组织免疫荧光染色protocol
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
切片免疫荧光染色是一种常用的生物学实验方法，用于研究组织或细
胞样本中的特定蛋白质标记。下面是一般的切片免疫荧光染色的具体步骤：步骤一：取样
步骤二：切片
将固定的组织样本或细胞样本进行切片处理。可以使用切片刀或者切
片机来获得薄片。切片的厚度往往是几微米到几百微米。切片完成后，可
以将其放在载玻片上。
步骤三：预处理
载玻片上的切片需要进行一些预处理步骤，以去除可能会影响后续染
色的物质，如脂质或其他杂质。预处理步骤可能会包括洗涤、脱水和透明
化等。
步骤四：抗原修复
细胞或组织样本中的抗原有时会受到固定过程的影响，使得抗原无法
与抗体结合。因此，需要进行抗原修复步骤来恢复抗原的免疫原性。抗原
修复可以通过热处理、酸碱处理或酶解等方式进行。
步骤五：阻断非特异结合物
为了减少非特异抗体的结合，需要使用一种阻断剂来防止非特异结合。典型的阻断剂包括牛血清蛋白、胎牛血清等。阻断剂可以在洗涤缓冲液中
加入。
步骤六：初级抗体染色
在预处理和阻断步骤之后，将含有特定初级抗体的溶液加到样本上，进行孵育。初级抗体是特异性结合到目标蛋白质的抗体。孵育时间和温度可以根据实验的需要来确定。
步骤七：洗涤
之后，用缓冲液洗涤样本，将未结合的抗体和杂质去除。洗涤是非常重要的步骤，可以通过多次洗涤来提高特异性和背景的对比度。
步骤八：二级抗体染色
二级抗体通常是带有荧光标记的抗体。与初级抗体相比，二级抗体对特定的初级抗体更具选择性，并且能够增强荧光染色的信号。将含有二级抗体的溶液加到样本上，进行孵育。
步骤九：洗涤
与前面的步骤类似，需要用缓冲液洗涤样本，去除未结合的二级抗体和杂质。
免疫荧光最全攻略：从protocol到问题解决
免疫荧光最全攻略：从protocol到问题解决免疫荧光（Immunofluorescence）：简称IF，与western blotting一样，也是根据抗原抗体反应的原理，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体或抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下进行观察，从而确定抗原或抗体的性质和定位，包括直接法和间接法。
一、实验步骤
1. 样品准备（贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等）
（1）对于贴壁细胞：
先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无
菌 PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。
（2）对于悬浮细胞：有2种方法，
①先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。
②先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。
（3）对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。
（4）对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。
2、固定（防止离体组织自溶抗原扩散）
固定液包括：有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）；交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，不过，目前甲醛用的还是最多的，但
针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的
无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。
固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。
贴壁细胞的免疫荧光染色方法（Pr...
贴壁细胞的免疫荧光染色方法（Pr...
贴壁细胞的免疫荧光染色方法
（Protocol of Immunofluorescence (IF) on attached cells）Materials:
1. PBS solution
2. 4% Paraformaldehyde (PFA fixative):
Dissolve 4g paraformaldehyde in 100ml PBS solution, stir at 70℃ to dissolve;
3. PBS-T solution: (0.1% Triton X-100 in PBS solution)
4. PBS-B blocking solution: (4% BSA in PBS solution)
5. Primary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual, or, test from 1:50~200, should be more concentrate than application in Western blot;
6. Secondary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual Procedure:
1. Cultured cells, let it attach to the coverslips in 6-well plate;
组织-免疫荧光染色
组织免疫荧光步骤：
1）取出切片，用 M PBS冲洗5min×3次；
2）滴加10%正常山羊血清37℃封闭45 min；
3）吸去多余液体，加入抗TSHR的一抗（1：100），放入湿盒中，37℃孵育1h后置于4℃冰箱中过夜（保持在湿盒中）；
4） M PBS冲洗5min×3次；
（至下一步开始要适度避光操作，防荧光淬灭！）
5）在黑暗条件下加入山羊抗兔IgG-FITC（1：200），37℃温育45 min；6）在黑暗条件下吸弃二抗 (注：不再冲洗)，加入DAPI染液（μg/ml），室温作用20 min；
7）在黑暗条件下 PBS冲洗5min×6次；
8）在黑暗条件下防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察，用合适波段激发，照相保存实验结果。
核实好下边的问题你就可以操作了：
1、准备 M PBS 500 ml，冲洗时动作既要轻柔防脱片，又要保证冲洗
彻底；
2、抗TSHR的一抗用1：100，用抗体稀释液稀释；
3、实验室有没有山羊抗兔IgG-FITC，使用浓度是1：200；
4、DAPI染液（μg/ml）实验室有吗
5、防荧光淬灭剂封片实验室有吗
免疫荧光和免疫组化
免疫荧光和免疫组化
问题如下：
1. 免疫荧光好还是做免疫组化好？我倾向于做免疫组化，但老板倾向做荧光，我想两种方法都了解一下，能否介绍一下两种方法的详细步骤（protocol）。
2. 一抗、二抗抗体（包括荧光抗体）如何选择，哪个公司的比较好？浓度怎么掌握？
其实IHC和IFC本质都是一样的。只是最后的显色方法不一样，IHC是用酶加底物进行显色反应，用普通光镜观察；IFC是直接用带有荧光物质连接的二抗与一抗结合，在相应波长的激发光下观察。
我也倾向于IHC，理由如下：
IHC的级联放大作用使得抗原比较少的组织也能有很强的着色。我一般用Vector公司的Elite系列ABC kit，HRP－DAB显色系统。
IHC的切片可以长期保存。很多时候试验做出来了，需要反复的看片子。而IFC的有荧光猝灭，无法长久保存。所以不利于反复阅片。
IFC有利于做Multiple Labeling，比如在同一location的两种或多种抗原的比较，通常用IFC；IFC还多用于活细胞的staining，但如果是石蜡切片，总会有一些自发荧光现象存在。所以个人认为，能用IHC的时候建议不用IFC。
详细protocol请在本版内search一下，已经有很多的讨论了。
一抗通常买DAKO、SIGMA、VECTOR，二抗可以选择相应公司的，也可以买SANTA CRUZ的，比较便宜一些。荧光二抗建议买
Molecular Probe的，现在和Invitrogen合并了。
浓度先参考data sheet上的，不过还是自己要optimize一下，比如建立个浓度梯度。阴性对照用相同种属来源动物的IgG。
IF protocol免疫荧光
IF
1、将皿取出，吸出培液（泵档位不超过中间档），RT PBS快速洗1次；
2、（预通透0.5%Triton 30s，超45s会飘）；
3、固定：4%PFA+PBS，RT 15min（现配，也可-20℃保存）（现配时70℃水浴溶解至无粉末再降至RT，最好过滤）；
4、PBS洗一次；
5、通透：PBS+0.5%Triton RT 10~15min；
6、PBS洗一次；
7、4%BSA+TBST，RT Block 1h（BSA易生菌，最好不要4℃过夜）；
8、4%BSA+TBST+一抗，RT 2h或4度过夜；（上抗体从边缘加）
9、4%BSA+TBST洗3次，每次5min；
10、4%BSA+TBST+二抗，RT 1h（避光）（DAPI在这一步与二抗一起染）；
11、TBST洗3次，每次5min；
13、封片：载玻片上标记好，滴加封片剂Dako或Prolong，将盖玻片倾斜慢慢放下，尽量减少气泡；
14、温室避光过夜晾干，油镜下观察，拍照。
其他：
1、固定、通透完后，可在75%乙醇中保存1个月以上；启用时，用PBS洗3次，每次15min；
2、PBS（phosphate buffer saline）：磷酸缓冲盐溶液，pH7.2～7.4；
4、BSA（bovine serum albumin）：牛血清白蛋白
5、PFA：多聚甲醛，通过交联固定细胞；
6、Tween-20：非离子型去污剂，有复性抗原的作用（洗去低亲和、非特异蛋白），可提高特异性的识别能力；
7、Triton X-100：聚乙二醇辛基苯基醚，非离子型去污剂，能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性；
免疫荧光protocol
免疫荧光protocol
1、固定：用4%的多聚甲醛（PFA）在室温下固定15min；
2、用PBS洗三次，每次5min；
3、用封闭液（5%BSA+0.3%-0.5%triton，定位于细胞浆和细胞核的
蛋白要用triton，封闭液用PBS配制即可）在室温下封闭1h；
4、移除封闭液，加入一抗（一抗用1%BSA稀释），置于4度孵育过
夜；
5、用PBS洗三次，每次至少5min（这样背景没那么深）；
6、加入二抗（1:100/1:200，二抗用1%BSA），在室温下避光孵育
1h（1h-2h）；
7、用PBS洗三次，避光，每次至少5min；，
8、PI（1:100）或Hochest（1:2000-1:5000）（用PBS稀释即可）
染核10min，避光；
9、用PBS洗三次，避光，每次至少5min；
10、DABCO封片，避光；
11、荧光观察。
角膜整铺片免疫荧光染色protocol
角膜整铺片免疫荧光染色protocol
实验器材：手术显微镜（Topcon OMS-90），4℃冰箱
角膜剪1把，无齿显微镊2把，90mm玻璃平皿，11#手术刀片2个，1.5mlEP管，EP管架、棉签，记号笔，移液器（规格1ml,100ul,10ul各一把，Gilson)，无菌枪头（规格1ml,100ul,10ul）、10ml无菌玻璃瓶和橡胶塞，50mL烧杯，一次性塑料吸管，封口膜，清洁载玻片，0.17um 清洁盖玻片，吸水滤纸，避光片盒、记录纸笔。
实验试剂：1、D-PBS（Kcl 0.2g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4·12H2O 2.8976g,Nacl 8g,D-Glucose 1g 溶解于1000ml 注射用水，调节PH7.2-7.4）
2、TritonX-100(solarbio）（平常配制成10%储备液，9mlD-PBS+1mlTritonX-100，保存于4℃冰箱，临用前用2%BSA稀释成0.2%Triton-BSA)
3、BSA（Roche 分装）(可配制成2%BSA溶液：称取2gBSA粉末溶解于100mlD-PBS溶液内，完全溶解后分装至10ml玻璃瓶内，每瓶5ml，封口标记后冻存于-21℃备用，临用前溶解即可）
4、固定液：4%多聚甲醛（称取4g多聚甲醛固体溶解于100mlD-PBS溶液内，60℃水浴促溶，完全溶解后封口标记，保存于4℃冰箱备用，2周内使用）后来张老师查资料，不宜放置4℃冰箱，否则会有析出，室温放置即可。使用之前4℃预冷。
AF固定液（95％乙醇90ml+甲醛原液10ml，易挥发，注意密封，保存于4℃冰箱备用，2周内使用）
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo—1的免疫荧光，步骤如下：
1、细胞在盖片上生长融合到95%—100％时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟
3、4%的甲醛室温固定20-30分钟
4、1×PBS洗3次，每次10分钟
5、0.2％Triton X-100透化2—5分钟
6、1×PBS洗3次，每次10分钟
7、5％BSA室温封闭30分钟
8、加一抗（用1%BSA稀释）放在湿盒里,4度过夜
9、1×PBS洗3次,每次10分钟
10、加二抗(用1％BSA稀释)30分钟，闭光！！！
11、1×PBS洗3次，每次10分钟
12、95％甘油封片
注：4%甲醛,0.2%Triton，5％BSA均用1×PBS稀释
从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光
细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1。取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里,PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3。 0.2%Triton X-100通透10分钟,PBS洗三遍。
4。与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
组织-免疫荧光染色protocol
组织-免疫荧光染色protocol
免疫荧光染色技术是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的分布和表达水平。本文将介绍一种通用的组织免疫荧光染色协议。
实验材料
•甲醛（37％）
•磷酸缓冲液（PBS）
•甲醛溶液（4％）
•阻止血清（10%）
•抗体（一抗和二抗）
•DAPI荧光染色试剂盒
•荧光显微镜
实验步骤
1. 组织采集和固定
采集所需组织，配制4％甲醛溶液，将组织浸泡在甲醛溶液中定期搅拌，一般固定2小时，以防止过度固定。然后用PBS洗涤组织，重复3次，并将组织在PBS中存放，以备进一步处理。
2. 抗体处理
将组织切片后加入0.3%的Triton X-100在PBS中处理15分钟，以增强细胞膜对抗体的渗透性。用PBS洗涤组织，重复3次，每次5分钟。接下来加入阻止血清阻止非特异性结合，处理1小时。取出后用PBS洗涤组织，重复3次，每次5分钟。加入稀释后的一抗，处理一晚，常温摇动。隔天使用相应的二抗标记，处理1小时，室温摇动。一定要注意一抗和二抗之间的适当稀释比例。将组织用PBS洗涤，重复3次，每次5分钟。
3. DAPI染色
DAPI荧光染色是为了标记细胞核位置和数量。将DAPI荧光染色试剂盒配置好后，取出组织切片放置其中处理15分钟，常温摇动。对切片用PBS洗涤，重复3次，每次5分钟。轻轻擦去切片周围多余的液体，然后在组织上滴入荧光显微镜增强剂和抑制剂，使标志更加鲜明，定焦、拍照。
注意事项
•确保足够的样本。
•抗体的浓度与样本之间的配合需要进行适当的调整。
•将试管区分清楚，不要混淆不同处理步骤的培养基。
免疫荧光英文 新PROTOCOL -
Immunofluorescent Staining
Frozen section from the ultra-low temperature freezer, after 5 min at room temperature, make its restore to the normal temperature. Immunohistochemical staining method and steps are as follows:
（1）The sections were treated in 0.02M PBS(PH 7.4) 6×15min
（2）Then treated with 0.6% H2O2(eg.2ml 30%H2O2 in 98ml PBS) 2×15min
（3）Then treated in 0.02M PBS(PH 7.4) 2×15min
（4）Then treated with 0.4% Triton X-100 in TBS for 1 h at RT;
（5）Then use TBST with 5% goat serum for 30 min at RT, Note that not to wash after this step;
（6）Drops a circle in slide and plus primary antibodies (can also add two primary antibodies) incubation, 4℃ sealing in wet box 40h or 2 day;
冷冻组织切片--免疫荧光染色详细步骤
冷冻组织切片免疫荧光染色
1.冷冻切片从-80℃拿出后室温放置15min
2.PBS浸泡10min，去除OCT
3.固定：4%多聚甲醛固定15min
4.漂洗：PBS X 3次，每次5min
5.穿透：0.3% TritonX-100,室温穿透组织15min
6.封闭：10% BSA室温封闭1h
7.孵一抗：用2%BSA配制一抗，4℃孵育过夜，第二天，将其恢复至室温时漂
洗，PBS X 3次，每次5min
8.孵二抗：用2%BSA配制二抗，室温孵育1h，漂洗PBS X 3次，每次5min
9.利用含DAPI的防荧光猝灭剂封片，避光放置30min后拍照。
组织-免疫荧光染色protocol
组织-免疫荧光染⾊protocol
组织免疫荧光步骤：
1）取出切⽚，⽤0.01 M PBS冲洗5min×3次；
2）滴加10%正常⼭⽺⾎清37℃封闭45 min；
3）吸去多余液体，加⼊抗TSHR的⼀抗（1：100），放⼊湿盒中，37℃孵育1h后置于4℃冰箱中过夜（保持在湿盒中）；4）0.01 M PBS冲洗5min×3次；
（⾄下⼀步开始要适度避光操作，防荧光淬灭！）
5）在⿊暗条件下加⼊⼭⽺抗兔IgG-FITC（1：200），37℃温育45 min；6）在⿊暗条件下吸弃⼆抗(注：不再冲洗)，加⼊DAPI染液（2.5µg/ml），室温作⽤20 min；
7）在⿊暗条件下0.01M PBS冲洗5min×6次；
8）在⿊暗条件下防荧光淬灭剂封⽚，荧光显微镜下观察，⽤合适波段激发，照相保存实验结果。
核实好下边的问题你就可以操作了：
1、准备0.01 M PBS 500 ml，冲洗时动作既要轻柔防脱⽚，⼜要保证
冲洗彻底；
2、抗TSHR的⼀抗⽤1：100，⽤抗体稀释液稀释；
3、实验室有没有⼭⽺抗兔IgG-FITC，使⽤浓度是1：200；
4、DAPI染液（2.5µg/ml）实验室有吗？
5、防荧光淬灭剂封⽚实验室有吗？
组织切片免疫荧光染色
组织切片免疫荧光染色
组织切片免疫荧光染色是一种常用的方法，用于检测组织样本中特定抗原的表达情况。它可以帮助研究者研究细胞、组织的结构和功能，以及疾病的发生和发展过程。
这种染色方法的基本步骤如下：
1. 取得组织样本：通常从动物（如小鼠、大鼠）或人体中取得组织样本。样本可以是固定的组织块或细胞培养物。
2. 制备组织切片：将组织样本固定、包埋、切片，得到薄片。常用的固定剂包括甲醛或乙醛等。切片可以通过切片机或手工操作。
3. 抗原解露：将组织切片进行抗原解露处理，使得目标抗原能够与特异抗体结合。解露方法包括热解露或酶消化等。
4. 抗原结合：将特异性抗体加入到切片上，与目标抗原结合。这些抗体通常是通过动物免疫反应获得的。
5. 检测染色：使用荧光染料或酶联二抗法等方法标记抗体，以可视化与抗原结合的抗体。荧光染料通常是荧光素和荧光素衍生物。
6. 显微镜观察：将染色的组织切片放置在荧光显微镜下观察和拍照。荧光显微镜能够通过荧光染料的发射光进行可视化。
通过组织切片免疫荧光染色，研究者可以可视化特定抗原在组织中的位置和表达水平，从而了解细胞和组织的功能以及疾病的机制。
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法
基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
荧光显微镜
玻片架
滤纸H
37℃温箱等。
试验步骤
1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。
2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置
于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。
3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓
冲甘油，以盖玻片掩盖。
5、马上用荧光显微镜观看。观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示：
（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。
Immunofluorescence staining of cells 免疫荧光染色Protocol
Immunofluorescence staining of cells
1) Wash cells twice with 1 mL of 1X PBS (aspirate off the medium from each well, add 1mL 1X PBS using p1000 pipetman, then remove it – i.e. don’t need to wait, just repeat it one more time).
2) Fix cells in 4% paraformaldehyde (1mL/well) for 15 min.
3) Wash cells twice for 5 min with 1 mL 1X PBS (1mL each).
4) Blocking & permeabilizing with 3% BSA, 1% Triton X-100 in 1X PBS (Blocking medium) for 20 min.
5) Incubate with primary antibody for 1hr. anti-myosin heavy chain; anti-MHC (1:15 dilution, 1mL X 1/15 = 66.7 uL; 66.7uL antibody + 933.3uL in Blocking medium as in 4). Make a master mix for 6.1X
66.7 uL X 6.1 = 406.87uL antibody
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组织免疫荧光步骤：
1）取出切片，用0.01 M PBS冲洗5minx 3次；
2）滴加10%正常山羊血清37C封闭45 min;
3）吸去多余液体，加入抗TSHR的一抗（1:100）,放入湿盒中，37C 孵育1h后置于4 C冰箱中过夜（保持在湿盒中）；
4）0.01 M PBS冲洗5minx 3 次；
（至下一步开始要适度避光操作，防荧光淬灭！）
5）在黑暗条件下加入山羊抗兔IgG-FITC （1: 200） , 37C温育45 min;
6）在黑暗条件下吸弃二抗（注：不再冲洗），加入DAPI染液（2.5⑷/ml）,室温作用20 min;
7）在黑暗条件下0.01M PBS冲洗5min x 6次；
8）在黑暗条件下防荧光淬灭剂圭寸片，荧光显微镜下观察，用合适波段激发，照相保存实验结果。
核实好下边的问题你就可以操作了：
1、准备0.01 M PBS 500 ml，冲洗时动作既要轻柔防脱片，又要保证
冲洗彻底；
2、抗TSHR的一抗用1: 100,用抗体稀释液稀释；
3、实验室有没有山羊抗兔IgG-FITC，使用浓度是1: 200；
4、DAPI染液（2.5卩g/m）实验室有吗？
5、防荧光淬灭剂封片实验室有吗？