分子生物学Ch12tan基因诊断与基因治疗
12基因诊断与基因治疗
将在凝胶上显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型。
优点：简单，较高的敏感性，可同时分析多个样本。
（三）基因测序
是最直接、最准确的基因诊断技术
病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(G→T)，左侧正常
对照第225位碱基为C，而该患儿为A（反义链中）。
GAG——GTG Glu——Val
已知限制酶Mst 1识别序列 （CCTNAGG）
CCTGAGG
CCTGTGG 突变后不能识别 酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。
Southern blot
（二）PCR技术
巢式PCR 多重PCR RT-PCR 实时PCR 联合PCR
mRNA特异性的互补结合即抑制了该mRNA的翻译，
是原核生物基因表达调控的一种方式，在真核生物中 也存在反义RNA。
特点 （l）安全性高，专一性强，效率高。反义RNA只作用 于特异的mRNA 分子，不改变所调节基因的结构。反 义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解， 不留“残渣” （2）设计和制备方便 （3）具有剂量调节效应 （ 4 ）在治疗 RNA 病毒感染性疾病时有更大的优势。 能直接作用于一些RNA病毒，阻断RNA病毒的繁殖
靶细胞 载体 目的基因
in vivo
（五）治疗基因表达的检测
无论以何种方法导入基因，都需要检
测这些基因是否能被正确表达。被导入基
因的表达状态可以用 PCR 、 RNA 印迹、
蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导
入基因是否整合到基因组以及整合的部位，
可以用DNA印迹技术进行分析。
分子生物学 Ch12-tan 基因诊断与基因治疗
5、基因扩增的诊断
常采用Southern印迹杂 交定量法
关于多态性分析
基因组的核酸分子碱基排列顺序 在同种生物的不同个体之间或等位基 因之间存在差异的现象称为基因多态 性。
DNA多态性可分为位点多态性 和重复序列多态性两种。
1、限制性片段长度多态性 （restriction fragment
（1） DNA序列测定 （2）核酸分子印迹杂交 （3）聚合酶链反应（PCR）
单链构象多态性检测PCR-SSCP 限切酶酶谱分析PCR-RFLP 随机引物分析 PCR-RAPD （4） DNA芯片技术
针对不同突变类型的基因诊断 技术
1、点突变的诊断 PCR结合点杂交 DNA芯片技术 限制性片断长度多态性分析法RFLP
正常男性 先证者
142bp 99bp
女性携带者 胎儿绒毛样品
2、DNA重复序列多态性分析
（三）基因表达异常的诊断 1、mRNA的定量分析 （1）相对定量
斑点杂交
RT-PCR （2）绝对定量
2、mRNA长度分析 Northern印迹杂交
RT-PCR
三、遗传病的基因诊断
1、直接诊断策略 2、间接诊断策略
（2）可使靶细胞变成稳定表达 目的基因的转化细胞；
（3）感染靶细胞后不扩散； （4）假病毒感染靶细胞的效率 非常高；
（5）不感染非增殖细胞。
4、安全性问题 （1）感染的可能性 （2）污染的可能性 （3）在靶细胞基因组中的整合
（二）腺病毒载体 1、结构
E1A E1B L1~L5 E2B
E3
E2A
E4
（四）转染靶细胞的筛选和导 入基因的鉴定
1、选择靶细胞应考虑因素 （1）组织特异性细胞； （2）易获得、寿命长 （3）离体细胞易受外源遗传物 质转化；
知识点2 基因诊断和基因治疗
表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得到加强。 目前基因治疗多采用此种方式。 ④基因失活：早期一般是指反义核酸技术。它是将特定 的反义核酸，包括反义RNA、反义DNA和核酶导入细胞，
在翻译和转录水平阻断某些基因的异常表达。近年来又
有反基因策略、肽核酸、基因去除和RNA干扰技术。
（2）基因治疗的两种途径
（3）科学家对基因治疗发展的推测
①随着电脉冲技术的完善和表达调控系统的突破，基因 药物，即基因DNA通过肌肉导入而表达并分泌其蛋白产 物，将成为基因工程多肽药物的重要竞争者和基因治疗 延伸的重要领域。
②随着技术的发展，不少非分泌性蛋白也将可以组建
融合基因，从而通过基因工程表达，形成新的基因工
程多肽药物。届时，基因治疗和基因工程的相互竞争 局面将会出现。最终的结果，可能以各种基因的具体 情况来判断孰优孰劣。
（1）目前基因治疗所采用的方法 ①基因矫正：将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常
部分予以保留。
②基因置换：用正常基因通过体内基因同源重组，原位 替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复 正常状态。
③基因增补：将目的基因导入病变细胞或其他细胞，不
去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其
知识点2
基因诊断和基因治疗பைடு நூலகம்
要 点 归 纳
1.基因诊断
基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的
技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常， 从而对疾病作出诊断的方法。
（1）基因诊断的特点
①以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，
针对性强。 ②分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，具有很高的 特异性。 ③分子杂交和聚合酶链反应都具有放大效应，诊断灵敏度 很高。 ④适用性强，诊断范围广，检测目标可为内源基因也可为
生物化学及分子生物学(人卫第九版)-26基因诊断与基因治疗
基因诊断与基因治疗
作者 : 李存保 单位 : 内蒙古医科大学
目录
第一节 基因诊断
第二节 基因治疗
重点难点
掌握
基因诊断与基因治疗的概念
熟悉
基因诊断技术、基因治疗的基本策略和基本程序
了解
基因诊断和基因治疗在医学中的应用
第1节
基因诊断
一、基因诊断的概念与特点
（1） 基因诊断的概念：
是指利用分子生物学技术和方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而 对疾病作出诊断的方法。
（2）直接体内疗法
临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液 和尿液等。
三、基因诊断的基本技术
（一）核酸分子杂交技术
1. Southern 印迹法 其可以区分正常和突变样品的基因型，并可获得基因缺失或插入片段大小等信息。 DNA印迹一般可以显示50 bp～20 kbp的DNA片段，片段大小的信息是该技术诊断基因缺 陷的重要依据。 2. Northern 印迹法 Northern印迹法（Northern blot）能够对组织或细胞的总RNA或mRNA进行定性 或定量分析，及基因表达分析。Northern印迹杂交对样品RNA纯度要求非常高，限制了 该技术在临床诊断中的应用。
是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗，即通过一定方式将人 正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因 的治疗方法。它针对的是疾病的根源，即异常的基因本身。
一、基因治疗的基本策略
（一）缺陷基因精确的原位修复
1.基因矫正 gene correction 致病基因的突变碱基进行纠正 2.基因置换 gene replacement 用正常基因通过重组原位替换致病基因 这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整个基因组的结构，又可达到治 疗疾病的目的，是最为理想的治疗方法。
【高中生物】高中生物知识点：基因诊断与基因治疗
【高中生物】高中生物知识点：基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗：1、基因诊断技术的原理（1）基因诊断：是用放射性同位素（如32P）、荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测样本上的遗传信息，从而达到检测疾病的目的。
（2）基因诊断的对象主要包括病原微生物的侵入，先天遗传性疾病和后天基因突变引起的疾病等方面。
目前，基因诊断已在病毒性肝炎、艾滋病等传染病的诊断中发挥了不可替代的作用。
（3）通过基因诊断的方法检测其发生突变的基因，对于临床诊断、了解发病机理和疾病治疗都具有重要的意义。
（4）基因诊断的应用：传统诊断遗传疾病的方法是通过表现型来推测基因型。
基因诊断则是从基因着手来推断表现型，这种方法不受细胞类型和发病年龄的限制，可用于一切遗传病的诊断。
如半乳糖血症是一种先天性糖代谢缺陷症，通过基因诊断，发现病人缺少一个合成半乳糖转移酶的基因。
如果把半乳糖转移酶的基因转入缺乏这一基因的人体中，便可以使他的缺陷症状得到改善。
2、基因治疗的发展前景（1）基因治疗：就是把特定的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，从而达到治疗疾病的目的。
（2）基因治疗恶性肿瘤的方案有两种：①杀死肿瘤细胞??将抑制癌细胞增生的基因转入到癌细胞内，不仅可以阻断癌细胞繁殖，还可以诱导它自杀死亡；或将一段可以抑制癌基因转录的DNA序列导入癌细胞，使癌基因不能表达，癌细胞也就不能增殖。
②将提高人体免疫力的基因导入免疫系统，以提高人体防御功能，由人体免疫系统杀死癌细胞。
（3）基因治疗的步骤：选择治疗基因→将治疗基因和运载体结合导入到患者体内→治疗基因在细胞内正常表达。
知识拓展：1、基因芯片：是将大量特定序列的DNA片段有序的固定在尼龙膜、玻片或硅片上，从而能大量、快速、平行地对DNA分子的碱基序列进行测定和定量分析。
2、基因芯片的应用：用于寻找和鉴定与疾病相关的基因；用于传染病的检测。
例肿瘤细胞的检测、预测老年痴呆、糖尿病，艾滋病、前列腺癌等。
生命科学中的分子生物学和基因治疗
生命科学中的分子生物学和基因治疗生命科学中的分子生物学与基因治疗随着科技的日新月异和医学的不断进步，人类对于生命和疾病的认识也越来越深刻。
分子生物学和基因治疗作为两个重要的研究领域，在人类健康领域发挥着重要的作用。
分子生物学研究的是生命机理的基本单位——分子，而基因治疗则是利用基因修复技术治疗疾病。
本文将分别对于分子生物学与基因治疗做更为深入的探讨。
一、分子生物学1.1 什么是分子生物学分子生物学是一门研究生物分子的学科，主要是研究生命体的分子结构、能量转化和分子机理等方面。
它以细胞和分子为中心，着重研究生命的组成和性质，以及生命过程中所涉及的基本化学反应和机理。
分子生物学的研究范围广泛，包括蛋白质、核酸、糖类、脂质等生物分子的结构、功能及相互作用等，是现代生命科学中的基础学科之一。
1.2 分子生物学的应用随着生命科学的发展，越来越多的领域开始应用分子生物学的技术。
例如生物工程、细胞工程、基因工程、克隆技术等，都是基于分子生物学的基础理论和技术发展而来的。
同时，在医学领域中，分子生物学也扮演着越来越重要的角色。
例如分子诊断、分子病理学和分子药理学等都是分子生物学技术在医学领域中的应用。
1.3 分子生物学的意义分子生物学在科学研究、医药工业和生物技术领域中都有着重要的作用。
分子生物学的研究成果为基础研究和应用研究提供了关键性的支撑，同时也可以帮助人们更好地理解生命中的基本机理和科学道理。
二、基因治疗2.1 什么是基因治疗基因治疗是利用基因修复技术治疗疾病的一种方法。
这种方法主要是通过改变人类基因的功能来修复或治疗疾病。
基因治疗主要分为三种类型：基因替换、基因增强和基因抑制。
2.2 基因治疗的意义基因治疗是目前医学研究中的一个热点领域，也是未来医学发展趋势之一。
尤其是对于遗传性疾病的治疗，基因治疗有希望成为未来最有效的治疗手段之一。
目前基因治疗已被应用于多种疾病的治疗，例如血友病、囊性纤维化、肌萎缩侧索硬化等，未来还有更加广阔的发展前景。
基因诊断和基因治疗
根据解读结果进行临床诊断，为患者提供针对性 的治疗方案。
遗传咨询
为患者和家属提供遗传咨询服务，解释疾病遗传 特点、风险及预防措施等。
基因治疗概述
03
基因治疗的定义和目的
基因治疗的定义
基因治疗是指将正常或外源基因导入人体细胞，以纠正或补偿因基因缺陷引起的 疾病。
基因治疗的的目的
基因治疗旨在从根本上治疗疾病，而不是仅仅缓解症状。通过修复或替换缺陷基 因，可以消除疾病的根源，使患者获得更持久的治疗效果。
目的
基因诊断旨在预测和诊断遗传性疾病，指导精准医疗，以及实现个体化治疗。
基因诊断的技术方法
1 2
基于DNA测序的检测
包括直接测序、聚合酶链反应（PCR）、单链构 象多态性分析（SSCP）等。
基于生物芯片的检测
包括基因表达谱芯片、单基因突变检测芯片等。
基于细胞遗传学的检测
包括荧光原位杂交（FISH）、染色体微阵列分析 （CMA）等。
总结词
肿瘤的基因治疗是一种新型的治疗方法，通过纠正肿 瘤细胞中的异常基因，抑制肿瘤的生长和扩散。
详细描述
肿瘤的基因治疗是一种具有潜力的治疗方法，通过导 入外源基因或使用抑制基因的表达来抑制肿瘤的生长 和扩散。例如，利用病毒载体将抑癌基因导入肿瘤细 胞中，可以抑制肿瘤细胞的生长。此外，通过抑制某 些与肿瘤转移相关的基因的表达，也可以降低肿瘤的 转移能力。
未来，基因诊断和基因治疗将在肿瘤、遗传性疾病等领 域发挥重要作用，提高患者生存率和改善生活质量。同 时，随着技术的进步和应用范围的扩大，基因诊断和基 因治疗还将有助于解决人类面临的重大健康问题。
案例分析：基因诊
06
断和基因治疗的应
用实例
生物化学及分子生物学(人卫第八版)-第25章-基因诊断与基因治疗
基因分型 检测基因突变
测定基因拷贝数 测定基因表达产物量
分子杂交
信号检测
基因诊断的基础
DNA序列分析技术 几种技术联合使用
目录
（一）基因缺失或插入的诊断
1．DNA印迹法
其可以区分正常和突变样品的基因型，并可获得 基因缺失或插入片段大小等信息。 DNA 印迹一般可 以显示50 bp～20 kbp的DNA片段，片段大小的信息 是该技术诊断基因缺陷的重要依据。
血、血友病等。基本方案是通过一定的方法
把正常的基因导入到病人体内，表达出正常
的功能蛋白。
目录
2.针对多基因病的基因治疗 由多个基因相互作用结果，并受环境因素影 响而发生的疾病属于多基因病，如高血压、动脉 粥样硬化、糖尿病、肿瘤等。 恶性肿瘤的基因治疗包括：针对癌基因表达 的各种基因沉默、针对抑癌基因的基因增补、针 对肿瘤免疫反应的细胞因子基因导入和针对肿瘤 血管生成的基因失活等等。
目录
（二）基因增补
不删除突变的致病基因，而在基因组的某
一位点额外插入正常基因，在体内表达出功能
正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的。这种对
基因进行异位替代的方法称为基因添加（ gene augmentation ）或称基因增补，是目前临床上 使用的主要基因治疗策略。
目录
（三）基因沉默或失活
有些疾病是由于某一或某些基因的过度表 达引起的，向患者体内导入有抑制基因表达作 用的核酸，如反义RNA、核酶、干扰小RNA等，
因的表达状态可以用 PCR 、 RNA 印迹、
蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导
入基因是否整合到基因组以及整合的部位，
可以用DNA印迹技术进行分析。
目录
三、基因治疗的临床应用现状
分子生物讲义：第五章 基因诊断和基因治疗
基因诊断
应用分子生物学技术，从DNA/RNA水平 检测分析致病基因的存在、变异和表达 状态从而对疾病作出诊断的诊断技术
诊断技术进展
细胞学检查：第一代，早期 生化指标分析：第二代，50年代 免疫学诊断：第三代，60年代
以疾病的表型改变，如细胞形态结构 变化、生化代谢产物异常、特定蛋白质 分子识别差异等为依据进行疾病诊断 基因诊断：第四代，70年代
（一）原位（in situ）杂交
不须提取DNA或RNA。直接用培养/采集 的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固 定载玻片上）和细菌菌落（复印至泸膜 上）与标记核酸探针杂交。可测知特定 基因的存在或表达状况。还可观察被测 基因在细胞内或染色体上的定位。
（二）斑点印迹（Dot blot） 杂交
把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸 纤维膜或尼龙膜（下同）上与标记核酸 探针杂交。可检测特定基因的存在或表 达情况。
Southern印迹杂交
系将DNA经限制性酶切、凝胶电泳后， 再转移至膜上与标记探针杂交的一种核 酸分子杂交技术。其分析的特异性、敏 感性、准确性俱佳。它可检出哺乳动物 总基因组中的单拷贝基因。主要用于检 测基因组中特定的基因或序列。
Northern印迹杂交
是把RNA经凝胶电泳转移至膜上与标记 核酸探针杂交的技术。是分析基因表达 水平的主要技术之一。它可定性、定量 测知某一特定基因的表达情况。
（三）PCR-SSCP
该技术是基于不同的单链DNA（即使只差一个碱基） 有不同的空间构象，即DNA单链构象多态性(Singer Strand conformation polymorphysim,SSCP)。
这些不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 中的迁移率是不同的。据此，将PCR扩增产物变性成单 链DNA，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可测知DNA碱基序 列有无变异。
医学生物化学(第二十一章)基因诊断与基因治疗
6 问题及展望
• 基因治疗的安全性问题（2次事故）:
– 靶向性；
– 基因整合位点； – 表达调控。
四、基因治疗的临床实验
1 基因标记 2 单基因疾病
基因了解 少量表达矫正作用 过度表达无不良作用 特殊细胞基因缺损 增补基因时效性
3 恶性肿瘤
（1）免疫基因治疗 （2）自杀基因系统 （3）抑癌基因 （4）裂解肿瘤病毒
4 病毒性感染
（1）增强机体的抗HIV免疫反应 （2）抑制HIV的复制
5 心血管疾病
诊断出点突变。
（2）诊断原理
在人群中，个体间DNA的核苷酸序列
存在差异，称为DNA多态性。DNA多态性
可以改变限制性内切酶的切割位点，产生
DNA限制性片段长度多态性（restriction
fragment lenth polymorphism, RFLP）。
6
RFLP按照孟德尔方式遗传，在某一特定 家族中，如果某一种致病基因与特异的 多态性片段紧密连锁，就可利用这一多 态性片段作为一种遗传性标志来判断家 族成员或胎儿的基因组中是否携带致病 基因。
③ 针结合处在光胶片上呈阳性斑点
20
3）mRNA的检测
（1）原理 通过对mRNA进行定量、检测其 剪接 加工的缺陷以及外显子变异等判断基因能 否转录、转录物（mRNA）是否正常以及 转录效率的高低。
22
*mRNA不稳定可将其转为cDNA再用 PCR技术进行研究（RT-PCR）
23
（2）应用
视网膜母细胞瘤：Rb基因缺陷
与受检者DNA 进行分子杂交
发生杂交 (纯和子 ）
均可杂交 （杂和子）
与异常 不发生杂交 与正常发生杂交
16
17
浅谈基因诊断与基因治疗
浅谈基因诊断与基因治疗摘要：随着时代的迈进，基因诊断与基因治疗这项新技术作为一种新的医疗手段肯定会为社会中被疾病困要的患者带来福音，但这项技术涉及的伦理问题以及社会问题，我们必须面对以及及时解决。
基因诊断与基因治疗是上世纪晚期发展起来的一种全新的临床诊断与治疗方法和手段，基因诊断与基因治疗具有潜在的独特价值和有效性，所以在临床得到了青睐。
可谓是病患者的一大福音。
但是这一新方法的使用在目前不仅涉及技术问题，而且存在着极其复杂的伦理问题和社会问题，需要加以认真思考以及对待。
一、什么叫做基因诊断与基因治疗基因诊断：由于互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，而且这种结合是特异的。
因此，当把一段用放射性同位素、荧光分子或者化学催化剂等标记的已知基因的核酸序列作为探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基能够配对，它们即可以互补结合成为双链。
据此就可以检出被测DNA中含有的基因序列，从而达到检测疾病的目的。
基因治疗：它是将健康的外源基因导入靶细胞，纠正或者是补偿因基因缺陷或异常引起的疾病，已达到治疗的目的。
换句话说，也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。
从广义上说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。
例如，用5-氮胞苷治疗镰刀细胞贫血和β-地中海贫血。
二、基因诊断与基因治疗过程中所遇到的伦理问题基因诊断遇到的伦理问题：1，对于身患绝症的患者做基因诊断是否符合医学伦理学要求？2，目前已经开始应用的基因诊断方法所测得的结果是否可靠？3，患者在诊断过程中出现的一系列心理问题，医生是否应负责任？4，基因诊断室规则是否确实严格遵守，并足以证明或确保其诊断结果不会因误差而造成？5，被诊断为基因缺陷阳性的人如何得到法律保障，使他们不受人寿保险、招聘单位和社会的歧视？基因治疗遇到的伦理问题：1，体细胞基因治疗的伦理问题；（体细胞基因治疗首先发展于美国。
《论文_分子生物学论文基因治疗与基因诊断的研究与发 展(定稿)》
分子生物学论文基因治疗与基因诊断的研究与发展摘要：基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于分子生物学的理论及技术方法，特别是重组DNA 技术的迅速发展，使人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因。
所以对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。
因此在20 世纪70 年代末诞生了基因诊断随gene diagnosis；后于1990 年美国实施了第一个基因治疗gene therapy的临床试验方案。
可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和技术与医学相结合的范例。
关键词：基因治疗基因诊断重组DNA1．引言20 世纪后半叶以来，由于分子生物学的崛起，人们进入了合成代谢与代谢调节的研究。
这一阶段，细胞内两类重要的生物大分子---蛋白质与核酸，成为研究焦点。
20 世纪50 年代初期发现了蛋白质的α螺旋的二级结构形式；更具里程碑意义的是1953 年提出的DNA 双螺旋结构模型，为揭示遗传信息传递规律奠定了基础，是生物化学发展进入分子生物学时期的重要标志。
20 世纪70 年代，重组DNA 技术的建立不仅促进了对基因表达调控机制的研究，使基因操作无所不能，而且使人们主动改造生物体成为可能。
基因诊断和基因治疗也是重组DNA 技术在医学领域应用的重要方面。
随着对各种疑难疾病的深入研究，和分子生物学日新月异的发展，传统的诊断治疗手段无法解决的一些重要问题。
通过对生物体在分子水平上的研究，基因诊断与治疗的作用逐渐显露出来，尤其是许多遗传疾病。
传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。
现知各种表型的改变是由基因异常造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。
基因诊断是指采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA 水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。
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• 关于多态性分析
• 基因组的核酸分子碱基排列顺序 在同种生物的不同个体之间或等位基 因之间存在差异的现象称为基因多态 性。 • DNA多态性可分为位点多态性 和重复序列多态性两种。
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•1、限制性片段长度多态 性（restriction fragment
•2. 地贫 •(1)-地贫 •1）DNA检测与分析 •（a）RFLP •（b）PCR •2）RNA检测与分析
• RT-PCR
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•（2）-地贫的基因诊断 •1) DNA检测与分析 •（1）PCR-探针法 •（2）PCR-RFLP连锁分析法 •（3）DNA芯片技术 •2)RNA检测与分析
• 疾病种类：X染色体连锁性
遗传病
• 缺陷基因：凝血因子Ⅷ基
因
•
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主要临床表现：出血性疾 分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
• 应用PCR-RFLP连锁分析法
诊断甲型血友病
• 用一对引物扩增凝血因子Ⅷ
基因第18外显子内的一个142bp片
断，该片断含一个BclⅠ多态性位
点。酶解后，如果存在BclⅠ酶切
五、感染性疾病的基因诊断
n 目前应用最多是PCR法，不仅可检测病 原体的DNA（如乙肝病毒、巨细胞病毒、 乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可检 测RNA病原体（RT-PCR检测艾滋病病 毒、丙肝病毒等）。
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
应用范围
1. 可快速准确查出致病病原体; 2.适于早期诊断、带菌带毒者和潜
•点样
孔
•慢
•快
•SSCP原理示意图 分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
2、少数核苷酸缺失或插入突 变的诊断
方法同点突变的诊断
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•3、大片断缺失或插入突变的诊 断
• 常采用P•C致病R基法
•引物1 •引物因3
•引物4 •引物2
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二、基因诊断的内容和技术
n 直接诊断___致病基因明确 n 间接诊断___致病基因不明确，
基因连锁分析 n 分子基础——基因结构异常
基因表达异常
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
基因诊断的常用技术类型
（1） DNA序列测定 （2）核酸分子印迹杂交 （3）聚合酶链反应（PCR）
用途——诊断下列两种类型疾 病：
1、内源基因的变异
2、外来生物的入侵
基因致病
基因结构的异常 基因表达的异常
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
第一节 基因诊断
一、基因诊断的特点：
1.特异性高，针对性强： 使用基因探针通过分子杂 交进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于 病因诊断或发病原因分析。
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•HbA •---------CCT GAG GAG------•MstⅡ •MstⅡ•MstⅡ •1.1kb •0.2kb
•HbS •---------CCT GTG GAG-------
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•1.3kb
分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
位点，则产生99bp和43bp两个片
断；如果不存在则只有142bp一个
片断。研究证明，142bp片断与甲
型血友病基因连锁。
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•142bp •99bp
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•正常男性 •先证者
•女性携带者
•胎儿绒毛样品 分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•正常人珠蛋白mRNA • GAG
•正常人珠蛋白肽链 • Glu
•HbS的珠蛋白基因
•6 •CAC
•HbS的珠蛋白mRNA •GUG
•HbS的珠蛋白肽链
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•Val
分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•MstⅡ酶切位点
•MstⅡ酶
•A •T•替换 •CCTNAGG
•CCTNTGG
分子生物学Ch12tan基因诊断与基因
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治疗
•M N
•M N
•M N
•M N
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
杂交的结果：
（Ⅰ）受检者DNA与 N 杂交，与M不杂交：突 变基因纯合子
（Ⅱ）与M、N都能杂交：突变基因杂合子 （ Ⅲ）与M 杂交，与N不杂交：没有这种突变
2. 灵敏度高: 用放射性同位素、酶或化学发光试剂 标记探针，有很高的检测灵敏度，PCR扩增也有 很高的灵敏度。
3.早期诊断：无临床表现 4.取样方便：不受组织时相限制 5.安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型 6. 适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
基因 （Ⅳ）M、N均不杂交：可能是新突变
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•（2）诊断未知的点突变
• 常用检测方法： • ①PCR-SSCP • ②DNA芯片 • ③测序
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•①PCR-SSCP检测法 •单链构象多态性 •Single strand conformation polymorphism •SSCP
length polymorphism,RFLP）分 析
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
• DNA分子中某些碱基的变
异（即位点多态性）可使某种
限制性核酸内切酶的切点消失
或出现新的切点，因此用同一
种限制性核酸内切酶消化不同
个体的DNA分子时，会产生各
不相同的限制性片段类型。这
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•
• 正常基因：设计寡核苷酸探针 M •GGTACGATGCGGTTAACGCG •CCATGCTACGCCAATTGCGC
•突变基因：设计寡核苷酸探针N
•GGTACGATGTGGTTAACGCG
•CCATGCTACACCAATTGCGC
n PCR扩增因子VIII基因 的18号外显子142 bp片段 •142
bp
n Bcl I 限制酶 酶切位点在 • 99
基因内18号外显子3´端
bp
n 电泳染色,分析片段的 家系分布,作出产前诊断
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•父 母 儿 胎儿
•
( 先证者) (女)
分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
四、 肿瘤的基因诊断
分子生物学Ch12-tan基 因诊断与基因治疗
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2020/11/10
分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•基因诊断的概念：
•以DNA和RNA为诊断材料， 应用分子生物学技术方法， 直接检查基因的结构、或表 达是否异常，对人体状态和 疾病作出诊断的方法。
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
• ② 限制酶识别位点之间的 DNA序列缺失、插入或重组， 限制酶识别序列不发生变化， 但它在基因组中的位置发生 了变化。这种多态性可以有 两个或两个以上的等位片断。
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•RFLP分析法 • 限制酶酶切图谱直接分析法 • RFLP间接分析法
•SS •AS •F •AA
•1.3kb •1.1kb
•0.2kb
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•RFLP法检测HbS •(放射性自显影图谱)
•AA:正常
•SS:HbS纯合子
•AS:HbS杂合子 •F:被检胎儿
分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•（2）RFLP间接分析法——
•RFLP连锁分析法
• 甲型血友病
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
• 基本原理 • 单链DNA在中性溶液中可 形成一定的空间构象，构象与其 碱基顺序相关。因此当单链DNA 中碱基变异时，如碱基替换，它 的空间构象也发生一定变化。这 种现象称为单链构象多态性。
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•抑癌基因p53的检测
•1、常见突变类型： •点突变突变热点在5~8号外显子，有少量插 入或缺失
•2、常检测方法 •（1）PCR-SSCP •（2）PCR结合序列分析 •（3）PCR-RFLP
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单链构象多态性检测PCR-SSCP 限切酶酶谱分析PCR-RFLP 随机引物分析 PCR-RAPD （4） DNA芯片技术
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
针对不同突变类型的基因诊断 技术
1、点突变的诊断 n PCR结合点杂交 n DNA芯片技术 n 限制性片断长度多态性分析法RFLP
• RT-PCR
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
C地中海贫血 珠蛋白基因3’端缺失0.6 kb
•Bgl II
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•Bgl