酶与蛋白质工程 第1章 蛋白质与蛋白质工程
酶工程与蛋白质工程
酶工程与蛋白质工程酶工程与蛋白质工程是现代生物技术的重要领域，它们以分子水平为基础，通过基因工程技术来改造酶和蛋白质。
酶工程主要研究酶的结构与功能关系以及酶催化反应机理，以此来优化酶的性质和功能；而蛋白质工程则致力于蛋白质的高表达、纯化和改造，进而实现分子水平的控制和利用。
两者交叉融合，共同应用于工业、医药、环保和食品等各个领域，促进了生物技术的发展和推广。
一、酶工程简介酶是一种生物催化剂，具有极高的选择性和催化效率。
酶工程旨在通过对酶的分子结构和催化机理的研究，优化酶的性质和功能，使其在特定条件下能够更高效地催化反应。
比如，通过改变酶的氨基酸序列，可以实现酶催化活性和稳定性的提高。
再比如，通过引入新的催化中心或变异剂，可以改变酶的底物特异性和反应特性。
这些优化方法可以显著提高酶的效率和选择性，为实现工业生产和科学研究提供了有效手段。
酶工程的具体步骤如下：1. 酶的筛选和分离。
这个步骤是酶工程的基础，通常需要从自然界中分离出能够催化特定反应的酶。
现代酶工程技术一般采用高通量筛选法，通过分子筛、高速离心、色谱法等方法来分离出酶的纯品。
2. 酶的分子结构分析。
这个步骤是为了了解酶的分子结构和功能关系，找到优化方案的基础。
目前，常用的酶的分析方法有X射线晶体学和核磁共振法。
3. 酶的基因工程改造。
通过基因工程技术，改变酶的氨基酸序列和三维结构，使其获得更高的活性和稳定性。
常用的方法有扩展、交换和修饰等方法。
4. 酶的活性和特性检测。
通过活性酶测定、底物特异性、pH和温度对酶催化反应的影响等方法来检测酶的改造效果。
5. 酶的产量提高。
通过使用表达载体、调节生产菌株的生长条件等方法，使酶的产量达到最高。
二、蛋白质工程简介蛋白质工程是将目标蛋白基因从生物体内放大、纯化、定位和表达，以达到高效率和高纯度的目的。
主要应用于药物研发、工业化生产、分子诊断和分子工业等领域，对于制造可溶性蛋白、表达蛋白、纯化蛋白和修饰蛋白等方面都发挥着重要作用。
蛋白质与酶的工程改造技术及其应用
蛋白质与酶的工程改造技术及其应用蛋白质是构成生物体细胞的基本结构单元，对于生命活动的各种过程都具有重要的作用。
酶则是生物体内催化反应的重要媒介，通过发挥催化活性加速生命过程，维持了细胞的生存。
传统的酶工程技术主要将重点放在酶的分离和纯化上，但是这种方法成本高、效率低，对于大规模生产和应用场景并不适用。
随着现代生物技术的不断发展，蛋白质与酶的工程改造技术不断更新，为生物制药、酶催化反应等领域提供了新的解决方案。
本文将介绍蛋白质与酶的工程改造技术及其应用。
一、蛋白质工程改造技术1.点突变技术点突变技术是将蛋白质基因的某个碱基或氨基酸序列进行改变，从而使其具有不同的功能、活性或特定的理化性质。
这种技术在人类疾病治疗、新型药物研发、工业酵素等领域有着广泛的应用。
例如，通过点突变技术可以将普通抗体转化为更强力、更稳定的人源化抗体，提高其在治疗上的效果；也可以将酵素的催化速率、热稳定性等进行调整，以适应特定的工业需求。
2.融合蛋白技术融合蛋白技术是将两个或多个不同蛋白质结构域进行连接，形成一个新的分子，从而具有多种不同的功能。
融合蛋白技术不仅可以产生新的蛋白质，还可以对原有蛋白质的稳定性、性质等进行调整。
例如，通过将大肠杆菌外膜蛋白（OmpA）与绿色荧光蛋白（GFP）进行融合，可以得到具有膜定位与荧光表达功能的融合蛋白，用于生物成像和药物靶向测定等领域。
3.点突变与融合蛋白技术的结合将点突变和融合技术相结合可以使得蛋白质的活性和稳定性得到双重提升。
例如，通过将发酵产物氨基酸脱羧酶（ADC）与乙醇磷酸酸转移酶（EPAT）进行融合，并进行点突变，可以得到具有更高催化效率和稳定性的蛋白质。
二、酶工程改造技术酶催化反应是生物科学和化学领域中的重要研究内容，具有广泛的应用前景。
酶工程改造技术可以通过改变酶的氨基酸组成、酶的整体结构、酶的环境条件等，调节酶的催化效率和稳定性，达到增强酶活性、改进反应过程、提高酶的选择性等目的。
蛋白质工程介绍如何通过蛋白质工程改善蛋白质的性质和功能
蛋白质工程介绍如何通过蛋白质工程改善蛋白质的性质和功能蛋白质工程是一门旨在通过改变蛋白质的结构和功能来满足特定需求的科学领域。
通过蛋白质工程，可以改善蛋白质的性质和功能，从而应用于生物医药、工业生产等领域。
本文将介绍蛋白质工程的原理和方法，以及其在蛋白质性质和功能改善方面的应用。
一、蛋白质工程的原理和方法1.1 定点突变定点突变是蛋白质工程中常用的方法之一，通过人为改变蛋白质的氨基酸序列，使其具备新的性质和功能。
这种方法可以通过DNA重组技术来实现，即将目标蛋白质的编码基因进行特定修改，以获取所需的突变蛋白质。
1.2 蛋白质重组蛋白质重组是通过将目标蛋白质的基因导入到其他生物表达系统（如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞）中，利用其表达和大规模生产能力来制备目标蛋白质。
这种方法可以通过调节表达系统的条件来改善蛋白质的产量和纯度，从而实现对蛋白质性质和功能的调控。
1.3 结构改造结构改造是指通过人工设计和改变蛋白质的三维结构，从而改变其性质和功能。
这种方法可以通过模拟计算、蛋白质折叠和细胞内修饰等方式来实现。
结构改造可以使蛋白质具备新的结构域或功能模块，从而扩展其应用领域。
二、蛋白质工程对蛋白质性质和功能的改善2.1 增强稳定性蛋白质工程可以改变蛋白质的结构，从而增强其在不同环境条件下的稳定性。
例如，通过定点突变或结构改造，可以增加蛋白质的热稳定性或耐酸碱性，使其更适用于工业生产或医药应用中。
2.2 改善特异性蛋白质工程还可以改善蛋白质的特异性，使其更加准确地与目标分子结合。
通过定点突变或结构改造，可以调控蛋白质与底物或配体的亲和力，从而实现对特定分子的选择性识别。
2.3 提高活性蛋白质工程可以通过改变蛋白质的结构和氨基酸序列，提高其生物活性和催化能力。
例如，通过定点突变或结构改造，可以增加酶的催化效率、选择性和稳定性，从而推动相关生物反应的进行。
2.4 扩展功能蛋白质工程可以通过改变蛋白质的结构和功能模块，赋予其新的功能。
蛋白质与酶工程名词解释
蛋白质与酶工程名词解释一、名词解释1.蛋白质工程（Protein Engineering）：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。
2.蛋白质分子设计（Protein Molecule Design）:从分子、电子水平上，通过数据库等大量实验数据，结合现代量子化学方法，通过计算机图形学技术等设计新的分子。
3.亲和标记/亲和标记试剂（Affinity Labeling /reagent）：试剂对蛋白质分子中被修饰部位的专一性修饰，为亲和标记或专一性的不可抑制作用。
(亲和标记试剂，不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性，即试剂作用于被作用部位的某一基团，而不与被作用部位以外的同类基团发生作用。
这类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂)4.定向进化（Directed Evolution）：在较短时间内完成漫长的自然进化过程（突变、重组和筛选），有效地改造蛋白质，使之适合于人类的需要，这种策略只针对特定的蛋白质的特定性质，因而被称为定向进化。
5.DNA改组技术（DNA Shuffling）：是指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组，通过改变单个基因原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。
DNA家族改组技术（DNA Family Shuffling）：是以来自不同种属的同源基因作为重排对象进行DNA改组操作的技术。
该技术打破不同种、属间的遗传界限，利用同源基因之间的同源序列进行DNA改组6.超滤（Ultrafiltration）：利用压力或离心力使溶液中的小分子物质通过超滤膜，而大分子则被截留，一次实验就可以将蛋白质混合物分为分子大小不同的两部分的分离方法。
7.亲和层析（Affinity Chromatography）：是利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。
《蛋白质工程》课件
生物医学
蛋白质工程可用于研究 和治疗疾病，例如设计 和优化抗体、酶和细胞
因子等。
农业与食品工业
蛋白质工程可用于改良 农作物和食品品质，提
高产量和营养价值。
环保与能源领域
蛋白质工程可用于设计 和优化微生物，以实现 废物处理、生物燃料生
产等目标。
CHAPTER 02
蛋白质的结构与功能
蛋白质的一级结构
重要性
功能域和活性位点是理解蛋白质功能的关键，对蛋白质工程和药物 设计具有重要意义。
影响因素
功能域和活性位点的形成受一级结构、二级结构和高级结构的影响 ，同时与蛋白质与其他分子的相互作用有关。
CHAPTER 03
蛋白质工程的遗传操作
基因突变技术
随机突变
01
通过化学诱变、物理诱变等方法在基因序列中引入随机突变，
定义
蛋白质的二级结构是指局部主链的折叠方式，常见的二级结构包括 α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等。
重要性
二级结构是构成蛋白质三级结构的重要基础，对蛋白质的功能具有 重要影响。
影响因素
二级结构的形成受一级结构的影响，同时与蛋白质所处的环境条件有 关。
蛋白质的高级结构
定义
蛋白质的高级结构是指整条肽链 中不同二级结构的组合方式，包 括蛋白质的构象、亚基聚合方式 以及与其他分子间的相互作用等
通路分析
通过分析蛋白质在生物体内的相互作用网络，揭示其在信号转导、代谢等通路中的作用，为药物研发 和疾病治疗提供靶点。
CHAPTER 05
蛋白质工程的实验技术
蛋白质的分离与纯化
蛋白质的分离与纯化是蛋白质工程实 验技术的关键步骤之一，其目的是将 目标蛋白质从复杂的生物样本中分离 出来，并提高其纯度。
蛋白质与酶工程
蛋白质与酶工程重点1.蛋白质工程：以蛋白质结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术或化学修饰技术对现有蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。
2.酶工程：利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。
3.酶工程研究的主要内容：1）化学酶工程2）生物酶工程3）固定化酶与细胞4）酶反应器与传感器5）酶的非水相催化4.蛋白质的融合：将编码一种蛋白质的部分基因重组到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达产生新的融合蛋白。
5.蛋白质的融合的作用：1）用于表达产物的分离纯化；2）提高表达产物的溶解度；3）提高蛋白质稳定性。
6.蛋白质晶体学：利用X射线衍射技术，进行生物大分子结构研究的工程，是结构生物学的一个重要组成部分。
8.定点突变：通过分子克隆手段定点的改变特定基因的局部核苷酸序列，通常被用来研究蛋白质的功能结构以及用于目的蛋白的改造。
10.酶工程的研究范围：1）各类自然酶的开发和生产；2）酶的分离纯化和鉴定技术；3）固定化技术；4）利用其他的生物技术领域交叉渗透；5）多酶反应器的研制和应用。
11.酶的稳定性和稳定化：（一）引起酶失活的原因：1）酶的活性中心一些特定氨基酸残基被化学修饰，使酶活性丧失（微观）；2）外部环境的影响，酶活性中心出现空间障碍，使其不能与底物结合；3）酶的高级结构发生变化（螺旋、折叠发生变化）；4）多肽链的断裂（很强烈）；（二）酶的稳定化：1）低温保存（酶的本身不易变性，不易使其他酶把目的蛋白降解）；2）添加盐类（高浓度(NH4)2SO4）；3）添加底物辅酶等配体；4）添加强变性剂（保护一级结构，使用时可复活）；5）结晶化。
12.微生物作为酶源的优越性：1）容易获得酶需要的酶类；2）容易获得高产菌株；3）生产周期短；4）生产成本低；5）生产易管理；6）提高微生物产酶的途径比较多。
蛋白质工程的概念高中生物
蛋白质工程的概念高中生物
蛋白质工程是指利用生物技术手段对蛋白质进行改造或设计，以满足特定需求的过程。
在高中生物课程中，通常会涉及到基本的概念和应用。
具体来说，蛋白质工程可以包括以下内容：
1.蛋白质的结构与功能：学习蛋白质的基本结构，了解蛋
白质在细胞中的重要作用，如酶的催化作用、结构蛋白的支持作用等。
2.基因工程：了解基因工程技术，包括DNA重组技术和
基因克隆等，这些技术可以被用来改造蛋白质的编码基因，从而改变蛋白质的性质。
3.重组蛋白的生产：学习如何利用重组DNA技术来大规
模生产重组蛋白，例如利用大肠杆菌或其他微生物表达系统来生产人类重组胰岛素等药物。
4.蛋白质结构预测与设计：了解一些基本的蛋白质结构预
测方法，以及蛋白质设计的基本原理，例如通过蛋白质工程设计出新的酶类催化剂或药物分子。
总的来说，蛋白质工程是一门涉及生物技术和生物化学的学科，涉及到对蛋白质的理解、改造和应用。
在高中生物课程中，可以简要介绍这些基本概念，并引导学生对蛋白质工程的潜在应用进行思考。
蛋白质工程-复习提纲
蛋白质工程第一章——绪论一、蛋白质工程的定义？狭义定义：蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质广义定义：蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质（简单来说：蛋白质工程就是一门改造设计蛋白质的学科）二、蛋白质工程的基本研究内容？研究内容总体可分为四大部分：（1）蛋白质的基础知识——结构、理化性质、生物功能、功能与结构的关系（2）蛋白质的物质准备——表达、纯化（3）蛋白质的研究方法——结构解析、分析鉴定、蛋白质组学研究（4）蛋白质的改造应用——设计改变、功能应用、蛋白质生物信息学或者可分为三大部分：（1）蛋白质结构分析——基础（关系学）（2）结构、功能的设计和预测——基础的应用与验证（实验科学）（3）创造和/或改造蛋白质——新蛋白质——终目标（工程学）三、蛋白质工程的应用（1）蛋白质工程应用蛋白质多肽药物、新型疫苗、工业用酶……（2）蛋白质工程意义1）在医药、工业、农业、环保等方面应用前景广泛2）对揭示生命现象的本质和生命活动的规律具有重要意义3）是蛋白质结构形成和功能表达的关系研究中不可替代的手段（3）蛋白质工程的支持技术定点突变等遗传操作技术；蛋白质结构解析技术；生物信息学分析技术；蛋白质的设计、表达、生产技术第二章——蛋白质结构与功能一、蛋白质的生物学功能调节功能、防御/攻击、支架作用、信息传递、运动功能、转运功能、储存功能、催化功能、结构成分二、蛋白质基本化学组件（1）氨基酸（amino）1）氨基酸种类：二十种天然氨基酸、稀有氨基酸、非天然蛋白质氨基酸2）氨基酸的化学组成与结构：①均含有C 、H 、O 、N 、S，以一定比例存在。
有些含有微量的金属元素（如铁、锌、钼、镍等）②易被酸、碱和蛋白酶催化水解为胨、肽。
共同的化学结构（除脯氨酸）3）氨基酸的性质极性氨基酸：Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、His、Tyr——二硫键疏水氨基酸：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Met、Trp——疏水内核荷电氨基酸：Arg、Lys、His（+）；Asp、Glu（-）——PI，蛋白分离谱特性、紫外线吸收特性——检测（3）肽单位、多肽链1）肽键定义：由一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而形成的化学键。
高中蛋白质工程步骤
高中蛋白质工程步骤引言蛋白质工程是一门结合生物学、化学和工程学的学科，旨在通过改变或设计蛋白质的结构和功能，来满足特定的研究或应用需求。
在高中生物学教育中，蛋白质工程也是一个重要的研究方向。
本文将介绍高中蛋白质工程的基本步骤和相关知识。
1. 选择目标蛋白质选择目标蛋白质是蛋白质工程的第一步。
高中生一般会选择较为简单的蛋白质，比如乳清蛋白、酵母蛋白等。
选择目标蛋白质需要考虑其在研究领域中的重要性和可行性。
2. 设计蛋白质工程方案在设计蛋白质工程方案时，需要明确研究目的和要达到的效果。
一般可从以下几个方面考虑：2.1 目标蛋白质的改造可以对目标蛋白质进行改造，比如改变其氨基酸序列、添加或删除功能区域等。
这些改造将影响蛋白质的结构和功能。
2.2 蛋白质表达系统的选择在高中蛋白质工程中，常用的表达系统有细胞表达系统和原核表达系统。
根据实验需求选择适合的表达系统，将目标蛋白质在细胞或真核生物中表达出来。
2.3 实验方法和技术的选择根据实验方案选择适合的实验方法和技术，如蛋白质纯化技术、酶活性测定技术等。
确保实验的可行性和准确性。
3. 实验操作流程实验操作流程是高中蛋白质工程的核心部分。
根据实验方案进行以下实验操作：3.1 DNA重组和构建表达载体利用基因工程技术，将目标蛋白质的基因插入到表达载体中，构建蛋白质表达系统。
这一步需要进行DNA重组实验和分子生物学实验。
3.2 表达蛋白质将构建好的表达载体导入到合适的宿主细胞中，使细胞能够表达目标蛋白质。
这一步需要进行细胞培养和转染实验。
3.3 蛋白质纯化利用蛋白质纯化技术，从表达系统中纯化目标蛋白质。
这一步需要进行色谱层析、电泳等实验。
3.4 检测蛋白质功能通过酶活性测定、结构分析等方法，检测蛋白质的功能和结构是否发生改变。
这一步需要进行酶学实验和生物物理实验。
4. 结果分析与讨论通过对实验结果进行分析和讨论，总结出实验结果，并解释蛋白质工程的影响。
还可以结合前人的研究结果，对实验结果进行比较和探讨。
蛋白质工程和酶工程
3 蛋白质工程和酶工程：比较与联系
蛋白质工程和酶工程：比较与联系
蛋白质工程和酶工程：比较与联系
蛋白质工程和酶工程虽然在应用范围和方法上有很大 的不同，但它们之间也存在密切的联系
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以下是它们之间的比较和联系
蛋白质工程和酶工程：比较与联系
共同点
基础生物学：蛋白质工程和酶工程都基于基础生物 学，特别是蛋白质结构和功能的关系，以及酶的催 化机制
蛋白质工程和酶工程：比较与联系
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方法：蛋白质工程包括基因定向改造、基因筛选和化学合成等方法，而酶工程主 要包括酶的固定化、改造和筛选
目标：蛋白质工程的目标通常是开发新的药物或生物材料，而酶工程的目标通常是提 高工业过程的效率和产率
蛋白质工程和酶工程：比较与联系
联系
酶是蛋白质的一种： 酶是蛋白质的一种特 殊类型，具有催化特 定化学反应的能力。 蛋白质工程和酶工程 都关注蛋白质的结构 和性质，只是侧重点 不同
环保：用于处理 和回收废物
酶工程
酶工程
总结
蛋白质工程和酶工程都是生物工程的重要分支，它们通过应用基因技术和生物化学原 理，改善或设计蛋白质和酶的功能。这些技术已经广泛应用于医药、工业、农业和环 保等领域，为社会带来了巨大的经济效益和社会效益。随着科学技术的不断进步和创 新，蛋白质工程和酶工程将继续发挥重要作用，为人类创造更美好的未来
蛋白质工程的主要方法包括 基因定向改造：通过改变控制蛋白质合成的选出具有所需功能的蛋白质
酶与蛋白质工程原理及概况
酶与蛋白质工程原理及概况摘要：酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。
概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。
酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。
当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。
关键词：酶工程蛋白质工程一、酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。
它从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶的各方面应用。
分为：化学酶工程与生物酶工程。
1、酶工程原理和基本过程：菌种→扩大培养→发酵→发酵酶液→酶的提取→酶成品↓原料→前处理→杀菌→酶反应器←酶的固定化↓反应液→产品提取→产品2、酶工程研究热点：新酶或已有酶的新功能的开发；根据已有底物开发新的酶反应；利用突变或定向进化技术改善生物催化剂性能；利用重组DNA技术大规模生产生物催化剂；利用有机溶剂或共溶剂开发新的反应体系；体内或体外合成的多酶体系；克服底物和产物抑制；精细化工品或医药合成技术的放大；辅因子再生；生物催化剂的修饰；生物催化剂的固定化二、蛋白质工程：1、定义：以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用基因工程的方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技术。
2、原理：天然的正常构象是蛋白质的最佳状态，它既能高效地发挥功能，又便于机体的正常调控，因而极易失活而中止作用。
但在生物体外，特别是工业化的粗放生产条件下，这种可被灵敏调节的特性就表现为酶分子性质的极不稳定性，导致难以持续发挥应有的功能，成为限制其推广应用的主要原因。
如温度、压力、机械力、重金属、有机溶剂、氧化剂以及极端pH值等蛋白质工程技术针对这一现状，对天然蛋白质进行改造改良或全新设计模拟，使目的蛋白质具有特殊的结构和性质，能够抵御外界的不良环境，即使在极端恶劣条件下也能继续发挥作用，因而蛋白质工程具有广阔的应用前景。
蛋白质与酶工程【共43张PPT】
3、Km（反应动力学） 多数固定化酶的Km有一定变化，与活性中心的 构象改变及载体的电荷性质有关。 载体与底物电荷相反，固定化酶的Km值降低。 载体与底物电荷相同，固定化酶的Km值显著增加 。 4、专一性 大多数固定化酶的专一性与溶液酶相同，但也有 例外。
第六章 酶(蛋白质)分子的化学修饰
（蛋白质平的分子改造）
活力测定、偶联效率、活力回收、相对活力
二、固定化酶的稳定性提高 原因： ①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，
可防止酶分子伸展变形； ②抑制蛋白酶降解； ③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。 但如果固定化触及到酶稳定性区域，也可能导致
酶稳定性下降。 1、热稳定性提高 氨基酰化酶：溶液酶在75℃保温15min，活力为0
⑦二硫键的修饰试剂 15mol／L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。
带正电荷载体：最适pH 向酸性偏移。
戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应，使酶蛋白交联。
二硫苏糖醇、2-巯基乙醇 光敏试剂（打开吲哚环）、4-硝基苯硫氯
分为凝胶包理法和微囊包埋法 人造细胞、红血球包埋法、脂质体包埋法…… 第一节 酶化学修饰的基本条件 1、最适温度
一性的修饰反应。 3、反应体系中酶与修饰剂的比例
第二节 酶化学修饰的方法 酶表面修饰、酶内部修饰
• 金属离子置换修饰,
• 大分子修饰(共价/非共价) • 侧链基团修饰（小分子修饰）
• 肽链有限水解修饰 • 固定化修饰
1、金属离子置换修饰
• 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能 发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。
3、共价结合法（共价偶联法） 就是酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团 之间形成共价键而固定的方法。 优点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落。 缺点：但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制 作手续亦较繁琐。 ①酶分子和载体连接的功能基团 酶分子：-NH3、-COOH、苯环基、 -OH、-SH、 咪唑基、吲哚基 载体：芳香氨基，羧基，羧甲基等
大学酶工程与蛋白质工程教案
大学酶工程与蛋白质工程教案引言酶工程和蛋白质工程是生物技术领域中最重要的研究方向之一。
这两个领域是紧密联系的，它们的研究旨在开发制造更加高效、可持续和环保的生产方法。
本教案将介绍酶工程和蛋白质工程的基本知识和实践技术。
一、酶工程介绍1. 酶的定义和种类：酶是一种生物催化剂，可加速特定化学反应的速率。
酶的种类包括氧化酶、酯酶、纤维素酶、葡萄糖酶等。
2. 酶的制备和分离：酶的制备和分离过程主要包括培养酶产生菌株、酶提取、酶纯化等步骤。
常用的酶提取方法包括超声波法、高压破碎法等。
3. 酶的催化机理：酶的催化方式与机理因酶而异，通常情况下，酶作用的方式可分为四种基本类型：酸碱催化、亲和催化、共价催化和金属离子催化等。
二、蛋白质工程介绍1. 蛋白质工程的概念：蛋白质工程是指通过有创新性的技术手段，改变蛋白质的某些性质和结构，使其具有特定的功能和应用价值。
2. 蛋白质工程的基本技术：蛋白质工程的基本技术包括蛋白质表达及纯化、变异、修饰、折叠、精细调节、重组等。
3. 蛋白质工程的应用领域：蛋白质工程的应用领域非常广泛，如药物、生物材料、生物传感器、工业酶等。
三、酶工程和蛋白质工程的联系与应用1. 酶工程和蛋白质工程的联系：酶工程和蛋白质工程紧密相连，两者都是通过改变酶或蛋白质的结构和特性来实现更高效的生产。
2. 酶工程和蛋白质工程的应用：酶工程和蛋白质工程的应用领域非常广泛，涉及到药物、食品、能源、生物传感器等领域。
此外，酶工程和蛋白质工程技术也可以用于污水处理、环保等领域。
四、实验与教学内容1. 酶的制备和分离实验：通过培养酶产生菌株，提取和纯化酶，学生们可以掌握酶制备和分离的技术方法。
2. 蛋白质折叠和纯化实验：通过对蛋白质的表达、修饰和折叠过程进行实验，增强学生对蛋白质折叠和纯化的理解。
3. 酶与底物反应动力学实验：通过对酶的催化速率和底物反应动力学的测定，学生们可以学习酶的催化原理和催化机理。
结论总之，酶工程和蛋白质工程是重要的研究领域，在工业生产和医药发展中具有广泛的应用前景。
酶的蛋白质工程
酶的蛋白质工程
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当代生物工程对酶要求
➢ 提升Vmax，降低Km,改变最适pH ➢ 能具备长久稳定性和活性 ➢ 能适合用于水及非水相环境 ➢ 能接收不一样底物甚至是自然界不存在 合成底物
➢ 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药品 或药品原材料
酶的蛋白质工程
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怎样利用相对简单方法以到 达对天然酶改造或构建新非天 然酶就显得非常有研究意义和 应用前景。
4.加引物PCR：加入目标基因片段两端引物，使连接好 DNA 得到扩增，筛选正突变,得到正突变子又能够重 复进行DNA shuffling。
酶的蛋白质工程
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体外随机引发重组
体外随机引发重组 (random priming in vitro recombination, RPR)以单链DNA为模板，配 合一套随机序列引物，先 产生大量互补于模板不一 样位点短DNA片段，因为碱 基错配和错误引发，这些 短DNA片段中也会有少许点 突变，在随即PCR反应中， 它们互为引物进行合成， 伴随组合，再组装成完整 基因长度。
酶的蛋白质工程
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定向进化原理
酶的蛋白质工程
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定向进化＝随机突变＋选择
酶的蛋白质工程
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随机突变策略
➢ 易错PCR技术(error-prone PCR) ➢ DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于
1994 年首次提出 一项体外重组技术 ➢ 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一
酶的蛋白质工程
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DNA改组
➢DNA改组(DNA shuffling)又称 有性PCR (sexual PCR)，即将 DNA拆散后重排。它是模仿自然 进化一个DNA 体外随机突变方法。
《蛋白质工程概述》 讲义
《蛋白质工程概述》讲义一、什么是蛋白质工程在生命科学的领域中，蛋白质工程是一项极其重要且富有创新性的学科分支。
那到底什么是蛋白质工程呢？简单来说，蛋白质工程就是通过对蛋白质的结构和功能进行深入研究，然后运用现代生物技术手段，对天然蛋白质进行改造和设计，以获得具有特定功能或性质的新型蛋白质。
我们都知道，蛋白质是生命活动的主要承担者，它们在生物体内发挥着各种各样至关重要的作用，比如催化化学反应、运输物质、免疫防御、构成细胞结构等等。
然而，天然存在的蛋白质往往不能完全满足我们的需求，这时候蛋白质工程就派上用场了。
它并非是对蛋白质进行简单的修饰或加工，而是从分子水平上对蛋白质的基因进行改造，从而改变蛋白质的结构和功能。
这需要我们对蛋白质的结构与功能关系有清晰的认识，同时掌握一系列先进的生物技术工具和方法。
二、蛋白质工程的理论基础要深入理解蛋白质工程，就不得不提到它的理论基础。
首先，蛋白质的结构决定其功能，这是蛋白质工程的核心原则之一。
蛋白质的结构包括一级结构（氨基酸的序列）、二级结构（如α螺旋、β折叠等）、三级结构（整个多肽链的空间构象）和四级结构（多个亚基形成的复合物）。
不同的结构层次相互影响，共同决定了蛋白质的功能。
比如，酶的催化活性部位通常由特定的氨基酸残基组成，它们的空间排列和相互作用对于催化反应的效率和特异性起着关键作用。
其次，遗传密码的通用性和可操作性为蛋白质工程提供了重要的手段。
我们可以通过改变蛋白质对应的基因序列，来实现对蛋白质氨基酸序列的改造，进而影响其结构和功能。
再者，对蛋白质折叠和稳定性的研究也是蛋白质工程的理论基础之一。
了解蛋白质如何正确折叠形成有活性的构象，以及哪些因素影响其稳定性，有助于我们设计出更稳定、更有效的蛋白质。
三、蛋白质工程的基本步骤蛋白质工程的实施通常包括以下几个主要步骤：第一步是目标蛋白质的选择。
这需要根据实际需求，确定要改造或设计的蛋白质。
比如，如果我们想要开发一种更高效的工业用酶，就需要选择相关的酶作为目标蛋白质。
蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的研究与进展
蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的研究与进展蛋白质工程的研究与进展摘要: 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。
蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。
它所取得的进展向人们展示出诱人的前景。
关键词:蛋白质工程；研究；进展；蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。
蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。
1、蛋白质工程 1.1蛋白质工程的定义所谓蛋白质工程，就是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。
1.2蛋白质工程的由来蛋白质工程是在基因工程冲击下应运而生的。
基因工程的研究与开发是以遗传基因，即脱氧核糖核酸为内容的。
这种生物大分子的研究与开发诱发了另一个生物大分子蛋白质的研究与开发。
这就是蛋白质工程的由来。
它是以蛋白质的结构及其功能为基础，通过基因修饰和基因合成对现存蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。
这种新型蛋白质必须是更符合人类的需要。
因此，有学者称，蛋白质工程是第二代基因工程。
其基本实施目标是运用基因工程的ＤＮＡ重组技术，将克隆后的基因编码加以改造，或者人工组装成新的基因，再将上述基因通过载体引入挑选的宿主系统内进行表达，从而产生符合人类设计需要的“突变型”蛋白质分子。
这种蛋白质分子只有表达了人类需要的性状，才算是实现了蛋白质工程的目标。
1.3蛋白质工程的原理由于基因工程的发展，人们已经可以运用基因重组等理论和方法去设计并制造出预想的各种性能的蛋白质。
这种改变蛋白质的操作可以在蛋白质水平上，也可以在基因水平上。
如基因水平的改变，是在功能基因开发的基础上，对编码蛋白质的基因进行改造，小到可改变一个核苷酸，大到可以加入或消除某一结构的编码序列。
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肌红蛋白的三级结构及其结合的血红素亚基
四级结构
四级结构（quaternary structure）：多个具有三级结构的多肽链 （称亚基，Subunit）的聚合。或者说四级结构指亚基的种类、数 目及各个亚基在寡聚蛋白中的空间排布和亚基之间的相互作用
四级结构的稳定主要靠是疏水作用 力，另外还有离子键、氢键、范德华 引力等
血红蛋白由4个亚基组成（α2β2）， 每个亚基都与肌红蛋白非常相似
血红蛋白的四级结构
多肽、蛋白结构与功能的关系
一级结构与功能的关系
氨基酸组成变化改变其功能
牛催产素
S
S
Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly
肽键：指蛋白质分子中，由一个氨基酸的α-COOH和另一个氨基酸的αNH2之间脱水缩合而成的酰胺键，它是蛋白质结构中的主要共价键
肽：由肽键形成的化合物（二肽、三肽、寡肽、多肽）
O
NH2-CH-C +
H OH
甘氨酸
O NH-CH-C
H H OH
甘氨酸
-HOH
O
O
NH2-CH-C-N-CH-C
H HH OH
正常细胞
镰刀形细胞
▪ 镰刀状贫血病—血液中大量出现镰刀红细胞，患者因此缺氧
含芳香基团
含碱性侧链基团（带正电荷）
Phe, F; Tyr, Y; Trp, W
Lys, K; Arg, R; His, H
含酸性侧链基团（带负电荷） Asp, D; Glu, E
氨基酸的两性解离
氨基酸分子在水溶液中呈两性离子状态，在其 等电点时，氨基酸所带的正、负电荷相等，净 电荷为零。
氨基酸的两性解离及等电点
一条或数条多肽链上所有原子和基团在三维空间上的 排布，即构象（conformation）或空间结构
蛋白质的高级结构由明显的结构层次 一级结构是空间结构的基础
维持蛋白质空间结构中重要的化学键
（1）非共价键 氢键 离子键 范德瓦尔力 疏水作用
（2） S-S键
蛋白质结构层次
蛋白质结构极其复杂，但具有明显的结构层次
N-端氨基酸
C-端氨基酸
H+
RO
Rn O
NH2NH2H2N CH C NHNH2 +H2N CH C OH
氨基酸酰肼
C-端氨基酸
多肽链部分裂解成较小的片段—化大为小，获得短肽段
酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等
胃蛋白酶： 在疏水性氨基酸处部分水解，最适反应pH为2~3
O
O
O
O
+OH-
R CH COOH
NH3+
+H+
(pK´1)
pH<pI
R CH COONH3+
+OH- R CH COO-
+H+
(pK´2)
NH2
pH=pI
pH>pI
带电荷为正
带电荷为零
带电荷为负
氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度
▪ 等电点 (isoelectric point, pI)
CHRH3
COOC +NH3
H
L-氨基酸的通丙甘式氨氨酸酸
除了甘氨酸外，其他均具有不对称碳原子，具有旋光性
含非极性侧链基团
含极性侧链基团
Gly, G Ala, A Val, V Leu, L Met, M Ile, I
Ser, S Thr, T Cys, C Pro, P Asn, N Gln, Q
由于其连续反应特性， 成为蛋白质序列分析仪 的分析原理！
C末端分析方法
肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上 解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与 苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离
RO H2N CH C
R n-1O
Rn O
HN CH C HN CH C OH
肽键的结构特点
氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，肽 键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转
O — C — NH —
O–
+
— C NH —
O Ca — C
键长介于单 双键之间
N — Ca
H
肽平面/酰胺平面
肽平面 —由肽键周围的6个原子组成的刚性平面
由于α-碳原子与其他原
子之间均形成单键，因
β-转角（ β-turn）
肽链1800的回折
无规卷曲（random coil）
蛋白质的肽链中没有确定 规律性的那部分肽段构象
两种主要类型的β-转角
超二级结构
超二级结构（super secondary structure）：在蛋白质中经常存在由若 干相邻的二级结构单元按一定规律组合在一起，形成有规则的二级结 构集合体，超二级结构又称基序或模体（motif）
这就是卷发行业的生化基础
β-折叠（ β-sheet）
存在于丝心蛋白、角蛋白。呈平行的和反平行的比较伸展的构象。主链之间 形成H键，侧链基团R交替地位于片层的上、下
平
行
结
反
构
平
行
结
构
-角蛋白
▪ 丝心蛋白(fibroin)：这是蚕 丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。 丝心蛋白具有抗张强度高， 质地柔软的特性，但不能拉 伸。丝心蛋白是典型的反平 行式-折叠片，多肽链取锯 齿状折叠构象
小的片段; (4) 测定各肽段的氨基酸序列; (5) 重建完整多肽链的一级结构; (6) 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置
① 拆分非共价键：可用8mol/L尿素 或6mol/L盐酸胍处理
② 拆分二硫键：几条多肽链通过二
硫键交联在一起。可在8mol/L尿素
或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的
拆分
蛋白质的基本结构单位—氨基酸
氨基酸的基本结构和构型
存在于自然界的氨基酸有300种。动物机体的蛋白质经强酸水解之后 可以得到20种氨基酸，并且均为L-氨基酸（除了甘氨酸），含不对 称的α-碳原子。它们之间的差别在于有不同的侧链基团 R
COO -
COOH
+α
H3N C H
或
α
H2N C H
R
R
氨基酸结构通式
-巯基醇处理，使二硫键还原为
巯基
N-末端和C-末端氨基酸残基的确定— 为氨基酸序列排列建立两个重要的参考点
N端分析方法： ① 二硝基氟苯法 (DNFB法)
② 丹磺酰氯法 (DNS法)
丹磺酰-氨 基酸有很强 的荧光性质
③ 苯异硫氰酸(酯)法 (PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法 )
肽键
多肽（polypeptide）和多肽链（polypeptide chain）
（N-端）
（C-端）
在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为 氨基酸序列，多肽链上不完整的氨基酸，称为氨基酸残基(amino acid residue)
上图为： 丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-异亮氨酸
利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条 多肽链的氨基酸顺序
测定二硫键的位置
分子进化
细胞色素c 是由 104个氨基酸组 成的蛋白质 比较50种不同的 生物，发现35 个是保守的 凡与人类亲缘关 系越远的生物， 其氨基酸顺序与 人类的差异越大
从细胞色素c的一级结构看生物进化
蛋白质的高级结构
二级结构主要形式有： α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规卷曲
α-螺旋（ α-helix）
在角蛋白中最常见的构 象，为右手螺旋。每圈 螺旋3.6个氨基酸残基。 侧链基团R在螺旋外侧。 主链内部形成H-键，不 涉及侧链R
典型的α-螺旋是3.613螺 旋，一周螺旋3.6个氨 基酸，跨越13个原子
卷发(烫发)的生物化学基础
牛加压素
S
S
Cys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly
一级结构改变引起分子病
基因突变导致蛋白质一级结构的突变，导致蛋白质生物功能的下降 或丧失，就会产生疾病，这种病称为分子病（molecular disease）
正常红细胞与镰刀 形红细胞的扫描电 镜图
正常红 细胞
镰刀形 红细胞
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
R3
R4
胰蛋白酶：
R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧 链 (专一性较强，水解速度快)
O
O
O
O
NHCHC NHCHC NHCHC NHCHC
R1
R2
R3
R4
糜蛋白酶
R1=苯丙氨酸Phe, 色氨酸 Trp, 酪氨酸Tyr
测定各短肽段的氨基酸序列 重建完整多肽链的一级结构—获得多肽链的完整序列
第一讲 蛋白质与蛋白质工程
蛋白质在生命活动中的重要作用
蛋白质在机体内的生物学功能
生物催化作用：酶 运输作用：如血红蛋白、转铁蛋白 调节作用：如胰岛素、生长激素 运动作用：如肌动蛋白和肌球蛋白 防御功能：如免疫球蛋白、凝血因子 营养功能：如卵清蛋白、酪蛋白 结构蛋白：如胶原蛋白、角蛋白 能量转换蛋白：如细胞色素 基因调节蛋白：如阻遏蛋白
S
S
A
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
5
10
15
S
21 S
B
S
S
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala