西瓜藤乙酸乙酯提取物对糖尿病肾病大鼠肾小管的保护作用_柳俊辉

基金项目：广西大宗农作物西瓜茎叶活性成分筛选与产品开发；广西科技厅科技攻关项目（桂科攻10124008-12）；广西中药药效研究重点实验室开放课题（13-051-06-K4）作者简介：柳俊辉，男，博士研究生研究方向：中药理论与中药药效学研究*通讯作者：王硕，男，博士研究方向：中药效筛选与新药研发Tel /Fax ：（0771）2443136E-mail ：ws428@西瓜藤乙酸乙酯提取物对糖尿病肾病大鼠肾小管的保护作用柳俊辉1，龚小妹2，周小雷2，王硕2*（1.广西中医药大学，南宁530200；2.广西药用植物研究所，西南濒危药材资源开发国家工程实验室，南宁530200）摘要：目的探讨西瓜藤乙酸乙酯提取物对糖尿病肾病大鼠肾小管的保护作用。

方法大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ )建立糖尿病肾病大鼠模型，西瓜藤乙酸乙酯提取物喂养干预治疗。

检测血、尿中血糖、血肌酐、尿肌酐、尿清蛋白、血胰岛素等指标，计算内生肌酐清除率(Ccr )，并观察大鼠肾脏组织病理学改变。

结果与糖尿病肾病组比较，西瓜藤乙酸乙酯高、中剂量组大鼠血糖、血胰岛素、24h 尿清蛋白排泄量、肾重指数及肾小管损伤指数均明显下降(P ＜0.05)，内生肌酐清除率升高(P ＜0.05)。

结论西瓜藤乙酸乙酯提取物具有保护糖尿病肾病大鼠肾小管的作用。

关键词：西瓜藤;糖尿病肾病;肾小管;大鼠doi :10.11669/cpj.2014.24.007中图分类号：Ｒ965文献标志码：A文章编号：1001－2494（2014）24－2173－04Protective Ｒenal Tubular Effects Ethyl Acetate Extract from Citrullus lanatus Vine in Ｒats with Diabetic NephropathyLIU Jun-hui 1，GONG Xiao-mei 2，ZHOU Xiao-lei 2，WANG Shuo 2*（1.Guangxi University Chinese Medicine ，Nanning530200，China ；2.Institute Guangxi Medicinal Plant ，National Engineering Laboratory Southwest Endangered Medicinal Ｒesources De-velopment ，Nanning 530023，China ）ABSTＲACT ：OBJECTIVETo investigate the protective renal tubular effects ethyl acetate extract from Citrullus lanatus vine in ratswith diabetic nephropathy （DN ）.METHODSHealthy rates were used to establish DN models by peritoneal injection administrationstreptozotocin.The levels fasting blood glucose （FBG ），fasting blood insulin （FBI ），serum creatinine （Scr ），urine creatinine （Ucr ）and urinary albumin （UAlb ）were detected.Pathology live was observed.ＲESULTS After treatment ，ethyl acetate high dose groupand medial dose group Citrullus lanatus vine all significantly decreased the levels GLU ，FBI ，UAlb ，KWI and TBI.Meanwhile ，Ccrwas also improved.CONCLUSIONThe ethyl acetate extract from Citrullus lanatus vine can protect renal tubular in rats with DN.KEY WOＲDS ：Citrullus lanatus vine ；diabetic nephropathy ；renal tubular ；rat西瓜藤为葫芦科（Cucurbitaceae ）植物西瓜（Cit-rullus lanatus ）的藤茎。

西瓜的瓤、皮、籽皆可入药，已有两千年药用历史，为我国历代本草收载的品种，而目前对西瓜藤的研究比较少［1-3］，其作为一种农作物废弃物，资源非常丰富，开展其药用价值研究，对开发新的药用资源，实现中药资源的可持续发展具有重要的意义［4］。

笔者研究发现［5-8］，西瓜藤总提取物具有较好的抗炎镇痛及抑菌作用。

本实验在前期降血糖研究的基础上，对西瓜藤乙酸乙酯提取物对糖尿病肾病（DN ）大鼠肾小管的保护作用进行了研究。

1材料与仪器1.1实验动物清洁级健康雄性SD 大鼠60只，220 250g （广西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK 桂2009-0003）。

1.2药物与试剂西瓜藤采自广西崇左，并经广西药用植物园马小军教授鉴定为葫芦科（Cucurbitaceae ）植物西瓜（Citrullus lanatus ）的藤茎。

西瓜藤乙酸乙酯提取物（广西药用植物园药剂研究室）；链脲佐菌素（STZ ，美国Sigma 公司，批号：1208021）；盐酸二甲双胍（中美上海施贵宝制药有限公司，批号：1206078）；血肌酐、尿肌酐、尿清蛋白、血胰岛素定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

高糖高脂饲料（10%猪油，10%蔗糖，2%胆固醇，0.5%胆酸盐，77.5%常规饲料，广西药用植物研究所）。

待试样品的制备：取西瓜藤干品20kg，用5倍量体积分数80%乙醇分别超声2、1h2次，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥得2400g醇提取浸膏（每1g浸膏相当于8.3g生药）。

将此浸膏分散于500mL去离子水中，静置过夜。

离心（3000r·min－1）分出不溶于水的黏稠固体悬浮物和水溶液。

取水溶液用乙酸乙酯3倍量萃取样品，萃取液分别减压浓缩，回收溶剂，蒸干，得到乙酸乙酯浸膏（132g）（每1g浸膏相当于151．5g生药）。

其主要成分为十五烷酸（pentadecanoic acid）、十五烷酸单甘油酯（monopentadecanoin）、十九烷酸-1-甘油酯（2，3-dihydroxypropyl nonadecoate）、二十四烷酸-α-单甘油酯（lignoceric acid-2，3-dihydroxy-pro-panenyl ester）、2-［2'-羟基（2'Ｒ，13Z）十六酰胺］-3-羟基-（2S，3Ｒ，4Z）-十八碳烯-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（lancerebroside5）、2-羟基苯甲酸（salicylic acid）、对羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid）、对羟基苯酚（hydroquinone）、琥珀酸（succinic acid）和香草酸（vanillic acid）［9］。

枸橼酸缓冲液的配制：将枸橼酸（FW：210.14）2.1g加入双蒸水100mL中配成A液。

将枸橼酸钠（FW：294.10）2.94g加入双蒸水100mL中配成B液。

用时将A、B液按一定比例混合（1ʒ1.32），pH 计测定pH值，调节pH4.2，即是所需配置的枸橼酸缓冲液。

链脲佐菌素配制液：用枸橼酸缓冲液以1%的浓度溶解STZ，按空腹体重注射相应的STZ。

1.3实验仪器Bio-tek ELX800型酶标仪（美国宝特公司）；血糖测定仪（德国罗氏公司）；AE1001/10000电子分析天平（日本岛津公司）；Agilent8453紫外-可见分光光度计（安捷伦公司）；台式低温高速离心机（美国贝克曼库尔特公司）；GC-911γ放射免疫计数器（中科大科技实业总公司中加光电仪器公司）。

2实验方法2.1DN大鼠模型制备及干预取体质量220 250g SD大鼠1批，雌雄各半，分笼饲养。

禁食不禁水12h后，称重，编号。

适应性饲养1周后，大鼠禁食、禁饮12h后，给予STZ枸橼酸钠缓冲液55mg·kg－11次性空腹注射。

72h 后监测空腹血糖、尿糖、尿量、24h尿微量白蛋白排泄率的变化，若达到下列标准，即认为DN大鼠模型制作成功，入选下一步实验：①空腹血糖超过16.65 mmol·L－1；②尿糖强阳性；③尿量大于对照组的150%；④24h尿微量白蛋白排泄率超过30mg/24h。

将正常大鼠10只和DN大鼠50只分为6组，每组10只，分别为空白组、模型组、阳性药物组、西瓜藤乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组。

全部大鼠除空白组外喂食高糖高脂饲料，不使用胰岛素及其他降糖药物。

DN模型建立后，西瓜藤乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组给予西瓜藤提取物14、7、3.5g·kg－1，阳性药物组给予盐酸二甲双胍片0.09g·kg－1，空白组和模型组同时给予等量的生理盐水，灌胃8周，体积均为5mL·kg－1。

2.2样本的收集与处理实验期间，大鼠体质量每隔5d测定1次，每隔5d大鼠尾静脉微量取血，测定其血糖值。

于8周末，各组大鼠用代谢笼收集24h尿，－30ħ保存，次日用乙醚麻醉，从心脏采血，留取血、尿标本后立即打开腹腔，游离并取出双肾，以4ħ生理盐水洗净，小心剥去肾包膜，再以4ħ生理盐水冲洗肾血管3次，右肾称质量后，以10%中性甲醛固定，石蜡包埋，制成2μm厚切片。

2.3生化指标检测留取的血、尿标本检测血糖、血肌酐、尿肌酐、尿清蛋白（免疫散射比浊法）、血胰岛素（放射免疫法）等指标，并计算内生肌酐清除率（Ccr）。

Ccr=U （尿肌酐）ˑV（全部尿量）/P（血肌酐）（mL·min－1）。

2.4组织病理学观察石蜡切片，PAS染色，光镜下观察肾组织形态学改变，采用HPIAS－1000型医学图像分析系统6.0，每只动物选2张切片，每张切片在高倍镜下连续观察50个视野，按肾小管上皮细胞扩张、萎缩、炎性细胞浸润、肾间质纤维化等病变程度，将肾小管损伤分为4级：（-）为无肾小管病变；（+）为轻度，病变范围小于20；（++）为中度，病变范围20 40；（+++）为重度，病变范围大于40。

记录连续不重叠的20个高倍镜视野内积分，取均值作为肾小管损伤的指数。

2.5统计分析使用SPSS13.0软件处理数据。