FISH实验ppt课件
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FISH杂交技术
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荧光原位杂交特点
1.FISH不需要放射性同位素作探针标记,安全性高； 2.FISH探针稳定，一次标记后可在两年内使用，经济、安
全； 3.实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性
探针相当； 5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测
于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗
传学研究。
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FISH发展
¡ 20世纪90年代， 随着人类基因组计划 的进行，由于绘制高 分辨人类基因组图谱 的需要，FISH技术得 到了迅速的发展和广 泛应用。
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FISH原理
FISH是以荧光素直接标记的已知核酸分子 为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交 ，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和 离子强度下退火形成稳定的异源待检的杂交 体双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过 荧光显微镜观察杂交信号。
1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷酸探针成功地进 行了染色体原位杂交,建立了非放射性原位杂交技术。至此,以荧 光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
1985 年，荧光原位杂交技术被引进到植物。
1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原位杂交技术应用
.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FISH发展
1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA 获得成功之后,Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模 板,利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期 染色体标本进行了原位杂交,从而开创了RNA-DNA的 同位素原位杂交技术。他们都是采用放射性同位素标 记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的 限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交 技术不能很快得到广泛应用。
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荧光原位杂交特点
1.FISH不需要放射性同位素作探针标记,安全性高； 2.FISH探针稳定，一次标记后可在两年内使用，经济、安
全； 3.实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性
探针相当； 5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测
于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗
传学研究。
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FISH发展
¡ 20世纪90年代， 随着人类基因组计划 的进行，由于绘制高 分辨人类基因组图谱 的需要，FISH技术得 到了迅速的发展和广 泛应用。
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FISH原理
FISH是以荧光素直接标记的已知核酸分子 为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交 ，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和 离子强度下退火形成稳定的异源待检的杂交 体双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过 荧光显微镜观察杂交信号。
1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷酸探针成功地进 行了染色体原位杂交,建立了非放射性原位杂交技术。至此,以荧 光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
1985 年，荧光原位杂交技术被引进到植物。
1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原位杂交技术应用
.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FISH发展
1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA 获得成功之后,Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模 板,利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期 染色体标本进行了原位杂交,从而开创了RNA-DNA的 同位素原位杂交技术。他们都是采用放射性同位素标 记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的 限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交 技术不能很快得到广泛应用。
FISH法检测石蜡miRNA总结(共25张PPT)
1、FISH 和细胞免疫化学技术结合，可以同时用多种不同 颜色标记不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细 胞内同时找到基因的位点，转录和翻译的产物，有助了 解核苷酸结构功能以及与蛋白质表达之间的关系。
2、FISH 技术和 RFLE （ RESTRICT FRAGMENT LENTH POLYMORPHSIM ）结合，可以精确地描述染色体长， 短臂等结构改变和染色体核型或复杂片段的性质。 在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较 精确地确定下来。
（2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。
（3） 2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1 min。
（4）梯度(70%、90%、100%)酒精脱水（-20℃预冷），空气中干 燥。
变性
（1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液； （2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； （3）78℃孵育8 min；
（10）每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体（抗地高辛 单克隆抗体）或FITC卵白素，室温下孵育20 min；
（11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS 室温下洗3次，每次2 min。
杂交
方法敏感，敏感程度等同甚至超过放射性同位素原位杂交。 （1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；
放（射2 性）原（20位×杂S1S交2C方）（法p，H从7用. 特1殊×的荧PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
荧光显微镜观察FISH结果
（13）每张切片滴30~60 μl -卵白素抗体 抗 ，加塑料盖膜，室 1×PBS室温下洗3次，每次2 min。
在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地确定下来。
2、FISH 技术和 RFLE （ RESTRICT FRAGMENT LENTH POLYMORPHSIM ）结合，可以精确地描述染色体长， 短臂等结构改变和染色体核型或复杂片段的性质。 在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较 精确地确定下来。
（2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。
（3） 2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1 min。
（4）梯度(70%、90%、100%)酒精脱水（-20℃预冷），空气中干 燥。
变性
（1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液； （2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； （3）78℃孵育8 min；
（10）每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体（抗地高辛 单克隆抗体）或FITC卵白素，室温下孵育20 min；
（11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS 室温下洗3次，每次2 min。
杂交
方法敏感，敏感程度等同甚至超过放射性同位素原位杂交。 （1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；
放（射2 性）原（20位×杂S1S交2C方）（法p，H从7用. 特1殊×的荧PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
荧光显微镜观察FISH结果
（13）每张切片滴30~60 μl -卵白素抗体 抗 ，加塑料盖膜，室 1×PBS室温下洗3次，每次2 min。
在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地确定下来。
FISHppt课件
荧光原位杂交
FISH的原理 FISH的操作及应用 FISH的展望
FISH的原理
• FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸 为探针，按照碱基互补的原则，与待检材 料中未知的单链核酸进行特异性结合，形 成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子 在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列， 因而可以将探针直接与染色体进行杂交从 而将特定的基因在染色体上定位。
• 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因 组结构研究、染色体精细结构变异分析、 病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传 学和基因组进化研究等许多领域。
原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每次 检验均需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的不稳定 性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。在观察结 果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外，由于放射性 银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数上的误差等。
(multiplex FISH, M-FISH probes)
两种以上不同的非同位素标记，不同的 荧光检测系统，通过不同的滤光片组合或 极少数几种非同位素标记探针后，按照不 同的比例混合，可以显示多种颜色。
多色复合染色体FISH探针
探针及标本的变性
1）探针变性 • 将探针在75oC恒温水浴中温育5min，立即置0oC，
特点：信号强
应用：(a)标记染色体识别。 (b)染色体数目异常检测。 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊
断。
简单重复序列探针
染色体的着丝粒
异染色质区域
SUCCESS
THANK YOU
2019/6/13
• 间期细胞遗传学的意义： 细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一， 经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细 胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相， 间期FISH为这一时期遗期传物质的研究提供了可能，而且 快速。
FISH技术在血液疾病诊断中的应用ppt课件
nuc ish(MLL×2)[400]
nuc ish(MLL×2)(5’MLL sep 3’MLL×1)[100/200]
nuc ish(CEPX×2)[2]//(CEPX,CEPY)×1[398]
ABL BCR
ABL BCR
A
B
A: nuc ish(ABL,BCR)×2 B: nuc ish(ABL ×2,BCR ×3)
FISH技术要点
样本浓度、切片厚度、细胞状态 充分低渗与固定 制片环境温度与湿度 探针充分混匀 变性液pH与温度 橡皮泥严密封片 洗脱液温度 抗衰变剂
规范判读
• 规范正常和异常信号 • 杂交成功率>75% • 计数数量、方法： •单人，分别于不同区域各连续计数200个细胞 •双人，每人于不同区域各计数200个细胞
A
TEL
B
TEL/AML1
TEL
C
A: nuc ish(TEL×2,AML1×3)(TEL con AML1×1) B: nuc ish(TEL×1,AML1×4)(TEL con AML1×1) C: nuc ish(TEL×2,AML1×5)
D5S721 D5S721 EGR1 D5S721
EGR1
荧光原位杂交（FISH）技术
——血液肿瘤诊疗中的应用
一、技术 二、质控 三、 临床应用 四、多技术结合应用案例
技术理论
细胞遗传学发展简史
1888 提出 染色 体 1914 染 色 体 畸 变 导 致 肿 瘤
1950-1960
1960 发现Ph 染色体 CML
显带技 术高速 发展 G/R
FISH 中期/间期
ABL
BCR
ABL
FISH基本原理
谢谢！
5、结果观察
观察镜下荧光杂交信号， 计数30个细胞和采集4张 图像。
七、注意事项
玻片准备时要注意玻片的干净和透明度； 杂交过程中要保持湿润； 杂交必须对玻片变性温度进行摸索； 染色体制备分裂相应尽量长且分散，胞质应尽量去 干净； 荧光素和甲酰胺应注意避光保存； 甲酰胺有神经性毒性，操作时应注意戴手套； 探针溶解应完全； 标记模板DNA应尽量纯，没有其他蛋白质及核酸的 污染； 需要-20℃保存的试剂都应分装后-20℃保存。
2ul
3、杂交
PCR扩增仪开启，使温度达到80℃ 滴加配好的杂交液15ul于杂交区 盖上盖玻片，封胶，PCR扩增仪80℃变性2min 将玻片置于湿盒，放入37℃杂交16小时以上来自4、洗脱
杂交次日 70℃ 0.4SSC/0.3%NP40 漂洗2min 室温 2×SSC/0.1%NP40 漂洗 1min 室温2×SSC 2min 室温70%，90%，100%酒精中脱水各2min 室温干燥 加20ul DAPI加到杂交区，盖上盖玻片，复染 10min 荧光显微镜下观察结果
二、仪器耗材
仪器：
荧光显微镜及分析软件， PCR扩增仪（变性）， 370C隔水培养箱(杂交)，湿盒，恒温水浴箱，冰 箱，普通离心机，小型高速低温离心机，移液枪 （1000ul,200ul, 20ul，10ul）,玻片盒，通风橱， 震荡混匀器，染色缸、计时器，温度计，温湿度 显示器，量筒，酒精灯，烧杯，天平，试剂瓶等。
1、BAC-DNA的抽提
移上清至新的EP管（冰预冷），加入700ul异丙醇，混匀 13200 rpm，4℃，离心10min 去上清，加入1ml 70%无水乙醇混匀 13200 rpm，4℃，离心10min 去上清，加入15ul Nuclease-free water溶解DNA 室温放置
FISH
Chromosome 1 Whole Painting Probe, Green Label
Chromosome painting of human metaphase chromosomes with chromosome specific probes (paints). Chromosome 2 is labelled in green fluorescence and chromosome 5 in orange.
C. 须计数的颗粒状信号 （R=3.5，低度扩增）
C
免疫组化（2+）与FISH对比图 1.
>30%的肿瘤细胞全部 的细胞膜弱至中等着色
×40
住院号：175465 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC：++ FISH：Ratio>5，中度扩增
×100
免疫组化（－）与FISH对比图1
×40 <30%的肿瘤细胞弱的着色或不着色
传统细胞遗传学的不足
首先，受限于显带技术的分辨率（超过3Mb的DNA才能 被识别），检出像染色体微缺失综合症之类的微小染色 体变异可能性很小；
其次，传统细胞遗传技术只能分析中期分裂相细胞。而 且，许多肿瘤特别是实体，染色体重组非常复杂，无法 通过显带分析方法得到全部染色体核型。
♠ 因此，传统的细胞遗传学方法，如显带技术、 核型分析等，都受到分辨率和覆盖率的限制， 以致于无法全面地发现可能的异常。
FISH有上述优点的原因：
1）使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统
标记探针的物质：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin)
——半抗原报告分子（间接标记） （2）荧光物质（直接标记） Cy2 (绿色) / Cy3(橙色) / Cy3.5(猩红色) / Cy5(红色) 间接标记的信号检测（抗biotin或digoxigenin抗体上连接荧光物质）物质： (1)Fluorescein isothiocyanate(FITC)——绿色 (2)Rhodamine, ——红色 (3)AMCA——兰色
荧光原位杂交(FISH)_ppt课件
肽核苷酸（PNA）探 针 PNA寡聚物是一类 新分子，其结构与 DNA相似。但在PNA 中，没有核糖-磷酸基 骨架，其骨架是不带 电的肽链(聚酰胺）。
PNA与DNA杂交时也 遵循碱基互补配对原则
与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA 的结合不依赖于离子强度，因此杂交 时，受探针变性温度和溶液PH的影响 较小，鉴于这些特点和优点，PNA有 望取代DNA或RNA作为FISH的探针。 但由于PNA探针只能通过化学方法进 行合成，而且合成费用高，因此迄今 所用的PNA探针还仅限于染色体的泛 着丝粒和泛端粒探针。
基本原理
根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条 件下能结合成双链。用放射性或非放射性 物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的 cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核 酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用 放射自显影等方法予以显示，在光镜或电 镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。
探针的制备
探针（probe)是指用于检测特定基 因或转录产物存在或表达的DNA、 RNA或寡核苷酸序列。
杂交实验所选择的核酸探针可以分 为三种：化学合成、克隆和PCR。
探针的分类
根据化学组成，可以将探针分为DNA、 RNA、PNA及寡核苷酸探针。 DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化 学合成、克隆或PCR技术获得。 RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆 的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所 有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针 容易被RNase降解。
FISH的基本原理
FISH基本原理是利用同源互补的待检染色 体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针, 经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探 针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲 和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显 微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。
FISH基础
FISH技术的临床应用
可检测样本包括：
羊水和绒毛： 宫颈细胞： 外周血： 骨髓： 尿液： 石蜡切片： 用于产前诊断、流产原因其他相关疾病分析 用于子宫颈癌癌癌前病变的诊断 用于产后遗传病及血液肿瘤检测 用于诊断血液肿瘤及其治疗效果评价
用于膀胱肿瘤早期诊断和病程监测
用于肿瘤诊治及预后评估
去离子水配制溶液 pH值 蛋白酶的消化程度 探针和杂交缓冲液的配置 变性的温度 杂交的温度、湿度
产前产后诊病、多发性骨髓瘤等
固定时间6-48小时
预处理
二甲苯 脱蜡 梯度乙 醇复水
沸水煮 /酸性亚硫酸钠 20-30min
梯度 脱水
甲醛固定
37º C 蛋白酶 10-30min
FISH过程
• 探针变性 • 玻片变性 变性 83 º C 5min 杂交
42º C 孵育过夜
• 快洗
DAPI复染 洗涤 • 慢洗
FISH实验关键步骤
石蜡切片标本制备及FISH操作流程
操作流程简图
• 制备的质 量
• 新鲜程度 制片 预处理 • 使细胞膜变通透 • 酶消化处理
•
结果分析
变性
FISH
• 杂交 • 洗涤 • 复染
制片
选片 3-5μm切片 裱片 65º C 过夜烘烤 室温保存
固定液使用10%中性缓冲福尔马林
固定液体积：组织块的4-20倍
可检测样本包括：
羊水和绒毛： 宫颈细胞： 外周血： 骨髓： 尿液： 石蜡切片： 用于产前诊断、流产原因其他相关疾病分析 用于子宫颈癌癌癌前病变的诊断 用于产后遗传病及血液肿瘤检测 用于诊断血液肿瘤及其治疗效果评价
用于膀胱肿瘤早期诊断和病程监测
用于肿瘤诊治及预后评估
去离子水配制溶液 pH值 蛋白酶的消化程度 探针和杂交缓冲液的配置 变性的温度 杂交的温度、湿度
产前产后诊病、多发性骨髓瘤等
固定时间6-48小时
预处理
二甲苯 脱蜡 梯度乙 醇复水
沸水煮 /酸性亚硫酸钠 20-30min
梯度 脱水
甲醛固定
37º C 蛋白酶 10-30min
FISH过程
• 探针变性 • 玻片变性 变性 83 º C 5min 杂交
42º C 孵育过夜
• 快洗
DAPI复染 洗涤 • 慢洗
FISH实验关键步骤
石蜡切片标本制备及FISH操作流程
操作流程简图
• 制备的质 量
• 新鲜程度 制片 预处理 • 使细胞膜变通透 • 酶消化处理
•
结果分析
变性
FISH
• 杂交 • 洗涤 • 复染
制片
选片 3-5μm切片 裱片 65º C 过夜烘烤 室温保存
固定液使用10%中性缓冲福尔马林
固定液体积：组织块的4-20倍
鱼的ppt课件英语
02
Types and distribution of fish
Freshwater fish
Common freshwater fish
These fish are widely distributed in rivers, lakes, pounds, and other freshwater habitats Some common examples include approach, cart, perch, and catfish
Regional distribution
Fish specifications are often found in specific regions or habitats based on
their adaptations and ecological requirements For example, some fish
Hale Waihona Puke Water temperature environment
要点一
Thermal pollution
要点二
Ice cover
Thermal pollution refers to the increase of water temperature caused by human activities, which will have a great impact on the survival and behavior of fish If the water temperature is too high, it will affect the growth and reproduction of fish, and may also cause adverse effects on human health
荧光原位杂交(FISH)检测
01
从遗传学角度检测染色体和基因的异常
02
辅助血液疾病的诊断，判断预后，疗效检测及微小残留检测
03
应用：
骨髓移植术后（性别不同的移植献者）、 性别鉴定、CMPD和ALL初诊、CML末次化 疗结束两周以上、AML-M3/M2等疾病
பைடு நூலகம்技术特点
1
可分析间期细胞，不需培养；操作简单、检测快速重复性好、空间定位精确；灵敏性和特异性高
单击添加副标题
荧光原位杂交（FISH）检测
康圣环球医学特检集团
概述 FISH-目前新兴的分子遗传学技术，原理是采用荧光标记的DNA探针，利用探针与检测样本中DNA碱基对的互补性，在探针与标本的DNA杂交后，通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果，从而检测细胞、组织样本中的染色体和基因异常。
临床意义
2
当染色体核型分析不成功或不明确时，可利用FISH检测弥补不足，并可发现复杂易位
探针种类
01
双色单融合探针 双色分离探针
01
ES探针 双色双融合探针 每类探针的检测和适用范围不同，决定其用处不同
01
标本要求 送检标本：骨髓3ml（CML和CLL患者可直接用外周血2ml） 保存条件：肝素钠抗凝，4摄氏度，24h送检 禁忌：冰冻或凝块 注意：建议做FISH的同时做常规细胞遗传学分析。若只要求做FISH，请转交一份近期的细胞遗传学报告。如果无细胞形态学或遗传学的检查，建议作进一步检查！！
报告时间：周一至周五，7个工作日
报告示例：略 结果判读：每个探针检测镜下分析200个细胞核。20例没有造血系统疾病且核型正常的骨髓标本作为正常对照，以此计算分裂信号的平均数和标准差。如果有异常杂交信号的细胞百分比超过正常标准差的3倍，结果将被认为异常。
从遗传学角度检测染色体和基因的异常
02
辅助血液疾病的诊断，判断预后，疗效检测及微小残留检测
03
应用：
骨髓移植术后（性别不同的移植献者）、 性别鉴定、CMPD和ALL初诊、CML末次化 疗结束两周以上、AML-M3/M2等疾病
பைடு நூலகம்技术特点
1
可分析间期细胞，不需培养；操作简单、检测快速重复性好、空间定位精确；灵敏性和特异性高
单击添加副标题
荧光原位杂交（FISH）检测
康圣环球医学特检集团
概述 FISH-目前新兴的分子遗传学技术，原理是采用荧光标记的DNA探针，利用探针与检测样本中DNA碱基对的互补性，在探针与标本的DNA杂交后，通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果，从而检测细胞、组织样本中的染色体和基因异常。
临床意义
2
当染色体核型分析不成功或不明确时，可利用FISH检测弥补不足，并可发现复杂易位
探针种类
01
双色单融合探针 双色分离探针
01
ES探针 双色双融合探针 每类探针的检测和适用范围不同，决定其用处不同
01
标本要求 送检标本：骨髓3ml（CML和CLL患者可直接用外周血2ml） 保存条件：肝素钠抗凝，4摄氏度，24h送检 禁忌：冰冻或凝块 注意：建议做FISH的同时做常规细胞遗传学分析。若只要求做FISH，请转交一份近期的细胞遗传学报告。如果无细胞形态学或遗传学的检查，建议作进一步检查！！
报告时间：周一至周五，7个工作日
报告示例：略 结果判读：每个探针检测镜下分析200个细胞核。20例没有造血系统疾病且核型正常的骨髓标本作为正常对照，以此计算分裂信号的平均数和标准差。如果有异常杂交信号的细胞百分比超过正常标准差的3倍，结果将被认为异常。
免疫组化HE染色FISHISH演示文稿
免疫组化HE染色FISHISH演示 文稿
第一页，总共三十页。
免疫组化
1、免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)， 对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
2、我们现阶段主要要做的组织免疫组化有石蜡切片、冰冻切片免疫组化以及荧光免 疫组化。细胞免疫组化有细胞爬片、细胞印片和细胞涂片免疫组化和荧光免疫组 化。
• 缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或 完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
返回
第十三页，总共三十页。
HE染色
苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ，HE)是石蜡切片技术里 常用的染色法之一 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最 基本、使用最广泛的技术方法。 HE染色的原理：脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸
木精染液使细胞胞核黑蓝色。
三、网状纤维染色
1、网状纤维在组织化学上的反应 网状纤维的主要成分是网硬蛋白，在组织化学上，网状纤维和胶原纤维是容 易区别的。网状纤维是分支纤细的纤维。Van Gieson 氏染色不显色或微红色。 PAS反应呈现红紫色，银浸染为黑色。胶原纤维用Van Gieson氏染色为红色，
• 3、5-10% 正常山羊血清封闭，室温孵育10-30min。倾去血清，勿洗。 • 4、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。 • 5、PBS冲洗，5min×3次。 • 6、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育10-30min；或滴加第二代生物
第一页，总共三十页。
免疫组化
1、免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)， 对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
2、我们现阶段主要要做的组织免疫组化有石蜡切片、冰冻切片免疫组化以及荧光免 疫组化。细胞免疫组化有细胞爬片、细胞印片和细胞涂片免疫组化和荧光免疫组 化。
• 缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或 完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
返回
第十三页，总共三十页。
HE染色
苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ，HE)是石蜡切片技术里 常用的染色法之一 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最 基本、使用最广泛的技术方法。 HE染色的原理：脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸
木精染液使细胞胞核黑蓝色。
三、网状纤维染色
1、网状纤维在组织化学上的反应 网状纤维的主要成分是网硬蛋白，在组织化学上，网状纤维和胶原纤维是容 易区别的。网状纤维是分支纤细的纤维。Van Gieson 氏染色不显色或微红色。 PAS反应呈现红紫色，银浸染为黑色。胶原纤维用Van Gieson氏染色为红色，
• 3、5-10% 正常山羊血清封闭，室温孵育10-30min。倾去血清，勿洗。 • 4、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。 • 5、PBS冲洗，5min×3次。 • 6、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育10-30min；或滴加第二代生物
遗传咨询FISH(英文)-精品医学课件
Used to identify the presence and location of a region of DNA or RNA within morphologically preserved chromosome preparations, fixed cells or tissue sections
FISH: Limitations
➢ Probe design requires knowledge of specific chromosomal abnormalities to be studied
➢ Cutoff signals may be different among laboratories ➢ Processing errors, imperfect hybridization, non-specific
• Special telomeric probes specific to individual chromosomes have been designed
• Probe is based on the TTAGGG repeat present on all human telomeres Application in cytogenetics - can detect submicroscopic deletions and cryptic translocations of genes associated with unexplained mental retardation and miscarriages
➢ Allows simultaneous interrogation of multiple cytogenetic signatures
➢ Can be used either in bulky tumors or tumors where the malignant component contributes to a small proportion of the overall cellular population
FISH: Limitations
➢ Probe design requires knowledge of specific chromosomal abnormalities to be studied
➢ Cutoff signals may be different among laboratories ➢ Processing errors, imperfect hybridization, non-specific
• Special telomeric probes specific to individual chromosomes have been designed
• Probe is based on the TTAGGG repeat present on all human telomeres Application in cytogenetics - can detect submicroscopic deletions and cryptic translocations of genes associated with unexplained mental retardation and miscarriages
➢ Allows simultaneous interrogation of multiple cytogenetic signatures
➢ Can be used either in bulky tumors or tumors where the malignant component contributes to a small proportion of the overall cellular population
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学和环境微生物学研究的有力工具。FISH 技术可以再现微环 境中完整细胞的景象信息, 具有更好的精确性,因此在环境微
生物多样性等研究领域被广泛采用。近几年, 应用FISH 技术
研究自然环境微生物群落的报道较多, 如海水沉积物的群落, 海水、河水和高山湖雪水的浮游菌体、土壤和根系表面的寄 居群落等。
食品检测方面：传统的食品微生物检测大多采用培养 分离的方法，食品中菌落总数测定采用平板计数法获得结 果需要1-2 d，致病位杂交应用最成功的是基因定位。基因定位研 究是构建基因图谱的基本要素, 基因位置的确定有助于了 解基因的功能, 利用FISH 技术, 可以直接确定某一DNA 序
列在染色体上的位置。
二、FISH实验及图例展示
• 1、样本的准备与处理
• 2、实验操作及注意事项
• 3、实验结果的检测 • 4、实验图例的展示
间有互补的碱基序列，在已有的放射性原位杂交技
术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位
杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针与组
织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合 成专一的核酸杂交分子，通过荧光检测系统将待测 核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
2、FISH的发展
• 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获 得成功。
现今越来越多的学者趋向于FISH与IF的结合实验，通 俗一点讲，就是在同一个样本上既进行FISH实验，又同时
进行IF实验检测。这方面实验一般适用于检测一个目的基
因以及该目的基因所相对应的蛋白，我们公司在这方面实 验上条件已非常成熟。另外公司也提供其他方面的实验服 务，有Southern blot 、Northern blot、CHIP、COIP， QPCR等等；蛋白类实验有IHC、IF、WB等。
镜检以及血清学验证等一系列的检测程序大概需要5~7d。
FISH 技术与传统方法相比，具有快速、简便的优点。
医学的产前诊断：染色体异常是引起新生儿先天性 遗传病的主要因素之一。胎儿染色体数目异常可导致胎 儿流产，死胎，存活患儿常表现为各种综合征，涉及多 发畸形，生长发育迟缓，智力低下等，FISH方法能快速 诊断胎儿常见的-三体型及性染色体数目异常，且可靠性 达99% 以上，为产前诊断的快速检测提供了新的有效手 段。
4、实验图例的展示
人齿禹牙髓组织POU5F1基因检测
中红侧沟茧蜂触角 MmedOR1、MmedOBP3、MmedOR5基因检测
鸡子宫SLCO1B3基因检测
猪耳蜗Phytase基因检测
乳腺癌组织ETV1基因的检测
人乳腺癌组织COP1基因检测
微生物菌群检测
白纹伊蚊卵巢组织 Phage WO 基因检测
1、样本的准备与处理
FISH实验在样本准备方面，组织取材应尽可能新鲜，
由于组织核酸降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好 在30min内固定。虽冷冻组织样本、细胞涂片、培养细胞
爬片及中期染色体等材料进行FISH的结果优于石蜡包埋
组织样本的杂交效果，但是石蜡切片易制作，易保存， 且操作过程中不易掉片，所以石蜡切片的样本较常用。 石蜡切片在实验时首先要用二甲苯脱蜡。
肿瘤病理组织更好的了解。
3、FISH的应用
FISH技术已经在细胞遗传学、基因图谱等科 研领域；肿瘤生物学、基因定位、基因扩增、产
前诊断及哺乳动物染色体进化等医学领域；微生
物检测等环境和食品领域得到了广泛应用。
环境监测领域：近几年, 由于FISH 技术的灵敏性和快捷
性使其成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断
基因的定位在一次FISH实验中完成。以下五种方法 是在多彩色FISH基础上发展起来的新技术：染色体 描绘、比较基因组杂交、光谱染色体自动核型分析、 交叉核素色带分析、多彩色原位启动标记。
2.2 DNA纤维荧光原位杂交技术（DNA fiber-FISH）
利用化学方法将染色体进行线性化，再以此 线性化的染色体DNA 作为载体进行FISH，使FISH 的分辨率显著提高。它在染色体图谱绘制，基因
FISH实验
主要内容
一、荧光原位杂交技术简介 二、FISH实验及图例展示
一、荧光原位杂交技术简介
• 1、FISH的原理 • 2、FISH的发展 • 3、FISH的应用
1、FISH的原理 荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization)的基本原理是利用核酸分子单链之
FISH与IF的结合实验实例
•
•
1981年，Langer等建立了非放射性原位杂交技术。
20世纪90年代，FISH在方法上逐步形成了从单色
向多色、从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH再向 fiber-FISH的发展趋势，灵敏度和分辨率也有了大幅度 的提高。
2.1 多色荧光原位杂交（M-FISH）
M-FISH可将多次繁琐的FISH实验和多种不同
2、实验操作及注意事项
实验操作过程中的注意事项
a、石蜡切片脱蜡过程要脱蜡完全。
b、需预热的洗液和变性液应该提前放于达到预热温度的 水浴锅内，预热至少30min。 c、操作过程中应该尽量减少探针接触白光时间，减少荧 光的损耗。
d、实验过程中最好设立一个阴性对照组，不加探针，直接 用洗液代替探针进行孵育，排除组织本身的非特异性表 达。
重组研究以及临床染色体基因序列检测工作中起
着十分重要的作用。
2.3 荧光免疫核型分析和间期细胞遗 传学(FICTION)
FICTION是一种将免疫核型分析和原位杂交相 结合的方法，这种方法可以同时显示异种细胞群 中单个肿瘤细胞的免疫表型和一定的基因改变。
FICTION可用于分析血液肿瘤的系谱以获得对
e、根据切割组织样本的厚度不同，以及样本组织的不同，
消化时间适当增减。 f、链DNA探针和靶DNA的变性。
3、实验结果的检测
实验完成后，用抗荧光衰减封片剂封片后， 通过荧光显微镜采用相应的波长进行检测；如果 不能立即检测，做好的样本要避光保存在-20℃。
所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择
生物多样性等研究领域被广泛采用。近几年, 应用FISH 技术
研究自然环境微生物群落的报道较多, 如海水沉积物的群落, 海水、河水和高山湖雪水的浮游菌体、土壤和根系表面的寄 居群落等。
食品检测方面：传统的食品微生物检测大多采用培养 分离的方法，食品中菌落总数测定采用平板计数法获得结 果需要1-2 d，致病位杂交应用最成功的是基因定位。基因定位研 究是构建基因图谱的基本要素, 基因位置的确定有助于了 解基因的功能, 利用FISH 技术, 可以直接确定某一DNA 序
列在染色体上的位置。
二、FISH实验及图例展示
• 1、样本的准备与处理
• 2、实验操作及注意事项
• 3、实验结果的检测 • 4、实验图例的展示
间有互补的碱基序列，在已有的放射性原位杂交技
术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位
杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针与组
织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合 成专一的核酸杂交分子，通过荧光检测系统将待测 核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
2、FISH的发展
• 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获 得成功。
现今越来越多的学者趋向于FISH与IF的结合实验，通 俗一点讲，就是在同一个样本上既进行FISH实验，又同时
进行IF实验检测。这方面实验一般适用于检测一个目的基
因以及该目的基因所相对应的蛋白，我们公司在这方面实 验上条件已非常成熟。另外公司也提供其他方面的实验服 务，有Southern blot 、Northern blot、CHIP、COIP， QPCR等等；蛋白类实验有IHC、IF、WB等。
镜检以及血清学验证等一系列的检测程序大概需要5~7d。
FISH 技术与传统方法相比，具有快速、简便的优点。
医学的产前诊断：染色体异常是引起新生儿先天性 遗传病的主要因素之一。胎儿染色体数目异常可导致胎 儿流产，死胎，存活患儿常表现为各种综合征，涉及多 发畸形，生长发育迟缓，智力低下等，FISH方法能快速 诊断胎儿常见的-三体型及性染色体数目异常，且可靠性 达99% 以上，为产前诊断的快速检测提供了新的有效手 段。
4、实验图例的展示
人齿禹牙髓组织POU5F1基因检测
中红侧沟茧蜂触角 MmedOR1、MmedOBP3、MmedOR5基因检测
鸡子宫SLCO1B3基因检测
猪耳蜗Phytase基因检测
乳腺癌组织ETV1基因的检测
人乳腺癌组织COP1基因检测
微生物菌群检测
白纹伊蚊卵巢组织 Phage WO 基因检测
1、样本的准备与处理
FISH实验在样本准备方面，组织取材应尽可能新鲜，
由于组织核酸降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好 在30min内固定。虽冷冻组织样本、细胞涂片、培养细胞
爬片及中期染色体等材料进行FISH的结果优于石蜡包埋
组织样本的杂交效果，但是石蜡切片易制作，易保存， 且操作过程中不易掉片，所以石蜡切片的样本较常用。 石蜡切片在实验时首先要用二甲苯脱蜡。
肿瘤病理组织更好的了解。
3、FISH的应用
FISH技术已经在细胞遗传学、基因图谱等科 研领域；肿瘤生物学、基因定位、基因扩增、产
前诊断及哺乳动物染色体进化等医学领域；微生
物检测等环境和食品领域得到了广泛应用。
环境监测领域：近几年, 由于FISH 技术的灵敏性和快捷
性使其成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断
基因的定位在一次FISH实验中完成。以下五种方法 是在多彩色FISH基础上发展起来的新技术：染色体 描绘、比较基因组杂交、光谱染色体自动核型分析、 交叉核素色带分析、多彩色原位启动标记。
2.2 DNA纤维荧光原位杂交技术（DNA fiber-FISH）
利用化学方法将染色体进行线性化，再以此 线性化的染色体DNA 作为载体进行FISH，使FISH 的分辨率显著提高。它在染色体图谱绘制，基因
FISH实验
主要内容
一、荧光原位杂交技术简介 二、FISH实验及图例展示
一、荧光原位杂交技术简介
• 1、FISH的原理 • 2、FISH的发展 • 3、FISH的应用
1、FISH的原理 荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization)的基本原理是利用核酸分子单链之
FISH与IF的结合实验实例
•
•
1981年，Langer等建立了非放射性原位杂交技术。
20世纪90年代，FISH在方法上逐步形成了从单色
向多色、从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH再向 fiber-FISH的发展趋势，灵敏度和分辨率也有了大幅度 的提高。
2.1 多色荧光原位杂交（M-FISH）
M-FISH可将多次繁琐的FISH实验和多种不同
2、实验操作及注意事项
实验操作过程中的注意事项
a、石蜡切片脱蜡过程要脱蜡完全。
b、需预热的洗液和变性液应该提前放于达到预热温度的 水浴锅内，预热至少30min。 c、操作过程中应该尽量减少探针接触白光时间，减少荧 光的损耗。
d、实验过程中最好设立一个阴性对照组，不加探针，直接 用洗液代替探针进行孵育，排除组织本身的非特异性表 达。
重组研究以及临床染色体基因序列检测工作中起
着十分重要的作用。
2.3 荧光免疫核型分析和间期细胞遗 传学(FICTION)
FICTION是一种将免疫核型分析和原位杂交相 结合的方法，这种方法可以同时显示异种细胞群 中单个肿瘤细胞的免疫表型和一定的基因改变。
FICTION可用于分析血液肿瘤的系谱以获得对
e、根据切割组织样本的厚度不同，以及样本组织的不同，
消化时间适当增减。 f、链DNA探针和靶DNA的变性。
3、实验结果的检测
实验完成后，用抗荧光衰减封片剂封片后， 通过荧光显微镜采用相应的波长进行检测；如果 不能立即检测，做好的样本要避光保存在-20℃。
所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择