天然产物活性成检测

陈羽迪2012332870002 12生物制药（1）

茶叶中茶多酚的粗提取与含量测定实验报告

一、实验目的：

1、了解并熟悉茶多酚的元素组成、结构构成、理化性质。

2、掌握溶剂萃取法粗提取茶多酚的原理与操作。

3、掌握酒石酸铁比色法测定茶多酚的含量的原理及操作。

4、了解分光光度计的使用方法和注意事项。

二、实验原理和应用：

茶多酚（Tea Polyphenols）是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中以黄烷醇类物质（儿茶素）最为重要。茶多酚又称茶鞣或茶单宁，是形成茶叶色香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一。研究表明，茶多酚等活性物质具解毒和抗辐射作用，能有效地阻止放射性物质侵入骨髓，并可使锶90和钴60迅速排出体外，被健康及医学界誉为“辐射克星”。

目前国内外茶多酚粗品的提取的方法主要有：溶剂萃取法、离子沉淀法、树脂吸附分离法、超临界流体萃取法、超声波浸提方法、微波浸提法等等。在这些提取茶多酚的方法中，每种方法都有它各自的针对性和使用范围，使用时要根据各自的情况而定。根据实验室的条件及实验要求，本实验采用溶剂萃取法对干茶叶中的茶多酚进行粗提取，即利用茶多酚易溶于乙酸乙酯等有机溶剂的原理进行液-液萃取。

茶多酚的测定方法有高锰酸钾直接滴定法和酒石酸铁比色法，由于高锰酸钾直接滴定法操作比较复杂，且靠肉眼观察颜色判断终点，如果样品溶液颜色较深时，可能影响测定结果。本实验将应用酒石酸铁比色法测定茶多酚的含量。酒石酸铁能与茶多酚生成紫褐色络合物，络合物溶液颜色的深浅与茶多酚的含量成正比。因此可以用比色方法测定。该法可避免高锰酸钾滴定法所产生的人为视觉误差。

三、实验仪器、材料和试剂

实验仪器：

分光光度计、干燥箱、电子天平、pH计、真空泵、纱布、漏斗、旋转蒸发仪、250ml 容量瓶、50ml 容量瓶、分液漏斗

实验材料：

干茶叶（市售散装茶即可）

实验试剂：

硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) ，酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O) ，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) ，磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) ，乙酸乙酯。

四、实验步骤与方法

1、溶液的配制

酒石酸亚铁溶液制备：称取0.25 g （准确至0.0001）硫酸亚铁，1.25 g酒石酸钾钠（准确至0.0001），用水溶解并定容至250 ml（低温保存，有效期10天）。

2、干茶叶的预处理

将干茶叶洗净、晾干，烘干，最后粉碎。粉碎的目的是与液体的接触面增大使提取率增高。由于试验条件的限制，用剪刀代替粉碎机将干茶叶剪碎，并且用研钵研细，干茶叶量为50. 00g。

3、茶多酚的粗提取与定性检测

称取经过预处理的干茶叶末30. 00g，加入250mL 90℃接近沸水中搅拌浸提、过滤，先后用250mL的乙酸乙酯萃取两次。合并两次有机相。减压蒸馏除去乙酸乙酯溶剂得黄色粉末状茶多酚。从外观上看，为黄色粉末状。物理性能为，易溶于水及乙醇，味苦涩。

4、茶多酚溶液的配置与含量的测定

称取步骤3中提取的茶多酚粉末0.2500g，加水溶解定容至250mL，混匀，即为每毫升含1mg步骤3中提取的茶多酚粉末的溶液。

分别取茶多酚溶液1. 0mL、2. 0mL、3. 0mL、4. 0mL于4个50mL容量瓶中，各加水至10mL，再加酒石酸亚铁溶液10mL，加入pH为7. 5的磷酸缓冲液至刻度，混匀后用1cm比色皿，以空白试剂作参比，于波长540nm处测定吸光度A，计算实验数据，并绘制实验数据表格。

五、实验现象和数据处理

将高山茶叶磨成粉末，加入蒸馏水得混有粉末的深绿色液体，水煮后颜色变黄，变为草绿色。乙酸乙酯萃取后，上层浅黄色透明溶液，下层墨绿色浑浊液体，两相间的乳化层有大

ω—茶多酚的含量(%)，A—样品溶液的吸光度值，T—样品溶液的总体积（mL）

V—测定用样品溶液的量(mL)，m—样品质量（g)

3.913—用1cm比色杯，当吸光度为1.0时，试液中茶多酚的浓度为3.913(mg/mL)

表 1 实验数据汇总

5、实验结果检验——绘制茶多酚标准曲线

根据步骤4中所得的实验数据，绘制茶多酚标准曲线，斜率R处于0.95-1.05之间方可达到实验要求。

表 2 绘制标准曲线所需数据

R=0.813

六、注意事项

1、磷酸盐缓冲液在常温下容易生长霉菌，放冰箱中保存或临用时现配。

2、茶多酚溶液应保持澄清，若溶解后溶液浑浊应先过滤。

3、实验前需仔细阅读分光光度计使用说明书及注意事项。

4、若茶多酚标准曲线斜率R不介于0.95-1.05之间，则实验数据无效。

七、实验结果与分析

本次实验，所采用的测定方法主要为酒石酸亚铁比色法。茶叶中多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色络合物，用分光光度法测定其含量。利用比色法进行测定，可以有效地避免由视觉产生的误差，加以检验后可以得到较为准确的数据。

但经实验证明，酒石酸亚铁比色法测定的茶多酚含量明显偏高。下表为杭州茶叶研究院用两种比色法测定茶叶中茶多酚含量的实验结果。

表 3 两种测定方法实验结果的比较

茶多酚含量（%）名称干物率

Folin试剂比色法酒石酸亚铁比色法龙井95.2 18.9 33.3

碧螺春92.9 20.6 26.9

特级滇红90.2 12.4 16.8

冻顶乌龙96.9 14.4 19.8

造成以上差异的原因有以下三点：第一，酒石酸亚铁比色法测得的是茶叶中多酚类物质的总含量，是亚铁离子与多酚类物质络合形成蓝紫色物质，在540nm处有最大吸收。而Folin 比色法测得的结果是茶叶中酚羟基被高价钨氧化后形成蓝色物质在765nm处有最大吸收。第二，酒石酸亚铁比色法在提取时采用沸水提取，而Folin比色法采用70%甲醇提取。第三，酒石酸亚铁比色法采用经验系数测算茶多酚的含量，而Folin比色法通过标准曲线换算茶多酚的含量。因此，可以得出Folin比色法在测定茶多酚含量的实验中测算更为准确。