H_2O_2介导的H_2S产生参与干旱诱导的拟南芥气孔关闭_王兰香

植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (3): 217–225, doi: 10.3724/SP .J.1259.2012.00217 ——————————————————收稿日期: 2011-09-01; 接受日期: 2012-02-09基金项目: 国家自然科学基金(No.30970228, No.31170237)、山东省自然科学基金(No.ZR2010CM024)和植物生理学与生物化学国家重点实验室开放课题(No.SKLPPBKF11001) * 通讯作者。

E-mail: liuxin6080@H 2O 2介导的H 2S 产生参与干旱诱导的拟南芥气孔关闭王兰香, 侯智慧, 侯丽霞, 赵方贵, 刘新*青岛农业大学生命科学学院, 山东省高校植物生物技术重点实验室, 青岛 266109摘要 以野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana )及其突变体(atrbohD 、atrbohF 、atrbohD/F 、atl-cdes 、atd-cdes )和过表达株系(OEL-CDes 、OED-CDes )为材料, 利用药理学实验, 结合分光光度法和激光共聚焦显微技术, 探讨硫化氢(hydrogen sulfide, H 2S)在干旱诱导的拟南芥气孔关闭中的作用及其与过氧化氢(hydrogen peroxide, H 2O 2)的关系。

结果表明, H 2S 清除剂次牛磺酸(hypotaurine, HT)及合成抑制剂氨氧基乙酸(aminooxy acetic acid, AOA)、羟胺(hydroxylamine, NH 2OH)和丙酮酸钾(potasium pyruvate, C 3H 3KO 3)+氨水(ammonia, NH 3)均可不同程度抑制干旱诱导的气孔关闭; 干旱对OEL-CDes 和OED-CDes 植株气孔关闭的诱导作用明显, 而atl-cdes 和atd-cdes 叶片气孔对干旱胁迫反应的敏感性下降; 干旱胁迫能明显增加拟南芥保卫细胞中H 2O 2水平及叶片中H 2S 含量, 提高D-/L-半胱氨酸脱巯基酶活性及基因表达量, 而对突变体atrbohD 、atrbohF 和atrbohD/F 没有显著影响。

清除H 2O 2可减弱干旱胁迫对H 2S 含量和D-/L-半胱氨酸脱巯基酶活性的诱导效应。

研究结果表明H 2S 位于H 2O 2下游参与干旱诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程。

关键词 拟南芥, 干旱胁迫, 过氧化氢, 硫化氢, 气孔关闭王兰香, 侯智慧, 侯丽霞, 赵方贵, 刘新 (2012). H 2O 2介导的H 2S 产生参与干旱诱导的拟南芥气孔关闭. 植物学报 47, 217–225.干旱是限制植物生长的最重要环境因素之一, 干旱胁迫下植物能够通过调控气孔开度来防止植物体内水分的散失并维持一定的光合作用(Seemann and Critehley, 1985)。

业已证明脱落酸(abscisic acid, ABA)、茉莉酸(jasmonate acid, JA)和乙烯(ethylene, Eth)等植物激素均能够促进植物气孔关闭; Ca 2+、质子和过氧化氢(hydrogen peroxide, H 2O 2)等作为重要的组分参与气孔运动的信号转导途径(刘新等, 2003; Desikan et al., 2006; 刘国华等, 2009a, 2009b; 侯智慧等, 2011); K +和Cl –等渗透调节物质在植物调节保卫细胞膨压过程中发挥重要作用(高巍和尚忠林, 2010)。

在干旱胁迫下是否还存在其它参与调控气孔运动的因子以及其作用机制还有待深入研究。

硫化氢(hydrogen sulfide, H 2S)是近年来发现的继一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后的第3种内源性气体信号分子(García-Mata and Lamattina, 2010; Kajimura et al., 2010; Tan et al., 2010)。

大量动物实验已经证明, H 2S参与神经活动的调节、大脑的发育、血管结构的重建及多种病理生理变化(Łowicka and Be łtowski, 2007; Kajimura et al., 2010)。

近几年对H 2S 在植物生命活动中发挥作用的报道也越来越多, 如一定浓度的外源H 2S 能提高小麦(Triticum aestivum )幼苗的耐寒性(Stuiver et al., 1992); 增强小麦种子(Zhang et al., 2008)和甘薯(Ipomoea batatas )幼苗(Zhang et al., 2009)抵抗非生物胁迫的能力; 促进豌豆(Pisum sa-tivum )胚根生长(李东波等, 2010); 调控蚕豆(Vicia faba )、拟南芥(Arabidopsis thaliana )和凤仙花(Impa- tiens walleriana )的气孔运动(García-Mata and Lama- ttina, 2010)等。

内源H 2S 亦参与ABA 诱导蚕豆气孔关闭的过程(刘菁等, 2011)。

但H 2S 在干旱诱导气孔运动过程中的作用及其机制却鲜见报道。

有报道显示, 在植物体抵御逆境的过程中H 2S 和H 2O 2之间存在联系, 外源H 2S 能够通过提高抗氧化酶的活性进而降低H 2O 2的水平来抵抗由多种胁迫所引起的氧化伤害(Zhang et al., 2008, 2009, 2010)。

但尚・研究报告・218 植物学报 47(3) 2012不清楚在植物应答逆境胁迫的信号转导过程中内源H2S和H2O2之间的关系。

植物细胞可以通过多条途径形成H2S和H2O2, 如H2S主要是通过D-/L-半胱氨酸脱巯基酶(D-/L-cysteine desulfhydrase, D-/L-CDes)、亚硫酸盐和硫酸盐的代谢作用产生(Riemensch- neider et al., 2005); 产生H2O2的途径则主要涉及NADPH氧化酶、细胞壁过氧化物酶和多胺氧化酶等(Mustilli et al., 2002)。

那么, H2S是否参与干旱胁迫诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程, 其与H2O2的关系又是怎样的？本实验以野生型拟南芥及其H2O2合成酶缺失型突变体(atrbohD, atrbohF, atrbohD/F)、H2S合成酶缺失型突变体(atl-cdes, atd-cdes)和过表达株系(OEL-CDes、OED-CDes)为材料, 利用药理学实验, 结合分光光度法和激光共聚焦显微技术, 探讨H2S在干旱诱导拟南芥气孔关闭中的作用及其与H2O2的关系。

1材料与方法1.1 材料和试剂供试材料为拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)野生型Col-0、D-/L-半胱氨酸脱巯基酶缺失型突变体atd- cdes和atl-cdes及其过表达株系OED-CDes和OEL- CDes、NADPH氧化酶缺失型突变体atrbohD和atrbohF及其双突变体atrbohD/F。

材料培养参照刘国华等(2009a)所述方法, 取生长4–5周完全展开的拟南芥莲座叶供实验用。

实验中所用试剂包括表皮条缓冲液(10 mmol·L–1 MES, 50 mmol·L–1KCl, 0.1 µmol·L–1CaCl2, 用KOH 调节pH至6.1)、0.1 mmol·L–1硫氢化钠(sodium hydro- sulfide, NaHS)、0.1 mmol·L–1抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)、0.01 mmol·L–1水杨羟肟酸(salicylhy- droxamic acid, SHAM)、20 mmol·L–1 Tris-HCl、0.01 mmol·L–1二苯基碘(diphenylene iodonium, DPI)、2.5 mmol·L–1二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)、0.8 mmol·L–1D-半胱氨酸(D-cysteine)、0.8 mmol·L–1L-半胱氨酸(L-cysteine)、30 mmol·L–1FeCl3、20 mmol· L–1N,N-二甲基-对苯二胺(N,N-dimethyl-p-phenylene- diamine dihydrochloride)、10%PEG6000、15 μmol· L–1次牛磺酸(hypotaurine, HT)、0.4 mmol·L–1氨氧基乙酸(aminooxy acetic acid, AOA)、0.2 mmol·L–1丙酮酸钾(potasium pyruvate, C3H3KO3)、0.2 mmol·L–1氨水(ammonia, NH3)和0.4 mmol·L–1羟胺(hydroxy- lamine, NH2OH)。

其中NaHS、AsA、DPI、SHAM、AOA、L-半胱氨酸及D-半胱氨酸均购于Sigma公司; 其它药品均为国产分析纯。

1.2 气孔开度的测定气孔开度的测定参照刘国华等(2009a)的方法, 首先用光诱导使叶片气孔完全张开, 用显微测微尺测量气孔的初始孔径。

然后将其分别置于含有不同处理液的MES缓冲液中, 于光下(光照强度200 μmol·m–2·s–1)处理30分钟, 记录终态孔径。

1.3 H2S含量和D-/L-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定取0.1 g生长状态一致的拟南芥莲座叶片, 外施10% PEG6000, 光下(光照强度120 μmol·m–2·s–1)分别处理0、1、2、4、6小时, 检测干旱胁迫对叶片H2S含量和D-/L-半胱氨酸脱巯基酶活性的影响。

取0.1 g生长状态一致的拟南芥莲座叶片, 用10%PEG6000分别与0.1 mmol·L–1AsA、0.01 mmol· L–1DPI和0.01 mmol·L–1SHAM共同处理2小时, 研究H2O2清除剂和合成抑制剂对干旱胁迫下叶片H2S含量和D-/L-半胱氨酸脱巯基酶活性的影响。

拟南芥叶片H2S含量的测定参照亚甲基蓝法(Sekiya et al., 1982; 侯智慧等, 2011)并稍作修改。

D-/L-半胱氨酸脱巯基酶活性测定参照侯智慧等(2011)的方法进行。