分子生物学Ch12tan基因诊断与基因治疗

n PCR扩增因子VIII基因 的18号外显子142 bp片段 •142
bp
n Bcl I 限制酶 酶切位点在 • 99
基因内18号外显子3´端
bp
n 电泳染色,分析片段的 家系分布,作出产前诊断
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•父 母 儿 胎儿
•
( 先证者) (女)
分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
四、 肿瘤的基因诊断
• 三、遗传病的基因诊断
• 1、直接诊断策略 • 2、间接诊断策略
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
• （一）血红蛋白病 • 1.异常血红蛋白病 • 1、DNA检测与分析 •（1）PCR-限制酶谱分析法 •（2）Southern印迹杂交分析法 • 2、RNA检测与分析
• RT-PCR
基因 （Ⅳ）M、N均不杂交：可能是新突变
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•（2）诊断未知的点突变
• 常用检测方法： • ①PCR-SSCP • ②DNA芯片 • ③测序
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•①PCR-SSCP检测法 •单链构象多态性 •Single strand conformation polymorphism •SSCP
•2. 地贫 •(1)-地贫 •1）DNA检测与分析 •（a）RFLP •（b）PCR •2）RNA检测与分析
• RT-PCR
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•（2）-地贫的基因诊断 •1) DNA检测与分析 •（1）PCR-探针法 •（2）PCR-RFLP连锁分析法 •（3）DNA芯片技术 •2)RNA检测与分析
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镰状细胞贫血病（sickle cell aneamia）
•Mst II 酶切位点 CCTNAGG
•
GGANTCC
•点突变T A •CCANAGG •GGTNTCC
• 酶切 PPT文档演模板
凝胶电泳
Southern block
珠蛋白基因探针杂交 分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
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• 基本原理 • 单链DNA在中性溶液中可 形成一定的空间构象，构象与其 碱基顺序相关。因此当单链DNA 中碱基变异时，如碱基替换，它 的空间构象也发生一定变化。这 种现象称为单链构象多态性。
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• 关于多态性分析
• 基因组的核酸分子碱基排列顺序 在同种生物的不同个体之间或等位基 因之间存在差异的现象称为基因多态 性。 • DNA多态性可分为位点多态性 和重复序列多态性两种。
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•1、限制性片段长度多态 性（restriction fragment
2. 灵敏度高: 用放射性同位素、酶或化学发光试剂 标记探针，有很高的检测灵敏度，PCR扩增也有 很高的灵敏度。
3.早期诊断：无临床表现 4.取样方便：不受组织时相限制 5.安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型 6. 适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。
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•SS •AS •F •AA
•1.3kb •1.1kb
•0.2kb
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•RFLP法检测HbS •(放射性自显影图谱)
•AA:正常
•SS:HbS纯合子
•AS:HbS杂合子 •F:被检胎儿
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•（2）RFLP间接分析法——
•RFLP连锁分析法
• 甲型血友病
length polymorphism,RFLP）分 析
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• DNA分子中某些碱基的变
异（即位点多态性）可使某种
限制性核酸内切酶的切点消失
或出现新的切点，因此用同一
源自文库
种限制性核酸内切酶消化不同
个体的DNA分子时，会产生各
不相同的限制性片段类型。这
• 疾病种类：X染色体连锁性
遗传病
• 缺陷基因：凝血因子Ⅷ基
因
•
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主要临床表现：出血性疾 分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
• 应用PCR-RFLP连锁分析法
诊断甲型血友病
• 用一对引物扩增凝血因子Ⅷ
基因第18外显子内的一个142bp片
断，该片断含一个BclⅠ多态性位
点。酶解后，如果存在BclⅠ酶切
•正常人珠蛋白mRNA • GAG
•正常人珠蛋白肽链 • Glu
•HbS的珠蛋白基因
•6 •CAC
•HbS的珠蛋白mRNA •GUG
•HbS的珠蛋白肽链
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•Val
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•MstⅡ酶切位点
•MstⅡ酶
•A •T•替换 •CCTNAGG
•CCTNTGG
•2、DNA重复序列多态性分析
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•（三）基因表达异常的诊断
•1、mRNA的定量分析
•（1）相对定量
• 斑点杂交
• RT-PCR
•（2）绝对定量
•2、mRNA长度分析
• Northern印迹杂交
•
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RT-PCR
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•
• 正常基因：设计寡核苷酸探针 M •GGTACGATGCGGTTAACGCG •CCATGCTACGCCAATTGCGC
•突变基因：设计寡核苷酸探针N
•GGTACGATGTGGTTAACGCG
•CCATGCTACACCAATTGCGC
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•HbA •---------CCT GAG GAG------•MstⅡ •MstⅡ•MstⅡ •1.1kb •0.2kb
•HbS •---------CCT GTG GAG-------
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•1.3kb
分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
分子生物学Ch12tan基因诊断与基因
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治疗
•M N
•M N
•M N
•M N
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杂交的结果：
（Ⅰ）受检者DNA与 N 杂交，与M不杂交：突 变基因纯合子
（Ⅱ）与M、N都能杂交：突变基因杂合子 （ Ⅲ）与M 杂交，与N不杂交：没有这种突变
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• ② 限制酶识别位点之间的 DNA序列缺失、插入或重组， 限制酶识别序列不发生变化， 但它在基因组中的位置发生 了变化。这种多态性可以有 两个或两个以上的等位片断。
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•RFLP分析法 • 限制酶酶切图谱直接分析法 • RFLP间接分析法
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•抑癌基因p53的检测
•1、常见突变类型： •点突变突变热点在5~8号外显子，有少量插 入或缺失
•2、常检测方法 •（1）PCR-SSCP •（2）PCR结合序列分析 •（3）PCR-RFLP
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
分子生物学Ch12-tan基 因诊断与基因治疗
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2020/11/10
分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•基因诊断的概念：
•以DNA和RNA为诊断材料， 应用分子生物学技术方法， 直接检查基因的结构、或表 达是否异常，对人体状态和 疾病作出诊断的方法。
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
种现象称为限制性片段长度多
态性。
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
• 限制酶酶切位点的改变 造成的RFLP可分为两种情况： • ① 限制酶识别位点发生单 个碱基置换，导致酶切位点消 失或获得，此称为点多态性。 这种多态性只有两个等位片断， 即多态位点的有或无。
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二、基因诊断的内容和技术
n 直接诊断___致病基因明确 n 间接诊断___致病基因不明确，
基因连锁分析 n 分子基础——基因结构异常
基因表达异常
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
基因诊断的常用技术类型
（1） DNA序列测定 （2）核酸分子印迹杂交 （3）聚合酶链反应（PCR）
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• 4、基因重排（染色体易位）的 诊断 • 常采用PCR法
•引物1 •引物2
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•引物3
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•5、基因扩增的诊断
• 常采用Southern印迹杂 交定量法
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用途——诊断下列两种类型疾 病：
1、内源基因的变异
2、外来生物的入侵
基因致病
基因结构的异常 基因表达的异常
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第一节 基因诊断
一、基因诊断的特点：
1.特异性高，针对性强： 使用基因探针通过分子杂 交进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于 病因诊断或发病原因分析。
一)肿瘤基因诊断的策略 1、检测肿瘤标记基因或mRNA 2、检测肿瘤相关基因 3、检测肿瘤相关病毒基因
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• （二） 肿瘤相关基因的检测
• ras癌基因的检测
•1、常见突变类型： •点突变（突变热点在12、13、61位密码子的 编码区） •2、常用检测方法 •（1）PCR-ASO •（2）PCR-SSCP
位点，则产生99bp和43bp两个片
断；如果不存在则只有142bp一个
片断。研究证明，142bp片断与甲
型血友病基因连锁。
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•142bp •99bp
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•正常男性 •先证者
•女性携带者
•胎儿绒毛样品 分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
单链构象多态性检测PCR-SSCP 限切酶酶谱分析PCR-RFLP 随机引物分析 PCR-RAPD （4） DNA芯片技术
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针对不同突变类型的基因诊断 技术
1、点突变的诊断 n PCR结合点杂交 n DNA芯片技术 n 限制性片断长度多态性分析法RFLP
五、感染性疾病的基因诊断
n 目前应用最多是PCR法，不仅可检测病 原体的DNA（如乙肝病毒、巨细胞病毒、 乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可检 测RNA病原体（RT-PCR检测艾滋病病 毒、丙肝病毒等）。
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应用范围
1. 可快速准确查出致病病原体; 2.适于早期诊断、带菌带毒者和潜
• 单链DNA在非变性聚丙 烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移 率不仅与链长有关，还与单链 DNA的空间构象有关，因此碱 基变异引起的构象变化也可改 变单链DNA的电泳迁移率。
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•dsDNA •ssDNA
•高温变性，快速冰浴
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•野生型DNA •突变型DNA
• RT-PCR
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C地中海贫血 珠蛋白基因3’端缺失0.6 kb
•Bgl II
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•Bgl
•A
II
•C
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（二）血友病A
n factor VIII 基因缺陷（碱 基取代、缺失或插入等）
n 基因产物凝血因子VIII 无 活性或不稳定，导致凝血 障碍。
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•（1）限制酶酶切图谱直接分析 法
• ① 限制酶酶切—Southern印 迹杂交。
• ② PCR—限制酶酶切
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•应用RFLP诊断镰刀状红细胞性贫血
•正常人珠蛋白基因
•6 •CTC
•点样
孔
•慢
•快
•SSCP原理示意图 分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
2、少数核苷酸缺失或插入突 变的诊断
方法同点突变的诊断
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•3、大片断缺失或插入突变的诊 断
• 常采用P•C致病R基法
•引物1 •引物因3
•引物4 •引物2
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