传染性法氏囊病地方毒株VP2基因的克隆与特性鉴定

３．２
从临床分离株与标准毒株 ＶＰ２ 基因氨基酸和核
ＩＢＤＶ 毒 株 的 核 苷 酸 相 似 性 均 超 过 ９４．８& !!氨 基 酸 相
苷 酸 相 似 性 比 较 的 结 果 可 发 现 !ｈａｎｃｈｕａｎ ’ｚｈｅｎｊｉａｎｇ
表 １ ＩＢＤＶ 分离株与标准毒株 ＶＰ ２ 基因氨基酸和核苷酸相似性比较 ( +$ 毒株
ＡＭＰ＋ ５０ｍｇ／Ｌ& " 扩增培养 # 按碱裂解法提取 质 粒 " 以
备进行酶切鉴定和 ＰＣＲ 鉴定 #
１ １．１
材料与方法 材料 毒株
１．２．３
重组质粒的鉴定
将筛选的阳性重组质粒作
为模板 " 应用相同的引物进行 ＰＣＲ 扩增 " 扩增产物通 过琼脂糖凝胶进行电泳检测 #
１．１．１
ＩＢＤＶ ｚｈｅｎｊｉａｎｇ 株 !２００６ 年 ７ 月 分 离 自
１．２．５
氨基酸序列相似性分析
根 据 ＩＢＤＶ Ａ 片 段
% ＯＲＦ& 结构 " 用 ＤＮＡｓｔａｒ 推导测定序列编码 大阅读框 蛋白质的氨基酸序列 " 进行相似性比较分析 #
ＣＡＧＧＣＣＧＴＣＡＡＧ－
２ ２．１
结果
ＧＴＣＴＴＧＴＴＣ－ － ３＇ $ＩＢＤＶ２ !５＇－ ＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＣＴＡＴＣ－ ＣＴＣＣＴＴ － ３＇& " 跨度 １５００ｂｐ # 引物 由 上 海 英 骏 公 司 合
" ! "
养禽与禽病防治 !""! 年第 " 期
摘 要 ! 应 用 ＲＴ－ ＰＣＲ 技 术 对 三株分离自不同地方的传染性法 氏 囊 病 病 毒 株 的 ＶＰ２ 基 因 进 行 了 克隆与序列分析 " 并与经典株等相 应 毒 株 的 ＶＰ２ 高 变 区 核 苷 酸 及 氨 基酸序列进行了相似性分析 # 结果 显 示 "ｈａｎｃｈｕａｎ 和 ｚｈｅｎｊｉａｎｇ 株 为 超 强 毒 株 $ｙｕｌｉｎ 株 为 非 变 异 的 强 毒株 # 试验结果表明 " 由于病毒毒 力增强而引起三地免疫鸡群发生 传染性法氏囊病 #
ｐＭＤ１８－ Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ’ 两步法 ＲＴ!ＰＣＲ 扩增试剂盒购自 Ｔａｋａｒａ 公司 # １．１．３
引 物 设 计 与 合 成 利 用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ５．０ 软 件 " 根据 ＧｅｎＢａｎｋ 中注册的 ＩＢＤＶ Ａ 片段基因序列 " 设计合成多对引物" 经过反复筛选出一对特异性引 物 ＩＢＤＶ１／ＩＢＤＶ２ % ＩＢＤＶ１ !５＇－
ＶＰ２ 高变区氨基酸序列存在 ２１ 个
" 差异位点 ! 结果见图 ２ %
２ 华南农业大学动科学院
５２７４３９ ； 广东广州 ５１０６４２$
３ ３．１
讨论 本 试 验 成 功 克 隆 了 ＩＢＤＶ 临
文章编号 &１００８－ ３８４７ ( ２００８$ ０２－ ０００８－ ０３
床 分 离 株 的 ＶＰ２ 基 因 ! 通 过 序 列 测定 和 比 较 分 析 发 现 ! 在 第 一 亲 水 区 的 氨 基 酸 残 基 # ｙｕｌｉｎ 株为 Ｌ! 而其 ( 发生变化的有 &２１７ 位氨基酸残基 余两株分离株及参考株均为 Ｓ$ 和 ２２２ 位的氨基酸残 基( # ｈａｎｃｈｕａｎ 株 ’ｚｈｅｎｊｉａｎｇ 株 与 超 强 毒 株 ＵＫ６６１ ’ 中 国超强毒株 ＨＫ４６ 的 Ａ! 而 ｙｕｌｉｎ 株与中国经典毒 株
９８．９％ 以上 " 根据 据 曹 永 长 报 道 的 ｖｖＩＢＤＶ ＶＰ２ 可 变
区 的 ３ 个 特 征 及 ｖｖＩＢＤＶ 所 特 有 的 三 个 氨 基 酸 残 基 # ２２２ 位 Ａ! 第 ２９４ 位为 Ｉ， 第 ２９９ 位为 Ｓ$ ! 本试 验 所 分 离 的 ｈａｎｃｈｕａｎ 株 和 ｚｈｅｎｊｉａｎｇ 株 具 备 上 述 ｖｖＩＢＤＶ 的 特征 ! 因此 !ｈａｎｃｈｕａｎ 株和 ｚｈｅｎｊｉａｎｇ 应为超强 毒 株 ! 其 毒 力 可 能 明 显 强 于 标 准 血 清 Ｉ 型 毒 株 ＳＴＣ 的
ＩＢＤＶ ＶＰ ２ 基因的 Ｐ ＣＲ 扩增产物
应 用 相 同 的 引 物 !可
２．２
重 组 质 粒 ＰＣＲ 鉴 定 结 果
ＳＷＳＡＳＧＳ 不 变 ! 同 时 在 ２７９ 和 ２８４ 位 氨 基 酸 均 分 别
为 Ｄ 和 Ａ% 但 ３ 个分离株在第一 ’ 二亲水区和七肽区 外 的 ３３０ 位 及 ３３２ 位 的 氨 基 酸 残 基 均 有 别 于 中 国 经 典 毒 株 ＣＪ８０１ 株 而 与 ＳＴＣ’ＵＫ６６１ 和 ＨＫ４６ 相 同 ! 由 此 表 明 了 !３ 个 地 方 株 的 抗 原 性 虽 然 发 生 了 部 分 变 异 ! 但其致病力可能没有发生变化 %
ＩＢＤＶ ＲＮＡ 的 提 取 和 ＶＰ２ 基 因 的 扩 增
按照
Ｔａｋａｒａ 公司的 ＲＮＡ 提取试 剂 盒 说 明 书 提 取 ＩＢＤＶ 的 ＲＮＡ# 按 照 两 步 法 ＲＴ－ ＰＣＲ 扩 增 试 剂 盒 说 明 " 在 ２４．４#Ｌ 反 应 体 系 中 " 加 入 ＲＮＡａｓｅ ｆｒｅｅ 水 １６．６$Ｌ" ５%ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ５&Ｌ， 酶 ０．２’Ｌ"ｃＤＮＡ ２(Ｌ，ＩＢＤＶ１ 和 ＩＢＤＶ２ 各 ０．３)Ｌ# 扩增参数为 ! 经过 ９４* ３ｍｉｎ 后 " ９４+ ３０ｓ， ５２, ３０ｓ， ７２- ３０ｓ" 循 环 ３０ 次 # 再 在 ７２.
ＶＰ２ 基因氨基酸序列相似性 ＣＪ８０１ ＰＢＧ９８ ９８．２ ９９．２ ９７．６ ９５．９ ９７．５ ９４．８ ９５．０ ９５．５ ９７．４ ９５．２ ９７．３ ９４．８ ９４．９ ９５．５ ９５．７ ９８．７ ９５．５ ９５．８ ９６．２ ９６．２ ９８．５ ９８．３ ９８．９ ９５．２ ９５．５ ９６．１ ９７．５ ９８．２ ９８．１ ＳＴＣ ９７．６ ９７．６ ＵＫ６６１ ９６．８ ９６．５ ９７．１ Ｙｕｌｉｎ ９７．４ ９７．４ ９８．５ ９８．０ ｚｈｅｎｊｉａｎｇ ９５．８ ９５．８ ９６．９ ９９．１ ９７．２ ｈａｎｃｈｕａｎ ９６．７ ９６．７ ９７．８ １００．０ ９８．０ ９９．１ Ｈｋ４６ ９６．６ ９７．１ ９７．９ ９９．２ ９７．８ ９８．９ ９９．８
传染性法氏囊 基因的克隆Leabharlann 孔意端１陈峰
２
廖理克
１
周庆丰
１
廖秋生
１
顾的乐
１
中图分类号 !Ｓ８５２．５ 文献标识码 !Ａ
１．２ １．２．１
方法
关 键 词 ! 传 染 性 法 氏 囊 病 病 毒 ＲＴ－ ＰＣＲ 相 似 性 分析 传 染 性 法 氏 囊 病 % ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ， ＩＢＤ& 是 由 传 染 性 法 氏 囊 病 病 毒 % ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ
ＣＪ８０１ ＰＢＧ９８ ＳＴＣ ＵＫ６６１ ｙｕｌｉｎ ｚｈｅｎｊｉａｎｇ ｈａｎｃｈｕａｎ ＨＫ４６
ＶＰ２ 基因核苷酸序列相似性
# !" #
养禽与禽病防治 !""! 年第 " 期
图２
ＩＢＤＶ 分离毒株与标准毒株 ＶＰ ２ 基因高变区氨基酸序列比较
地 方 株 与 超 强 毒 株 ＵＫ６６１ 及 中 国 超 强 毒 株 ＨＫ４ 的 核苷酸和氨基酸相似性都较高 ! 分别高达到 ９８．１％ 和
有限公司进行序列测定" 并用分子生物学软件
１．１．２
菌株 ’ 质粒和试剂
菌株 Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１ ’ 连接载体
ＤＮＡｓｔａｒ 对 测 定 序 列 和 ＵＫ６６１（超 强 毒 株 ）’ＰＢＧ９８（弱
毒株 ）’ＣＪ８０１ （中国经典 株 ）’ＨＫ４６ % 中 国 超 强 毒 株& ’ % 标准血清 2 型毒株& 进行相似性比较分析 # ＳＴＣ
１．２．２
目的基因的克隆
将 扩 增 的 ＰＣＲ 产 物 通 过
１％ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 " 回 收 目 的 条 带 进 行 抽 提 ’ 纯 化 #
% １６/ "４ｈ& 将纯化后的 ＰＣＲ 产物与 ｐＭＤ１８－ Ｔ 按要求 进行连接 " 连接产物按常 规 方 法 转 化 至 ＪＭ１０９ 感 受 态 菌 中 " 涂 布 于 含 有 ＡＭＰ＋’Ｘ－ ｇａｌ 和 ＩＰＴＧ 的 ＬＢ 琼 脂平板上 "３７0 培养 １８1２４ｈ " 进行蓝 ／ 白斑筛选 # 挑 取 生 长 良 好 的 白 色 菌 落 接 种 于 ＬＢ 培 养 基 中 % 含
" ! "
病地方毒株 ＶＰ２ 与特性鉴定
( １ 广东温氏食品集团 广东云浮
似性均超过 ９５．８’ " ! 其中 ｈａｎｃｈｕａｎ 分 离 株 与 ＵＫ６６１ 株 的 氨 基 酸 相 似 # 表 １$ % ( 性为 １００( #
２．４
ＶＰ２ 氨 基 酸 序 列 相 似 性 分 析
应 用 ＤＮＡｓｔａｒ 分 析 ＩＢＤＶ 各 毒 株
江苏地区的免疫鸡群 $ＩＢＤＶ ｙｕｌｉｎ２００６ 年 ７ 月 分 离 自 广 西 地 区 的 免 疫 鸡 群 $ＩＢＤＶ ｈａｎｃｈｕａｎ２００６ 年 ８ 月 分 离自湖北地区的免疫鸡群 #
１．２．４
ＶＰ２ 基 因 的 核 苷 酸 序 列 测 定 和 比 较 分 析
经
ＰＣＲ 鉴定均为阳 性 的 重 组 质 粒 由 上 海 英 骏 生 物 技 术
成 " 引物使用终浓度为 ２０ｎｍｏｌｅ／ｍＬ"－ ２０" 保存 #
ＶＰ２ 基因的 ＲＴ－ ＰＣＲ 扩增
应用所设计的引物
对 ＩＢＤＶ 野毒株进行 ＲＴ－ ＰＣＲ 扩增 " 结果均扩增出一 条为约 １ ５００ｂｐ 左右的目的片断 " 与设计结果完全相 符 % 图 １& #