1分析化学-高效液相色谱法
无机及分析化学第9章-高效液相色谱法
二、方法原理
5.亲和色谱法 主要利用生物大分子与固定相之间的特异亲和力 进行选择性分离及纯化的方法。
原理:于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨(称 为间隔臂),然后再连接上配基。当含有复杂混合试样的流动 相流经这种经固定化的配基时,其中具有亲和力特性的生物大 分子与配基相互作用而被保留,无此作用的则被淋洗出;随后 ,改变流动相pH或组成,再将被保留的大分子组分以纯品的形 式洗脱出来。
1.高压输液系统 一般由贮液器、脱气装置、高压输液泵、过 滤器、压力脉动阻尼器以及梯度洗脱装置等组成,其中高压输 液泵是核心部件。
(1)贮液器 用来贮存流动相,其材料对流动相是化学惰性的 。常用的材料为玻璃、不锈钢或表面涂聚四氟乙烯的不锈钢等
(2)过滤和脱气装置 流动相在使用前应根据其性质选用不 同材料的滤膜过滤,一般选用市售的0.45 m的水性和油性滤 膜进行过滤 。样品溶液一般用市售的0.45 m针形滤器过滤。 另外,在流动相入口、泵前、泵和色谱柱间都配置有各种各样 的滤柱和滤板。
一、分离类型的选择 色谱分离类型的选择原则列于图9-3中。
图9-3 PHLC分离类型的选择参考表
二、固定相和流动相的选择
(一)固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类,可分为 刚性固体和硬胶两大类。固定相按孔隙深度可分为表 面多孔型和全多孔型固定相。
1. 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球,在玻璃 球外面覆盖一层多孔活性材料,如硅胶、氧化硅、离 子交换剂、分子筛、聚酰胺等。
例1 有机氯农药的测定,采用液-固色谱法。
色谱条件:50cm×2.5mm(内径)色谱柱;
三、HPLC法应用实例
流动相:正己烷; 固定相:薄壳硅胶 CorasilⅡ37~50μ m);
简述高效液相色谱法中流动相的要求
简述高效液相色谱法中流动相的要求高效液相色谱法(High-performance liquid chromatography,HPLC)是一种用于分离和分析化学、生物和制药样品的色谱技术。
在高效液相色谱过程中,流动相的选择和性能对分析的准确性和分离效果有着重要的影响。
下面将详细介绍高效液相色谱法中流动相的要求。
1.基础流动相特性:流动相应具有一定的极性和溶解性能。
常用的流动相包括水和有机溶剂,如甲醇、乙醇和乙腈等。
流动相的选择应考虑到待分离组分的性质和分析目的,要保证样品能够溶解并很好的分离。
常用的流动相配比为水/有机溶剂(如乙腈)的比例,比如常见的70:30、50:50等。
2.pH值调节:根据待分离物和色谱柱的性质,适当调节流动相的pH值可以改变待分离物的电离状态,从而影响它们在色谱柱上的分配行为。
比如,对于具有酸性基团的分析物,可以通过酸或碱的加入来调节流动相的pH值,以影响它们与色谱固定相之间的相互作用。
3.离子强度调节:有些样品中可能存在电解质,其离子强度会对分离产生影响。
在这种情况下,可以通过添加相应的盐来调节流动相的离子强度,以改变分析物与色谱固定相的相互作用。
常用的盐有甲酸铵、硫酸铵、三氟乙酸等。
4.流速控制:流动相的流速也对色谱分离的效果有着重要的影响。
流速过快可能导致分离不充分,流速过慢则会增加分析时间。
流速的选择需根据待分离物的性质、色谱柱的尺寸和色谱仪的性能等因素综合考虑。
5.除气和过滤:流动相中的气泡和杂质会影响液相的流动性和检测信号的稳定性。
因此,在使用前应对流动相进行除气处理,以减小气泡对色谱分离的干扰。
同时,对流动相进行过滤处理,可以去除其中的固体颗粒和微生物等。
通常使用0.45μm的滤膜进行过滤。
6.流动相稳定性:流动相应具有良好的稳定性,以保证分析结果的准确性和重复性。
一般来说,流动相中的溶液成分要充分溶解,不发生相分离和析出现象。
所以,流动相的配制要求严格,要遵循相应的配方和混合方法,并在使用前进行充分的搅拌和均匀。
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)和超高效液相色谱(Ultra High Performance Liquid Chromatography,UHPLC),是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析,广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面,介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同,都是利用样品在流动相中的分配系数差异,通过固定相和流动相的作用,将混合物中的化合物分离出来。
不同的是,超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相,使得流动相可以更快地通过固定相,从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中,样品首先被注入流动相中,然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料,如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同,因此在通过固定相时,会被分离出来。
分离出来的化合物,会在检测器中被检测到,从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同,主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
(一)注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析,而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
(二)流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量,并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量,适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合,从而实现更好的分离效果。
(三)柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分,用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱(改变N)
措施: a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小,峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography (HPLC)
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支,现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国:
开始仅为少数研究实验室拥有, 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于: 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的:入门 教材:《实用色谱法》(詹益兴 编著) 学习要求:记好笔记,
ⅰ大分子,扩散系数小 ⅱ小分子,扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一,在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小,可忽略 不计,即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相H-u区别
§1-4 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1-1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程:试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动,称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体,称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差,产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽,H↑(N↓),分离变差; (3) B/u与流速有关:流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相色谱方法及应用
高压输液泵及梯度洗脱装置
一、高压输液泵 高压输液泵可以分为以下两类: 1.恒流泵:可输出恒定体积流量的流
动相。 (1)注射式泵(又称注射式螺杆泵) (2)往复型泵 2.恒压泵:恒压泵又称气动放大泵,
一类是选择性检测器,如紫外一可 见分光光度检测器;
另一类是通用型检测器,如示差折 光检测器。
(1)紫外一可见分光光度检测器。
如今此技术已在分析咖啡中的黄嘌泠、调料中的核苷酸及核苷、果汁中的有机酸、米中的维生素、牛奶中的维生素D等都对食品营养价 值提供有效数据。 热不稳定物、离子型化合物及高聚物的分离及测量有困难,致使其应用受到了很大的限制。 又如止痛药或退烧药也可用此法分离并测得各组分的含量。 染料厂排出废水中的苯胺等。 用液相色谱分析简便迅速。 分析食品中的有毒成分,如苹果中农药萘乙酸、稻米中的黄曲霉素、鱼体中的有机汞等。是输出恒定压来自的泵。二、梯度洗脱装置
1.梯度洗脱(gradient elution)又称 停流进样是在高压泵停止供液、体系压力下降的情况下,将样品直接加到柱头。
一、与经典液相色谱法比较
为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析 用离子交换柱和缓冲游泳梯度淋洗。
多种不同性能的配位体键联在固相基体上 分析食品中的有毒成分,如苹果中农药萘乙酸、稻米中的黄曲霉素、鱼体中的有机汞等。
高效液相色谱法的特点
一、与经典液相色谱法比较 经典液相(柱)色谱法使用粗粒多孔固定相,装
填在大口径、长玻璃柱管内,流动相仅靠重力流经 色谱柱,溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢,柱 入口压力低,仅有低柱效,分析时间冗长。
高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相,装填 在小口径、短不锈钢柱内,流动相通过高压输液泵 进入高柱压的色谱柱,溶质在固定相的传质,扩散 速度大大加快,从而在短的分析时间内获得高柱效 和高分离能力。
hplc的注意事项
HPLC,即高效液相色谱法,是一种在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着广泛应用的技术。
在使用HPLC进行实验时,需要注意以下事项:流动相的纯度:流动相必须是高纯度的,以保证色谱柱和检测器的性能。
如果流动相中含有杂质,可能会堵塞色谱柱,影响分离效果。
流动相的脱气:流动相在使用前需要进行脱气处理,以避免在实验过程中产生气泡,干扰实验结果。
样品处理:对于复杂的样品,需要进行适当的预处理,如提取、浓缩、纯化等,以去除干扰物质,提高分离效果。
色谱柱的清洗和维护:色谱柱是HPLC的核心部件,需要定期清洗和维护,以保证其性能和使用寿命。
检测器的选择:根据实验需求选择合适的检测器,如紫外检测器、荧光检测器等。
实验条件的选择:根据实验需求选择合适的实验条件,如流速、流动相组成、柱温等。
数据的记录和处理:实验过程中需要记录详细的实验数据,并采用适当的软件进行数据处理和分析。
总之,使用HPLC进行实验需要注意细节,严格遵守实验操作规程,以保证实验结果的准确性和可靠性。
高效液相色谱-电化学法_概述及解释说明
高效液相色谱-电化学法概述及解释说明1. 引言1.1 概述高效液相色谱-电化学法(简称HPLC-EC)是一种常用的分析技术,利用高效液相色谱技术和电化学检测原理相结合,实现对样品中化合物的分离和定量分析。
此方法具有灵敏度高、选择性好、重复性好等优点,因而在环境科学、生物医药和食品安全等领域得到广泛应用。
1.2 文章结构本文共分五个部分进行阐述。
引言部分是对整篇文章的概述,介绍了HPLC-EC 技术的背景和研究意义。
第二部分将对HPLC技术和电化学法以及它们之间的结合进行简要介绍。
接下来一节将详细讨论HPLC-EC的实验原理与分析过程。
第四部分将探讨HPLC-EC在环境污染物、生物医药和食品安全领域中的应用案例。
最后一节是总结与展望,回顾整篇文章所提到的内容,并展望该技术在未来发展中可能取得的进展。
1.3 目的本文旨在全面介绍高效液相色谱-电化学法的相关知识,深入探讨其原理及其在环境科学、生物医药和食品安全领域的应用。
通过文章阐述,读者可以对HPLC-EC技术有一个全面的了解,并且了解到该技术在不同领域的实际应用和发展趋势。
2. 高效液相色谱-电化学法概述:2.1 高效液相色谱技术简介高效液相色谱(HPLC)是一种广泛应用于分析化学领域的分离技术。
它基于物质在溶剂流动下通过固定相的不同速率进行分离,可用于分析和检测各种化合物。
HPLC技术具有分离效果好、选择性强、重复性好等特点,因此被广泛应用于环境、生物医药和食品安全等领域的样品分析中。
2.2 电化学法简介电化学法是利用电极与溶液中存在的化学反应产生的电流或电势来检测或测定物质的一种方法。
根据所使用的电极类型和测量参数,常见的电化学方法包括极谱法、电化学滴定法、恒定电位法等。
这些方法可以实现对不同种类和浓度范围内的物质进行快速准确的检测和分析。
2.3 结合应用优势高效液相色谱-电化学法(HPLC-EC)是将HPLC技术与电化学方法相结合而形成的一种分析技术。
高效液相色谱法
1971年科克兰等人出版了《液相色 谱的现代实践》一书,标志着高效液相 色谱法 (HPLC)正式建立。在此后的时 间里,高效液相色谱成为最为常用的分 离和检测手段,在有机化学、生物化学、 医学、药物开发与检测、化工、食品科 学、环境监测、商检和法检等方面都有 广泛的应用。高效液相色谱同时还极大 的刺激了固定相材料、检测技术、数据 处理技术以及色谱理论的发展。
高效液相色谱的特点
高压——压力可达150~300 kg/cm2。色 谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中 同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达 0.01ng。同时消耗样品少。
高效液相色谱法基本原理
(1)正键合相色谱中,采用和反相液液分配色 谱相似的流动相,流动相的主体成分为己烷或庚 烷。 (2)反相键合相色谱中,流动相采用和反相液 液分配色谱相似的流动相,主题为水。 4.应用 (1)正键合相色谱法的应用:多用于分离各类 极性化合物如染料、炸药、多巴胺、氨基酸等; (2)反键合相色谱法的应用:由于操作简单, 稳定性和重复性好,该方法已成为一种通用型液 相色谱分析方法。在生物化学、医药研究、食品 分析和环境污染分析等多个领域有了很大的应用 和发展。
高效液相色谱 分析法
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一、概述
高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography 简称(HPLC) 高效液相色谱法 又叫做高压或高速液相色谱、高分离度液相色谱 或近代柱色谱,以液体为流动相,采用高压输液 系统,是色谱法的一个重要分支。 它是用高压 输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的 混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色 谱柱,经进样阀注入待测样品,由流动相带入柱 内,在柱内各成分被分离后,依次进入检测器进 行检测,从而实现对试样的分析。这种方法已成 为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检
高效液相色谱法(hplc)
高效液相色谱法(HPLC)一.概述色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术,它已有近百年的发展史。
二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC技术大发展,而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC的迅速发展。
目前除分析化学外,生物化学,石油化学,有机化学,无机化学等学科都普遍采用色谱技术。
现代高效液相色谱仪,以其高效,快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。
HPLC已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。
1.HPLC的特点(1)适用范围广已知有机物中仅20%不经预先化学处理,可用GC分析;而其余80%有机物可用HPLC分析。
HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物,不稳定的天然产物,种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。
(2)流动相及固定均与样品分子作用,而GC仅固定相与样品分子作用。
(3)具有独特性能的柱填料(固定相)种类较多,具有多种分离方式,适于各种化合物分析。
(4)分离温度较低,提高了分离效率。
(5)具有一些独特的检测器:电化学,示差折光,可见紫外吸收及荧光检测器等。
(6)样品易回收。
2.HPLC分类按分离机理分为四类:吸附色谱(液固):通过试样组分对活性固体表面吸附亲合力的不同实现分离。
对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性,早期应用较多,现在大多可用正相键合相色谱替代,常用硅胶柱。
分配色谱:不同溶质分子按其在固定相和流动相中分配系数不同得到分离。
现代分配色谱即化学键合相色谱,是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表面,具有很好的化学稳定性和热稳定性。
大部分分离问题都可用键合相色谱解决。
离子交换色谱:以离子交换剂为固定相,试样中电离组分与交换剂基体相反电荷的离解部位亲合力不同而分离。
用于分离无机或有机离子。
固定相为阴(阳)离子交换树脂,流动相为电解质溶液。
分子排阻色谱:按物质分子量大小进行分离。
不仅对高聚物,对分子量差别较大的低聚物或小分子化合物也可进行分离。
【大学课程】分析化学第20章 高效液相色谱法
梯度洗脱装置
外梯度(高压梯度): 利用两台高压输液泵,
将两种不同极性的溶剂按 一定的比例送入梯度混合 室,混合后进入色谱柱。
内梯度(低压梯度): 一台高压泵, 通过比
例调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混 合。
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(2)进样装置
流路中为高压力工作状态, 通常使用耐高压的六通阀进样装置, 其结构如图所示:
3 L2
L2
0.75cm
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液相色谱仪(3)
Agilent 1200 LC Systems
安捷伦1200 液相色谱系统
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液相色谱仪(4)
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二、流程及主要部件
1.流程
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2.主要部件
(1)高压输液泵:
主要部件之一,压力:150~350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(<10μm),液 体的流动相高速通过时,将产生很高的压力,因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
以固体吸附剂为固定相,如硅胶、氧化铝等,较常使用的 是5~10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的 一元或多元溶剂。
(二)液-液分配色谱:LLC
有正相色谱和反相色谱之分
正相色谱(NPC)
反相色谱(RPC)
固定相极性
大
小
流动相极性
小
大
流动顺序 流动相极性↑,
极性小的组分先
流出 k↓,tR↓
极性大的组分先
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小结
• 掌握Van Deemter 方程在HPLC中的表现形式; • 掌握正相色谱和反相色谱的区别; • 掌握化学键合相色谱,特别是反相键合相色谱
高效液相色谱的使用流程
高效液相色谱的使用流程简介高效液相色谱(High-Performance Liquid Chromatography,简称HPLC)是一种用于分离、鉴定和定量化分析化学物质的常用技术。
本文将介绍高效液相色谱的使用流程。
使用流程1.准备工作–检查仪器:确保HPLC仪器处于正常工作状态,检查进样器、流动相泵、柱温箱和检测器等部件。
–准备试剂:根据需要,准备好所需的溶剂、标样溶液和样品溶液,并确保它们纯净、稳定且符合实验要求。
–校准仪器:进行必要的仪器校准,包括流速校准、进样器校准和检测器校准等。
2.设置分离条件–选择合适的柱:根据需要选择合适的固定相柱,例如反相柱、离子交换柱或手性柱等。
–设置流速:根据柱的要求和分离物的性质,设置合适的流速,一般为0.5-2.0 mL/min。
–选择合适的流动相:根据待分离物的性质,选择合适的流动相体系,包括溶剂和缓冲液等。
–设置柱温:根据实验要求和分离物的性质,设置适当的柱温,一般常温即可。
–设置检测器:选择合适的检测器,如紫外检测器、荧光检测器或质谱检测器,根据需要设置检测器的波长、激发波长等参数。
3.进样与分析–进样方式:根据需求和样品性质,选择适合的进样方式,包括自动进样器、手动进样器或固相萃取柱等。
–进样量:根据样品的浓度和分析要求,设置合适的进样量,一般范围为1-20 μL。
–开始分析:点击软件界面上的“开始”按钮,启动HPLC运行,此时仪器开始运行,进行样品分离和检测。
–数据记录:在分离过程中,系统会实时记录和显示数据,包括峰面积、保留时间和峰高等结果。
4.数据分析与解读–峰面积计算:根据检测器记录的峰面积数据,通过内置的计算公式,计算出目标化合物的峰面积。
–保留时间测定:根据检测器记录的保留时间数据,可以获得目标化合物的保留时间,用于鉴定和定量分析。
–峰高测定:根据峰高数据,可以了解化合物的峰高大小,用于比较不同样品或条件下的分离结果。
–结果解读:根据数据分析结果,判断样品中所含化合物种类和含量,并与已知标准进行对比验证。
高效液相色谱法的定义
高效液相色谱法的定义
高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是一种分离和分析化学物质的方法。
它利用液相作为流动相,将待检样品按照其在固定填充物上的亲和性差异进行分离。
HPLC的基本原理是:将样品溶解于流动相中,通过高压泵将流动相推动样品通过固定填充物(也称为色谱柱),然后根据样品组分的亲和性差异,在固定填充物上进行分离。
随后,通过检测器对分离出的组分进行监测,并以信号形式输出,从而可以获得各个组分的峰图谱。
HPLC方法具有如下特点:
1. 高分辨率:由于使用高效的填充物和流动相,HPLC方法能够提供较高的分离效果和分辨率,使得能够分离出复杂混合物中的各个组分。
2. 定量精确:通过检测器对分离出的组分进行定量分析,可以提供准确和可靠的定量结果。
3. 广泛应用:HPLC方法适用于多种化学物质的分析,包括无机物、有机物、生物大分子等,因此被广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全、生命科学研究等领域。
4. 多样选择:根据不同的需求,可以选择不同类型的HPLC柱和流动相,以实现对不同化合物的最佳分离效果。
5. 自动化程度高:HPLC方法通常配备有自动进样器、自动调节流速、自动数据采集与处理等设备,使其操作更加方便快捷,并提高
分析的自动化程度。
总之,高效液相色谱法是一种重要的分离和分析技术,具有高分辨率、定量精确、广泛应用等特点,为化学分析和科学研究提供了有效的工具和方法。
现代色谱法分析技术—高效液相色谱法(分析化学课件)
分析乙苯及二甲苯三个异构体的样品,用归一化法定量结果如下,计 算各组分百分含量。
组分 峰面积A 重量校正因子
乙苯 120 0.97
对二甲苯 75 1.00
间二甲苯 140 0.96
邻二甲苯 105 0.98
(乙苯21.15%;对二甲苯17.50%;间二甲苯31.35%;领二甲苯24.00%)
高效液相色谱定量分析方法 ——内标法
高效液相色谱定量分析方法
目录
01 面积归一化法
02 外标法
03 内标法
高效液相色谱定量分析方法
什么是定量分析方法
实质是搞清楚样品里各组分含量有多少的问题 。
高效液相色谱法:能将组分分离后再分析含量 。
高效液相色谱定量分析方法—案例
怎样测出食品中的添加剂是符合标准的呢?
高效液相色谱定量分析方法—案例
高效液相色谱定性分析方法
目录
01 高效液相色谱法定性分析原理
02 高效液相色谱法定性分析方法
高效液相色谱定性分析方法
天麻为天麻片的主药,怎么鉴别 天麻片里是否真正含有天麻呢?
功效 祛风除湿 舒筋通络 活血止痛
医学用途 治疗肢体拘挛 治疗手足麻木 治疗腰腿酸痛
高效液相色谱定性分析方法 01.定性分析原理
高效液相色谱定性分析方法
课后思考
复方感冒片里主要有伪麻黄碱、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、右美沙芬这四种成份,请你结合
前面所学知识,说一说如何采用高效液相色谱法定性鉴别这四种成份呢? 如下图所示,这个样品中是否含有这四种有效成份呢?
高效液相色谱法概念
高效液相色谱法概述
一、高效液相色谱法简介
液相色谱分析是在经典的液体柱色 谱基础上,引入了气相色谱的理论;
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,简称HPLC)是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用,使样品组分在柱子中发生分离,再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中,进样器将样品注入柱子中,柱子根据物理化学性质的差异,使不同组分发生分离,之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度,并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比,高效液相色谱法的流动相的流速更高,柱子填充物颗粒更小,从而大大提高了分离效率。
同时,高效液相色谱法对样品的需求量较小,具有较好的分析灵敏度。
因此,高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中,高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器,可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如,对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态,对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中,高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子,可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离,使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中,高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器,可以对复杂的食品样品进行分离和检测,以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中,高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
分析化学 高效液相色谱法
'
2
W
H eff
L neff
2、 分离度
R 2(tr2 tr1 ) neff • 1 (W1 W2 ) 4
3、 速率方程
H A B Cu u
B 2DM
溶质在液相流动相 中的扩散系数,约 为气相中扩散系数
的万分之一
在大多数情况下, B 0 u
修正的速率方程: H A Cu
柱径:0.9 cm
F:30 mL/h
t分离: >20 h
高效液相色谱仪
经典液相色谱 HPLC
150-200 μm 3-10 μm 重力或低压泵 高压泵
HPL C
t分离:1 h
很慢
快(1-10mL/min)
与经典液相色谱法相比
颗粒极细(一般为10m以下)、规则均匀的固定相,(键合相) 传质阻抗小,柱效高,分离效率高;
注意:
流动相的pH一般应在3-8,否则会引起硅胶溶解;(也有适用宽pH 范围的键合相)。
固定相
固体吸附剂
硅胶-强极性 氧化铝-弱极性 活性炭-非极性 分子筛-强极性 高分子多孔微球(GDX)
硅胶表面结构
硅胶表面结构经热处理发生的变化
二、化学键合相色谱法的流动相
对流动相的要求:
与固定相不发生化学反应。
2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增 加,溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大,则溶 质的k越大。
3、流动相
极性越强,洗脱能力越弱,使溶质的k越大
溶剂种类:水为弱溶剂,醇为强溶剂
溶剂比例:水的比例增加,使k增大 中性盐的加入:使中性溶质的k增大
pH:影响弱酸、弱减的离解
流动相的pH降低,弱酸k增大,tR增大; 弱碱k变小。
分析化学-高效液相色谱
HPLC是60年代在GC和经典液相色谱基础上发展起来 的。
GC柱效高,且能分离、定量,但有些热稳定性差,不 易挥发的组分不能用GC直接分析,人们想到模仿GC,用细 颗粒固定相,薄壳固定液,以增加柱效。
模仿LC用液体作流动相,在室温下进行,但阻力太大, 液体流动相难以通过,所以又想到加高压泵,加快流动相流 速,这样即增加了柱效,又加快了分析速度,也拓宽了应用 范围,把柱子、高压泵、检测器配成仪器,就形成高效液相 色谱仪。
高压梯度洗脱(高压混合,高压进柱,2个泵。)
贮液槽1
贮液槽2
贮液槽1
贮液槽2
梯度洗脱装置 程序控制
高压泵1 高压泵2
混合室
高压泵
梯度洗脱装置
进柱
进柱
低压梯度洗脱
高压梯度洗脱
不易改变流动向配比,自动化程度低 随时改变流动向配比,自动化程度高
二.进样系统 注射进样:装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。 六通阀进样:目前最常用,由于进样量可由样品管控制, 因此进样准确,重复性好,如图。
1. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一 ,则速率方程中的分子扩散项B/U较小,可以忽略不计,即:
H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同,如图所示。
• 液体的黏度比气体大一百倍,密度为气体的一千倍,故 降低传质阻力是提高柱效主要途径。 • 由速率方程,降低固定相粒度可提高柱效。
1. 液-液分配及离子对分离固定相
(1)全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体;早期采
用100μm的大颗粒,表面涂渍固定液,性能不佳已不多见; 现采用10μm以下的小颗粒,化学键合制备柱填料;
《高效液相色谱法》
举例:巴比妥类药物
苯巴比妥、苯妥英和卡马西平均为临 床上常用的抗癫痫药,其药物浓度与疗效 和毒副反应密切相关。临床上常将三种药 物同时使用,为提高疗效,减少毒副作用 与个体差异,为超剂量中毒诊断、治疗与 及时调整给药方案提供科学依据,临床上 要进行血药浓度检测,而高效液相色谱法 是最常用的方法之一。
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反相高效液相色谱法
即指流动相的极性大于固定相极性的色 谱方法。在本法中常采用化学键合相作为固 定相,流动相采用水——甲醇或水——乙腈 系统,在反相色谱中,极性强的组分在分离 时先流出柱子,极性弱的组分后流出。因此 适合于共存组分极性差异较大的样品分析。 如高效液相色谱测定硫酸阿托品片的含量。
编辑ppt
反相离子对色谱
是分离有机离子的有效方法,离子对试剂和其 他添加剂的选用规则:1.样品中含有—COOH,— SO3H基团时,选用的离子对试剂应是带正电荷的 有机铵盐,以增加样品阴离子在反响色偶中的保 留值,选用的流动相一般是甲醇/水;2.除了加入 离子对试剂,还要加入磷酸盐或者其他缓冲液, 以控制流动相的酸度;3.样品中含有—NH2和— NH基团或其他阳离子时,选用的离子对试剂应是 烷基磺酸盐或硫酸盐;4.样品同时含有—NH2,— COOH,—SO3H等不同性质的基团时则以上规则 选用的离子对试剂和添加剂都合理。
编辑ppt
举例:
苯乙胺类药物中重酒石酸去甲肾上腺素注射液 的高效液相色谱测定法。
色谱条件与系统适应性试验:十八烷基硅烷键 合硅胶为填充剂;以0.14%更烷基磺酸钠溶液— —甲醇(65:35),用磷酸调节PH值至3.0作为流动 相;流速为每分钟1ml;检测波长为280nm。理论 板数按重酒石酸去甲肾上腺素峰值计算应不低于 3000。
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第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
反相离子对色谱法
离子对模型
B + H+ RSO 3 Na
流动相
BH + + RSO3 + Na+ ( BH+ RSO3 )m
固定相
( BH+ RSO 3 ) s
离子对
通式
+ B +A
( B+ A )m
( B+ A ) s
[B A ]s [B A ]s KB A [B ]m [B ]m [A ]m
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
适用范围和离子对试剂的ห้องสมุดไป่ตู้择
适用范围:有机酸、碱、盐,离子型和非离子型
化合物的混合物。
分析酸类或带负电荷物质:用季铵盐,如四丁基
铵磷酸盐(TBA)和溴化十六烷基三甲基铵(CTAB) 等。
分析碱类或带正电荷的物质:用烷基磺酸盐或硫
酸盐,如正戊烷基磺酸钠(PICB5)、正己烷基磺 酸钠(PICB6)。
第十八章
高效液相色谱法
分配:把有机键合层作为一个液膜看待,溶质在两相 的溶解 吸附:溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作 用
分离选择性: 极性强的组分k大,后洗脱出柱。 流动相的极性增强,洗脱能力增加,使组分k减小, tR 减小。
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
(二)反相键合相色谱法
固定相:非极性键合相
如十八烷基硅烷(C18,ODS)、辛烷基(C8)键 合硅胶
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
其他色谱类型
亲合色谱法(affinity
chromatography;AC)
手性色谱法(chiral
chromatography;CC)
胶束色谱法(micellar
chromatography;MC)
电色谱法(electrochromatography;EC)
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
(二)键合相的性质和特点
键合反应
硅氧烷(Si-O-Si-C)型:氯硅烷与硅 胶进行硅烷化反应
R1 Si OH + Cl Si R2 C18 H37 H Cl Si O R1 Si R2 C18 H 37
如:YWG-C18H37,无定形硅胶YWG上键合了 十八硅烷基;Spherisorb ODS,球形硅胶 Spherisorb 上键合了ODS。
流动相的pH降低,弱酸k增大,tR增大; 弱碱k变小。
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
反相键合相色谱法
离子抑制色谱法(ion
suppression chromatography;ISC )
的pH,抑制有机弱酸、弱碱的离解,增加疏 水缔合作用,使k变大。
用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液,调节流动相
适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
(二)流动相的强度和选择性
溶剂的极性(强度)
–正相色谱:溶剂极性越强,洗脱能力越强
–反相色谱:极性弱的溶剂洗脱能力强
溶剂的选择性
–不同种类的溶剂,分子间的作用力不同, 故选择性不同
混合溶剂(二元或多元流动相)
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
三、分离条件的选择
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
键合相的性质和特点
键合相的性质
–含碳量:含碳的百分数
–覆盖度 :已反应的硅醇基数目占硅胶表面 硅醇基总数的比例 –封尾(end-capping):在键合反应后,用 三甲基氯硅烷等进行钝化处理,减少残余硅 醇基。
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
键合相的性质和特点
键合相的特点
中不易流失,使用周期长;
柱效高;重现性好; 能使用的流动相和键合相的种类多,分离
的选择性高
正相(normal phase,NP)和反相 (reversed phase,RP)键合相色谱法:
根据化学键合相与流动相极性的相对强弱
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
(一)正相键合相色谱法
固定相:极性键合相
流动相:水为基础溶剂,加入一定量与水混溶
的极性调整剂 常用甲醇-水、乙腈-水等 应用:最广 非极性至中等极性的组分, (还有有机酸、碱及盐等)
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
保留机制
疏溶剂 (solvophobic theory)
溶质的保留主要是溶质 分子与极性溶剂分子间 的排斥力,促使溶质分 子与键合相的烃基发生 疏水缔合。
–使用过程中不流失; –化学稳定性好; –适于梯度洗脱; –载样量大
注意:
–流动相的pH一般应在3-8,否则会引起硅 胶溶解;(也有适用宽pH范围的键合相)。
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
二、化学键合相色谱法的流动相
对流动相的要求:
–与固定相不发生化学反应。
–对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内,
不是溶质分子与键合相 间的色散力。
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
反相键合相色谱法
保留行为的主要影响因素
–1、溶质的分子结构(极性)
极性越弱,疏水性越强,k越大,tR也越大。
同系物碳数越多,极性越弱,k越大; 引入极性取代基,降低疏水性,k值变小。
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
反相键合相色谱法
H =A + Cmu + Csmu
–原因:化学键合相,液体流动相
–结果:HPLC的实验条件应该是:① 小粒度、均匀的球形化学键合相;② 低粘度流动相,流速不宜过快;③柱 温适当。
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
(二)正相键合相色谱法的分离条件
固定相
–极性键合相 如氰基、氨基键合相 等
流动相
–烷烃加适量极性调节剂
–分配色谱法(partition chromatography)
–吸附色谱法(adsorption chromatography)
–离子交换色谱法(IEC) –空间排阻色谱法(SEC)
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
第一节 高效液相色谱法的主要类型和 原理
一、主要类型 四类基本类型色谱法 分配色谱法(partition chromatography) 吸附色谱法(adsorption chromatography) 离子交换色谱法(IEC) 空间排阻色谱法(SEC) 化学键合相色谱法
–如氰基(-CN)、氨基(-NH2)或二羟基 键合硅胶。(经典:水饱和的硅胶)
流动相:非极性或弱极性溶剂加极性调整剂
–如烷烃加醇类。(与水不混溶的溶剂)
适用范围:溶于有机溶剂的极性至中等极性
的分子型化合物 –如一些在硅胶柱上分离的物质
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
正相键合相色谱法
分离机制?
m
EBA A
m
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
影响容量因子的因素
–离子对试剂的种类和浓度:碳链长度增加,
溶质的k增大;在一定范围内试剂的浓度升高,
溶质的k增大
–流动相的pH:有利于组分和离子对试剂离子 化时(离子对的形成),组分的k值最大 –固定相 、流动相性质(同一般RP-HPLC)。
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
(三)反相键合相色谱法的分离条件
固定相 流动相
非极性键合相如ODS
以水为基础溶剂,加入甲醇、 乙腈等极性调节剂 –弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子抑制 剂 –加入0.1%~1%的醋酸盐、磷酸盐可减 少残余硅醇基的作用
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
(四)反相离子对色谱法的分离条件
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
二、化学键合相色谱法
以化学键合相为固定相的色谱法,简称键合
相色谱法(bonded phase chromatography; BPC)
化学键合相:采用化学反应的方法将官能团
键合在载体表面所形成的固定相
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
优点:
固定相的均一性和稳定性好,在使用过程
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
与经典液相色谱法相比
颗粒极细(一般为10m以下)、规则均匀的
固定相,(键合相)传质阻抗小,柱效高,分 离效率高; 快;
高压输液泵输送流动相,流速快,分析速度 高灵敏度检测器,灵敏度大大提高。紫外检
测器最小检测限可达109g,而荧光检测器最 小检测限可达1012g。
–与检测器相适应。例如用紫外检测器时,选 用截止波长小于检测波长的溶剂。 –纯度高,粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙 腈等可以降低柱压,提高柱效。
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
(一)流动相对分离的影响
n α -1 k2 R 4 α 1 k2
–n由色谱柱(固定相)性能决定, –α主要受溶剂种类的影响, –k受溶剂配比的影响。
非极性键合相 :
–非极性烃基,如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表 面; –用于反相色谱;
–长链烷基可使溶质的k增大,选择性改善,载样量 提高,稳定性更好。
第十八章
高效液相色谱法
仪器分析
键合相的种类
弱极性键合相:
–
醚基和二羟基等键合相
–用于反相或正相色谱
极性键合相: