说到CHIP技术工具之——植物染色质免疫沉淀试剂盒了。

它的原理是什么呢？不妨以P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒来举个栗子~~P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒旨在通过甲醛交联、物理或化学处理细胞核以及染色质，从而运用特异抗体结合蛋白进行免疫沉淀，然后萃取DNA，扩增分析，用以确定结合蛋白的目标DNA。

接下来再说说它的特征，P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒涵盖全套试剂，允许试验者有效地在体内研究蛋白-DNA相互关系。

整个过程可以在6小时内完成（哇哦，厉害了~）当然了，还有相当重要的一点：P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒适用于将特异性免疫沉淀与定性和定量PCR、MS-PCR、ChIP-Seq、ChIP-on-chip结合使用。

欧迈噶！P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒包括一个ChIP级二甲基组蛋白H3-K9抗体--阳性对照，以及一个正常小鼠IgG——阴性对照。

从染色质从样本中释放出来后，经剪切、断片，添加到包被了抗体的微孔中，蛋白质-DNA复合物经特异性抗体捕获，解交联后DNA被释放，通过离心柱，纯化并洗脱目的DNA。

洗脱下来的DNA可用于各种下游应用。

接着看看样本，起始材料可包括各种植物组织（花、叶、幼苗）。

染色质免疫共沉淀XChIP实验设计

染色质免疫共沉淀 X ChIP 实验设计ChIP是一种强大的确定蛋白或者组蛋白修饰在基因组上定位的实验方法。

染色质被分离出来后采用抗体与抗原的结合来判定目的蛋白是否结合在特定的DNA序列上或者判定目的蛋白结合位点在全基因组范围的分布(微阵列或DNA序列)。

这种方法具有空间性与时效性。

该实验设计为如何在细胞中进行ChIP实验提供了详细的步骤。

1交联和细胞收获。

甲醛可以将蛋白质交联到DNA上。

交联结果的好坏决定于交联时间的把握。

-30分钟。

过度的交联会减少抗原的结合性和我们建议样品交联的时间一般为2超声断裂的效率。

抗原决定簇也会被掩盖。

加入甘氨酸可以消除甲醛使交联反应终止。

1.准备两个长满细胞的150cm2的细胞培养皿(1*107-5*107个细胞/皿)。

将甲醛直接滴入PBS洗过的细胞培养皿中，使其终浓度为0.75%，然后在室温缓慢旋转10分钟，使蛋白和DNA发生交联。

2加入甘氨酸使其终浓度为125mM,在室温晃动孵育5分钟。

3使用10ml预冷PBS清洗细胞2次4使用细胞刮将细胞收获放入5ml预冷PBS中，并转入50ml的管子。

5.在皿里加入3mlPBS，将剩余的细胞转移到50ml管子里6 1，000g离心5分钟7.将上清倒去，使用FA裂解液将沉淀重悬浮(1x107cells/750μl).初始细胞要有1*107-5*107个，采用终浓度为0.75%甲醛和如上描述的甘氨酸处理。

预冷PBS洗3次，1，000g离心5分钟，沉淀用FA裂解液重悬浮。

2。

超声破碎超声裂解细胞悬液可以将DNA均一的打断成500-1000bp的片段。

不同的细胞系需要不同的超声时间才能达到最优效果。

交联细胞要通过时间梯度的超声来选择最优超声条件。

样品通过时间梯度，DNA的分离如部分3所描述。

片段大小序在1.5%的琼脂糖凝胶上检测分析。

如图一所示图一:2超声破碎后，8，000g，30秒，4?C,离心。

将上清移入新的管子中。

开始准备进行染色质免疫共沉淀(IP)。