金属硫蛋白提取条件试验

兔肝金属硫蛋白提取工艺研究党蕊叶1齐凡2蒋志武1 王开锋1 权清转1权启俊3赵淑琳1（1.陕西省动物研究所, 陕西西安710032；2.陕西省科学院，陕西西安，3.陕西同腾生物科技有限公司, 陕西省澄城715200）摘要：伊拉兔子经ZnSO4腹部皮下注射，诱导其肝脏合成锌金属硫蛋白，将肝脏加入溶剂经研磨、加热、分离制成金属硫蛋白提取液。

本文系统的研究了提取液Tris-HCl的浓度、pH和稀乙醇对金属硫蛋白提取率的影响，并用正交试验法对加热的时间和温度进行了筛选，为金属硫蛋白的提取研究提供资料。

实验结果表明：提取液的浓度和pH值对金属硫蛋白的提取效果影响较大，稀乙醇对金属硫蛋白的提取影响不大，大于30%的乙醇溶液导致金属硫蛋白提取率下降。

实验的最佳提取条件为：Tris-HCl的浓度范围0.01 mol/L～0.02 mol/L，pH范围8.0~8.6，热处理的条件为：加热温度78-80℃，加热时间5-8分钟。

关键词:金属硫蛋白、提取工艺、提取液中图分类号：Q503金属硫蛋白（metallothionein,简称MT）是1957年由Margoshes和Valee[1]首次从马的肾脏中分离出来并命名的，它是一类富含半胱氨酸且能被金属离子诱导的低分子金属结合蛋白质。

经过四十多年来的研究，人们对金属硫蛋白的认识已越来越深，实验表明：金属硫蛋白具有解除重金属毒性和抗辐射、消除自由基、修复受损组织等功效[2,3]，现已被广泛用于医药、保健品及化妆品添加剂等领域中[4,5]。

哺乳动物金的属硫蛋白分子量约有6500道尔顿，是由60-62个氨基酸组成的单链蛋白质，其中约有20个半胱氨酸残基，不含芳香族氨基酸和组氨酸，氨基酸末端N-乙酰蛋氨酸，羧基末端均为丙氨酸，多数排列为cys-X-cys结构，数量是7个，与结合的金属含量一致。

无金属结合的金属硫蛋白称为硫蛋白(thionein)，结构呈无序状态，当与金属离子结合后折叠成有序结构[6,7]。

天然金属硫蛋白中金属的组成依赖于自然环境和动物体对金属的暴露情况，经硫酸锌诱导后，动物体内主要以与锌结合的金属硫蛋白（Zn-MT）的形式存在。

金属硫蛋白是一类分子量小，易溶于水，且具有高活性的蛋白质，在提取操作中，稍有不慎，就有可能造成金属硫蛋白的损失，因此，选择合理的提取工艺是十分有必要的。

目前，金属硫蛋白常用缓冲液提取、有机溶剂沉淀除杂、热变性除杂、乙醇沉淀MT等工艺[8,9]，由于工艺中使用了大量的乙醇和有毒气体氯仿，不但产品成本高，而且污染了环境。

我们选用了Tris-HCl缓冲液直接提取金属硫蛋白，然后经过加热和酸沉淀杂蛋白质等工艺提取金属硫蛋白。

本文主要研究提取率Tris-HCl的浓度、pH和稀乙醇对金属硫蛋白提取率的影响，并用正交试验对加热温度和时间进行了筛选，为金属硫蛋白的生产提供技术资料。

1.实验部分1.1 材料仪器比利时肉兔：陕西澄城同腾生物有限公司兔场提供； 723型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；FSH-2型高速电动匀浆器(江苏金坛市环宇科学仪器厂); 可调微量移液器(法国Gilson SAS.)；电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；5，5’一二硫硝基苯甲酸（DTNB）(Sigmol/La公司)；其他试剂采用分析纯试剂。

1.2兔子的诱导1选用健康比利时成体肉兔，隔日腹部皮下注射经过灭菌的硫酸锌，方法参考0nosaka等的方法，注射次数为7次，每次剂量呈递增形式，依次为lOmg/kg，20mg/kg，50 mg/kg，100 mg/kg，150 mg/kg，200 mg/kg和250 mg/kg。

于第七次给药24h后处死动物，迅速取出肝脏，保存于一20℃，备用。

1.3金属硫蛋白提取液方法取1.2处理的肉兔肝脏，用生理盐水清理血迹后，用滤纸吸干水分，剔去粘膜和细胞壁，加入2-4倍量经冰箱中预冷的提取液，于0-4℃下研磨，然后将研磨液迅速加热至78℃-80℃并保持5-8min，冰水浴中快速冷却至0-4℃，10000 rpm，冷冻离心分离20min，测定溶液中金属硫蛋白的含量。

基金项目：陕西省科学院重大项目（2010k-01-z4）;陕西省农业攻关计划项目（2011K02-08）第一作者：党蕊叶，女，副研究员，研究方向为生物有效成分提取与分离。

E-mail:dry2003d@1.4 金属硫蛋白的测定方法取待测样品20ul，然后加入1.2mol/L的Hcl lOul和O.1mol/L 的EDTA 200ul，反应10min，加入200ul巯基试剂，用pH7.4的O.1mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)定容至4ml，3min后在波长412nm处测定吸光度。

空白液用蒸馏水代替，其用量和试剂的加入方法与样品相同。

以半胱氨酸作标准巯基试剂，用标准曲线y=0.61x-0.013（Y为溶液的吸光度，X为半胱氨酸浓度）计算溶液的巯基浓度，按每分子Zn-MT含20个巯基换算为Zn-MT浓度（Zn-MT的分子量按6500计）[8]。

2. 实验结果2.1 缓冲液浓度对金属硫蛋白提取率的影响准确称取冰箱保存兔肝 5.00g，加入10ml浓度分别为0.01mol/L, 0.02 mol/L,0.04 mol/L,0.06 mol/L,0.08 mol/L,0.10 mol/L，pH＝8.2的Tris-HCl缓冲液，按照1.3方法提取，于412nm 处测定吸光度并计算溶液中金属硫蛋白的含量。

提取结果（图1）表明，缓冲液的浓度对金属硫蛋白的提取影响比较大，溶液浓度过大不利于金属硫蛋白的提取，适宜的提取液浓度为0.01 mol/L和0.02 mol/L 。

2.2 提取液的PH值对金属硫蛋白提取率的影响准确称取兔肝5.00g，加入10ml 0.01mol/L Tris-HCl，缓冲液的pH分别为7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.80.01mol/L, 提取方法按照1.3进行，定容至相同体积后，测定溶液中金属硫蛋白的含量，结果如下：结果显示（图2），当pH大于8.6时，金属硫蛋白的含量明显降低，而pH在7.4-8.0之间对金属硫蛋白的提取率影响不大，所以，金属硫蛋白提取液的pH不宜过大，一般在8.0~8.6较为适宜。

2.3 稀乙醇对金属硫蛋白提取率的影响准确称取兔肝5.00g 6份，分别加入用0.01mol/L Tris-HCl和无水乙醇配制的不同乙醇浓度的提取液10ml，提取液的乙醇浓度分别为0,10%，20%，30%和40%,其余操作同1.2，实验结果见表2。

表2 稀乙醇对金属硫蛋白提取率的影响试验结果显示，10%乙醇对金属硫蛋白提取率没有影响，20%-40%的乙醇分别使金属硫蛋白的收率减少了13.67%，27.98%和33.33%，。

所以，在水溶液直接提取金属硫蛋白的工艺中，乙醇对金属硫蛋白的提取率影响比较明显。

2.4 加热温度和加热时间对金属硫蛋白提取率的影响准确称取新鲜肉兔肝脏5.00克9份，加10ml,0.01 mol/L的Tris-HCl缓冲液，匀浆，按照三水平正交试验L9(34)表进行加热温度和加热时间的选择，温度选择78℃、80℃、82℃，时间选用3、5、8min，其余操作按照方法1.2进行，实验结果见表2：表1 温度和加热时间对金属硫蛋白提取效率的影响注；A代表温度，1、2、3分别为78℃、80℃、82℃。

B代表加热时间，分别为3min、5min、8min.实验结果可以看出，温度对金属硫蛋白的提取率影响比较大，82℃时金属硫蛋白提取率最低，在78℃和80℃影响不大，保温时间影响不大，3-8min均可。

3 讨论金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸且具有活性的小分子蛋白质，当原有的天然环境破坏后，很容易发生聚合而失去原有的活性，因此，选择合适的提取方法和提取条件是十分有必要的。

金属硫蛋白提取液的离子强度过大或过小，都会导致金属硫蛋白失活[11]。

侯安军等用分子动力学方法研究了金属硫蛋白的动力学稳定性[12]，结果显示，金属硫蛋白在纯净的水中是以稳定的单体存在，而在缓冲液中则容易发生不同程度的聚合。

在本文的研究中，低浓度的缓冲液比高浓度的缓冲液更有利于金属硫蛋白的提取。

离子强度过高，容易使金属硫蛋白分子中的非极性部分产生凝聚而沉淀，另一方面高的离子强度促进了金属硫蛋白聚合使金属硫蛋白失活。

通过圆二色性和晶体结构研究发现，金属硫蛋白分子中不含α一螺旋和β-折叠，而存在一种十分坚固的构象，因此具有很强的抗热性和抵抗蛋白酶消化的能力[6]。

金属硫蛋白水提取液在75-90℃的高温下，短时间内几乎没有变化，这个与文献报道的一致（另篇报道“金属硫蛋白提取液稳定性研究”）。

而在本实验中，金属硫蛋白的最佳提取温度在80℃左右，温度过高，金属硫蛋白的提取率下降。

Frk等曾报道[13]，85℃的水浴处理会造成金属硫蛋白的损失，当肝脏组织与提取液混合加热，溶液中会形成大量的固体以及变性的酶类和絮状杂蛋白质，这可能会影响金属硫蛋白的提取率，具体的作用机理还有待进一步研究。

金属硫蛋白是一类含有大量半胱氨酸的低分子蛋白质，水溶性很强，在溶液中容易在分子间或分子内产生交联使金属硫蛋白破坏，在《兔肝金属硫蛋白提取液的稳定性研究》（另篇报道）的报道中，乙醇对金属硫蛋白具有明显的稳定作用，但当乙醇浓度高于30%时，金属硫蛋白有发生沉淀的趋势。

而在本文的研究中，当乙醇浓度20%时，金属硫蛋白的提取率已有稍微减少，这个可能是含有乙醇的兔肝均浆液在加热时，造成金属硫蛋白随大分子蛋白质沉淀的协调损失[14]。

因此，在用水溶液加热直接提取金属硫蛋白的工艺中，乙醇不利于金属硫蛋白的提取。

通过试验可以看出，在研究选择的工艺中，合适的提取工艺为，提取缓冲液Tris-HCl的浓度范围为0.01 mol/L和0.02 mol/L，pH范围为8.0~8.6，加热温度78-80℃，加热时间5-8分钟。

另外，提取液中不宜加入乙醇。

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