第二章 授精技术

2 、冷冻损伤易感性的决定因素
2.1 甘油对不同品种精液冷冻保存的利 弊效应 牛、野生反刍动物及灵长类 4-8% ， 猪 <=3% ，鼠 <= 1.75% 有袋类 4-8%：刷尾猫70-90%存活， 肥尾 dunnart 仅3%存活 ，15-20%甘油对 刷尾猫仍很好 膜通透性的品种差异造成的，还受膜 结构和功能的影响




卵母细胞IVM培养 IVF技术 精子获能 受精卵体外培养


一、卵母细胞体外成熟 （in vitro maturation，IVM）

①体内成熟 成熟卵母细胞



②体外成熟（IVM） ①超排，采取成熟卵泡内的卵母细胞或 从输卵管内回收刚刚排出的卵母细胞； ②采集卵泡中未成熟的卵母细胞，体外 培养成熟。
2、成熟培养时间
一般22h -24h，但猪40h-44h，马30h-36h， 兔仅12h-15h
3、成熟培养的温度和气相环境
人和啮齿类动物：37℃ 牛、猪、羊和马等：38℃-39℃。 pH ：7.7好于7.1，7.4，8.0 渗透压：330 Osm/kg好于300，320 气相： 5%CO2 5%CO2＋5%O2＋90%N2


2.2
膜脂组成的品种差异


精子质膜固醇浓度低，不饱和脂肪酸高 时的冷刺激（突然冷却但不结冰的冷冻损伤） 更为严重，这可解释禽与人精子较牛羊精子 更能经耐受冷刺激，但不能解释冷冻解冻后 精子的活力和受精率之间的差异。 技术程序如慢冷却、添加卵黄、乳蛋白 可使冷刺激效应最小化。 但最显著的冻伤害可能发生冷冻解冻过 程中，这表明膜脂组成的差异并没有那么重 要。
间的髓质部分，刀片划破卵泡，在培养 液中反复冲洗
优点：能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完 整性，回收率也相对较高； 缺点：回收的速度相对较慢，容易造成污 染。

2、活体采集
镜，操作杆和穿刺针，配合将卵母细胞 抽吸出来
⑴ 腔镜法：腹壁切开一小口，插入腹腔
优点：比较直观，容易掌握； 缺点：工作量大，对母牛有损伤，不能频 繁手术。
（2）输精时间：一般说来，各种动物都适宜 在排卵前4h-6h进行输精。在生产中，常用 发情鉴定来判定适宜的输精时间。 （3）输精次数和间隔时间：依据输精时间 与母畜排卵时间的间距，以及精子在母畜 生殖道内保持受精能力的时间长短决定 （4）输精部位：牛子宫颈深部；猪、马、 驴子宫内；羊、兔子宫颈内浅部
抗生素对猪精液保存效果



大肠杆菌等 G- 中有精子凝结因子，可在短时间内使 精子活力、顶体完整率、pH值大幅度下降。 青、链霉素对 G+ 有效；庆大霉素抑制好氧菌的效果 比青链霉素的好。 恩诺沙星稳定、灭菌、无毒，作用于G+和G-、霉形 体、支原体等。
⑥其他添加剂
酶类:超氧化物歧化酶 ( SOD ) 激素类：OXT 其他：褪黑激素 (MT) 、维生素C、CO2、 己酸、ATP、精氨酸、咖啡因
4、IVM系统
⑴ 开放培养系统
1ml-2ml成熟培养液直接臵于平皿内 或培养板内，放入50枚-200枚卵母细胞 培养，上面不盖石蜡油。 优点：简单，对培养液中的脂溶性物质 没有若影响，能同时培养大量细胞 缺点：渗透压变化较大，容易污染
⑵ 微滴培养系统
将成熟培养液在做成50~500l的微滴，覆 石蜡油，将卵母细胞臵于其中培养。 优点：渗透压比较稳定，不易污染； 缺点：对脂溶性物质有稀释作用，成本高，培 养结果易受石蜡油质量的影响。
酸酒精或醋酸甲醇（1:3）固定24h～48h 1%间苯二酚兰（Lacmoid）或1%地衣红 （Orcein）的40%醋酸溶液染色
⑶ 受精和胚胎发育潜能的评定

（五）影响卵母细胞体外培养成 熟的因素
（1）动物种类与年龄 牛、羊效果较好，而马、猪较差。 小牛卵母细胞的平均直径 （118.04±1.15μm）比成年母牛的 （122.84±0.74μm）小。 体外成熟的小牛卵母细胞体外受精 后发育潜力也低于成年卵母细胞。
二、冷冻保存

1、 冷冻保存的细胞反应 冷冻细胞受到冰晶排挤后处于渗透压不等的 环境之中，从而导致细胞失水萎缩，离子波动； 解冻过程中细胞肿胀，胞膜破裂。 完全快速冷冻会导致细胞内冰晶形成，高盐溶 液可使细胞表面的蛋白脱落，因此理想的冷冻速 率应当慢得足以阻止这种致死效应，快到使长时 间处于高盐溶液下的有害作用减为最小 。



（一）卵母细胞的采集方法
1、离体采集：30min内取卵巢，臵生
理盐水或PBS（25℃-35℃），3h内回收。
⑴ 卵泡抽吸法： 针头穿刺，一次进针可 抽吸卵巢皮质的多个卵泡 优点：回收速度快，不易造成卵母细胞的 污染； 缺点：容易损伤卵母细胞周围的卵丘细胞， 影响其随后的成熟。
⑵ 卵巢解剖法：卵巢切为两半，去掉中
第二章 授精技术

第一节 人工授精技术的基本流程 第二节 精液保存技术 第三节 体外受精技术
第一节 人工授精(AI)的基本流程
一、精液的采集 1、采精前的准备 （ 1 ）采精场 固定；宽敞、平坦、清洁、安静； 消毒装臵。 （2）台畜（dummy） 真：活畜，同种母畜或阉畜，健康无病、体 格强壮、体型适中、性情温顺的发情母畜为最好。 假：架子表面包裹一层畜皮或麻袋、人造革 等弹性柔软物品。方便、清洁、安全、有效。
第二节 精液保存技术
常温保存（15℃~25℃）

液态保存 低温保存（0℃~5℃） 液氮（-196℃）

冷冻保存
干冰（-79℃）
一、液态保存
设备简单，操作方便 两种途径：降低保存温度；控制pH 1、常温保存 （1）原理：稀释液的弱酸性环境或冻胶环境 抑制精子的活动；补充能量物质以延长精子 存活时间，以及加入抗菌物质以抑制微生物 对精子的有害影响。
⑵ B型超声波法：超声波探头和采卵器
插入到阴道子宫颈的一侧穹隆处。术者 通过直肠将卵巢贴在探头上，根据B超屏 幕上所显示的卵泡位臵进行穿刺而将卵 母细胞抽出
优点：不用手术，操作速度快，对母牛 损伤小，可频繁采卵，且亦可对妊娠母 牛采卵；
缺点：操作技术较难掌握，并需要昂贵 的超声设备。

（二）卵母细胞的选择
2、精液稀释原则与方法
（1）稀释液的配制 容器消毒 称量 溶解 过滤 煮沸(高压) 冷却 添加 抗生素等 (2) 稀释原则 同温:稀释液与精液的温度必须相等 方向:稀释液沿杯壁缓缓加入精液中。 及时：
3、精液的稀释倍数
①畜种特征 ： 羊、牛高，猪、马低 ②稀释液种类 ： 奶类倍，糖类低 ③保存方法： 冷冻低，液态高 ④每头份最低活精子数：牛0.05-0.1亿、 羊0.5亿、猪2.0亿、马1.5亿 以牛为例：若射精量为8ml，每ml精子 数为12亿，活精子数为70%，每次输精最 低活精子数为500万，则稀释倍数为12亿 ×70%÷0.05亿=168倍
卵丘卵母细胞复合体（Cumulus Oocyte Complex, CoC）
A：三层以上卵丘细胞壁包围，胞质均匀 B：3层或部分卵丘细胞，胞质均匀 C：0层包围的裸露卵母细胞 D：死亡或退化 一般只培养A、B级。

（三）卵母细胞IVM方法
1．成熟培养液的选择
最初盐类缓冲液（Hanks） ，近年来 合成培养液 （TCM199 ），成熟率均达 80%以上。近期改进： ① 加入母畜生殖道液或细胞成分，如卵 泡液、早期羊水和颗粒细胞等 ② 加入激素如FSH、HCG、LH等 ③ FCS被ECS取代
三、精液的稀释
1、精液稀释液 （1）扩容剂：与精液有相等的渗透压；营 养剂或保护剂结合承担 （2）营养剂：葡萄糖、果糖、乳糖等糖类 以及鲜奶 （3）保护剂
①缓冲物质：柠檬酸钠、磷酸二氢钾、Tris ②非(弱)电解质 ：糖类、氨基乙酸、 ③防冷刺激物质 ：卵黄和奶类 ④抗冻物质 ：甘油和DMSO ⑤抗菌物质 ：抗生素
⑶ 密闭培养系统
臵1～2ml培养液的试管中，胶塞，在培养 箱或恒温水浴中培养；若采用培养皿或微滴培 养，则可将其装入密闭的塑料袋内。 优点：不要CO2培养箱，方便运输 缺点：pH不如前者稳定。

（四）卵母细胞IVM质量评定
⑴ 形态观察：细胞质均匀、没有空泡 ⑵ 固定染色法 ：0.1%透明质酸酶 醋
四、精液保存：常温、低温、超低温 （第 二节介绍） 五、授精 （insemination） 1、输精前的准备 （1）器械洗涤和消毒 （2）母畜：保定，外阴擦洗、消毒。 （3）精液品质：液态>=0.6，冷冻>=0.3 2、输精的基本技术要求 （1）输精量和输入的活精子数 根据畜种 和精液保存的方法确定


2.3
其它潜在因素
将不同品系的鼠精子简单臵于未经冷冻 的冷冻保护剂中，A、B受胎率降低，C不影 响；冷冻后，C体外受精获得61.2%的2-细胞 胚胎，A、B仅分别获得17.2%和3.0%的2-细 胞胚胎。进一步实验表明，这些差异主要是 由精子对添加和去除冷冻保护剂产生的渗透 压变化的敏感性不同而造成的，这又指出了 质膜特性是冷冻后精子成活与受精的决定因 素，而且指出与品种的差异效射精量、色泽、气味、云雾状 2、密度：估测法、计数法、光电比色法 3、活力 4、畸形率 5、顶体完整率 6、存活时间和存活指数
存活时间：在一定条件下的总生存时 间，第一次检查时间至倒数第二次检查之 间的间隔时间，加上最后一次与倒数第二 次检查时间的一半，其总和时间即为存活 时间。 存活指数：每相邻前后两次检查平均 活率与间隔时间乘积的总和。 两者与受精率密切相关，也是鉴定精 液处理效果的方法之一。

（3）种公畜的准备 ①精液的质量与公畜饲养管理、运动和 配种利用是否合理有密切的关系。 ②爬跨和诱情方法 让公畜在母畜附近作瞬间停留，或进行 多次假爬跨；更换台畜，改变台畜位臵； 观摩另一头公畜爬跨等等 。
2、采精技术 （1）假阴道法 ： 牛、羊、马、驴、兔 （2）手握法： 猪 （3）筒握法 ：1和2的结合 （4）电刺激法：育种价值高、因损伤或性 反射慢等失去爬跨能力；不适宜用其他 方法采精的动物。 （5）按摩采精法： 牛、犬和禽类的采精