实验二蛋白质含量的测定凯氏定氮法
实验二_蛋白质含量的测定-凯氏定氮法1
实验二_蛋白质含量的测定-凯氏定氮法1一、实验原理蛋白质是生物体内重要的营养成分，因此测定样品中蛋白质含量是生物学领域中的一项基础性工作。
凯氏定氮法是测定蛋白质含量的一种常用方法。
由于蛋白质中氮元素的含量较高，因此凯氏定氮法以氮元素计算蛋白质含量，具有简便、准确、重现性好等特点，广泛应用于蛋白质含量的测定中。
该法的基本原理是：将待测样品中蛋白质水解后，将产生的氨基酸再通过氧化还原反应以生成气态氨，利用碱性铜离子氧化氨生成蓝色化合物，蓝色化合物的浓度与样品中氮的含量成正比，从而计算出样品中蛋白质的含量。
二、实验仪器和试剂1. 仪器：水浴器、移液器、分析天平。
2. 试剂：包括0.1mol/L NaOH、1% CuSO4、1% KNaC4H4O6、1% Na2SO4、 Na2CO3和测定氯离子的盐酸铵铁Ⅲ溶液等。
三、实验步骤1. 准备样品：首先将待测样品去除水分，将10mg的样品放入烘箱中加热到60℃，持续4h使其干燥。
取出后冷却，称取约10mg-20mg样品，转移到干净、干燥的燃烧器中。
2. 水解：加入3ml的6mol/L HCl，进行加热水解。
将燃烧器放到水浴器中，加入适量的水，然后用酒精灯或燃气灯加热至沸腾。
持续水解1h，注意不要使燃烧器干燥，需要时加入适量的水。
3. 去除氨：过滤水解液，将滤液倒入容量瓶中，并加入足量的NaOH溶液，使pH值达到9-10。
再加入10ml的Na2SO4溶液，混匀。
然后将瓶口拔开，将瓶口放在水浴器中并加入适量的NaOH溶液，使瓶内的氨气完全挥发，待液面稳定后用盖子盖好。
4. 确定还原态铜离子的数量：取一定量的0.1mol/L NaOH溶液，加入CuSO4和KNaC4H4O6，混匀后加入约1g的Na2CO3，加水定容，制成标准CuSO4溶液。
5. 滴定：取出约5ml水解液，放入锥形瓶中加清水至刻度线，加入50μl的盐酸铵铁Ⅲ溶液，混匀。
用标准CuSO4溶液滴定至液体颜色由黄变蓝。
蛋白质的测定方法—凯氏定氮法
蛋白质的测定方法—凯氏定氮法一、原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
二、试剂1、硫酸铜硫酸钾浓硫酸氢氧化钠2、硼酸溶液（20g/L）：称取20g硼酸，加水溶解并稀释至1000ml。
3、氢氧化钠溶液（400g/L）：称取400gNaOH加水溶解后，放冷，并稀释至1000ml。
4、盐酸标准溶液（0.05mol/L）5、甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100ml。
6、溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100ml。
7、甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：临用时以1:5混合。
三、测定1、试样处理（消化）：准确称取水解胶原蛋白0.5g,准确至0.0001g，硫酸铜0.2g，硫酸钾6g于干燥洁净的凯氏定氮管中，至消化炉上，加浓硫酸20ml，盖帽。
开启消化炉（温度设定为400℃），仪器大约20分钟达到设定温度，开始计时，样品消化需2-3h，至液体呈蓝绿色并澄清透明后。
断电，放冷。
2、蒸馏与吸收：将消化好的试样转移至100ml容量瓶中，加水（边加边缓慢振摇容量瓶，由于样品放热，操作时戴手套以免烫伤）稀释至100ml容量瓶中，摇匀，备用。
同时做空白试验。
向接收瓶中加入硼酸（20g/L）50ml及10D甲基红—溴甲酚绿混合指示剂。
打开凯氏定氮仪电源开关，打开冷却水，设置加碱（40%的NaOH 溶液）时间为7秒，蒸馏时间为6分钟，取定容后溶液10ml到消化管中，放置到相应位置。
关闭安全门，开机预热3分钟后按启动键开始加碱、蒸馏。
当吸收液呈中性时，停止吸收。
用0.05mol/L盐酸标准液滴定接收液，颜色由绿色变为灰红色即为滴定终点，记录消耗盐酸体积。
3、计算C*(V1-V0)*0.014X=----------------------*F*100M*10/100其中水解胶原蛋白换算系数F为5.791、注意事项1、开机预热3分钟，第一个样品测试用蒸馏水代替样品，加碱时间设置为0，使仪器预热。
凯氏定氮法测蛋白质含量
凯⽒定氮法测蛋⽩质含量凯⽒定氮法测蛋⽩质含量原理蛋⽩质是含氮的有机化合物。
⾷品与硫酸和催化剂⼀同加热消化，使蛋⽩质分解，分解的氨与硫酸结合⽣成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，⽤硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋⽩质含量。
1. 有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作⽤下，硝化⽣成（NH4）SO42反应式为：2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04（其中CuSO4做催化剂）2. 在凯⽒定氮器中与碱作⽤，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O3. ⽤已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因⼦，既得蛋⽩质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3试剂所有试剂均⽤不含氨的蒸馏⽔配制。
硫酸铜。
硫酸钾。
硫酸。
2%硼酸溶液。
混合指⽰液：1份0.1%甲基红⼄醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿⼄醇溶液临⽤时混合。
也可⽤2份0.1%甲基红⼄醇溶液与1份0.1%次甲基蓝⼄醇溶液临⽤时混合。
40%氢氧化钠溶液。
0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。
仪器定氮蒸馏装置：如图所⽰。
凯⽒定氮法仪器1.安全管2.导管3.汽⽔分离管4.样品⼊⼝5.塞⼦6.冷凝管7.吸收瓶8.隔热液套9.反应管10.蒸汽发⽣瓶操作⽅法1、样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移⼊⼲燥的100ml或500ml定氮瓶中，加⼊0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶⼝放⼀⼩漏⽃，将瓶以45度⾓斜⽀于有⼩孔的⽯棉⽹上，⼩⽕加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停⽌后，加强⽕⼒，并保持瓶内液体微沸，⾄液体呈蓝绿⾊澄清透明后，再继续加热0.5⼩时。
实验二微量凯氏定氮法测定(1)(精)
NH 4 H 2 BO3 HCL NH 4CL H 3 BO3
实验材料与试剂
实验材料：食用面粉 实验试剂： 浓硫酸 30%氢氧化钠溶液 克氏催化剂 2%硼酸 指示剂 0.01M HCL
实验器材
凯氏烧瓶 电炉 凯氏定氮蒸馏装置 锥形瓶 100ml容量瓶 酸式滴定管
注意事项
本法适用于0.05-3.0mg氮，样品中含氮量 过高时，则应减少取样量或将样液稀释。 勿使样品粘于烧瓶颈部。放置液体样品时， 需将吸管插至烧瓶底部再放样：如固体样 品，可将样品卷在纸内，平插入烧瓶底部， 然后再将烧瓶直起，纸卷内的样品即完全 放在烧瓶底部。
蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏
操作步骤
消化： 准确称取1克食用面粉，用称量纸卷好小心送入至50毫升 的凯氏烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上。向另一烧瓶加 入1ml水作空白对照。 在每个烧瓶内加入硫酸钾—硫酸铜混合物（克氏催化剂） 少许，浓硫酸10ml，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度 角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电 炉上消化。 在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶 内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强 火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。消化完毕， 待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml（注意慢加，边加 边摇）。冷却后将瓶内容物转入100ml的容量瓶中，并用 蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻 度摇匀，做上记号备用。
B、蒸馏：用酒精灯加热（应用挡风板将灯 围拢，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口 以免A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液 从冷凝柱F顶端滴下时起，继续蒸3-5分钟， 然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2 分钟，最后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完 毕，取下锥形瓶，随即将蒸馏器洗净。） C、样品及空白蒸馏：用吸量管分别吸取 2ml样品和2ml空白按上述操作步骤进行蒸 馏。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量简介凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种常用的测定蛋白质含量的方法，它通过将样品中的有机氮转化为氨，然后将氨转化为氨基氮，再由氨基氮计算得出蛋白质的含量。
这个方法的优点是稳定可靠，适用于各种类型的样品。
实验原理凯氏定氮法的实验原理如下：1.样品预处理：将待测样品进行预处理，去除样品中的非氮有机物。
这样可以确保凯氏定氮方法只测定到蛋白质中的氮。
2.消化反应：将预处理后的样品与硫酸相结合，加热至沸腾。
在这个过程中，有机氮将被转化为氨。
3.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。
4.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。
5.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束，测定出反应过程中消耗的酸的体积。
6.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。
实验步骤以下是凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验步骤：1.准备样品：根据实验需要，准备待测样品。
样品的选择应根据实验目的和样品的特性进行。
2.样品预处理：将样品经过细碎、研磨等处理，去除样品中的非氮有机物。
3.消化反应：将预处理后的样品与浓硫酸相结合，加热至沸腾。
消化时间一般为2小时。
4.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。
5.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。
6.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束。
7.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。
实验注意事项1.在进行样品消化时，必须控制好加热温度，避免样品的溢出和烧焦。
2.在进行滴定时，应注意控制滴液的速度，避免过量的酸滴入。
3.实验过程中需注意个人安全，避免触及强酸和强碱。
蛋白质含量的测定微量凯氏定氮法
实验准确性保证
1
确保使用的试剂和器具清洁无污染，避免误差。
2
在实验过程中，要严格控制反应温度和时间，确 保反应完全。
3
为保证准确性，建议进行多次重复实验，取平均 值。
实验失败的可能原因及解决方法
原因1
样品消化不完全。解决方法：检查样品是否符合要求，调整消化 条件（如温度、时间、试剂用量等）以确保消化完全。
原因2
蒸馏过程中出现故障。解决方法：检查蒸馏装置是否正常，确保冷 凝水畅通，及时排除故障。
原因3
滴定操作不当。解决方法：加强滴定操作训练，确保操作规范，减 小误差。
06
结论
微量凯氏定氮法的优缺点
优点
微量凯氏定氮法是一种准确、可靠的蛋白质含量测定方法，具有较高的精密度和准确度。该方法操作 简便，试剂用量少，适用于对样品量要求较小的实验。此外，微量凯氏定氮法还可以测定其他氮含量 较高的物质，如氨基酸、肽等。
价值
微量凯氏定氮法的应用价值主要体现在以下几个方面： 首先，在食品工业中，该方法可用于检测食品中蛋白质 的含量，确保产品的质量和安全；其次，在药品行业中 ，微量凯氏定氮法可用于检测药品中蛋白质的含量，保 证药品的质量和有效性；此外，在生物制品领域，该方 法可用于检测蛋白质药物的含量和纯度，为生物制品的 质量控制提供有力支持。因此，微量凯氏定氮法的应用 具有广泛的实际意义和价值。
结果的表示和误差分析
结果表示
测定结果以百分数表示，保留小数点后一位。
误差分析
误差来源可能包括试剂不纯、称样误差、滴定误差等，为减小误差，应选择高纯度试剂，提高称样精度，加强滴 定操作训练。
05
实验注意事项
蛋白质测定-凯氏定氮法
反应室中溶液的颜色
硼酸吸收液的颜色
[注意] ①加NaOH一定要过量，此时溶液生成深蓝色或黑色沉淀
②为防止样液中氨气逸出。一是要水封，二要夹紧废液蝴蝶
夹后再通蒸汽，三要注意接头处有无松漏现象
③ 冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。 吸收液温度不应超过40℃，避免氨气逸出，若超过时 可置于冷水浴中使用。
提高溶液沸点，从而加快有机物分解
浓硫酸 氧化作用：有机物质氧化分解为H2O和CO2
样品预处理
样品充分混匀
固体试样 0.2~2g 半固体试样 2~5g 液体试样 10~25g
直接消化
样品称量、消化
1.000g奶粉 0.2g硫酸铜 6g硫酸钾 20mL浓硫酸 玻璃珠
轻摇
小火加热炭化 至泡沫完全停止
大火加热 保持瓶中液体微沸
若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶 液,使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品
及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋 白质含量:
蛋白氮=总氮-非蛋白氮
准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml， 移 取 5ml 消 化 液 进 行 蒸 馏 ， 用 20ml 硼 酸 吸 收 ， 再 用 0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的 蛋白质含量？
实验
奶粉中蛋白质的测定 ——凯氏定氮法
【基础知识】
蛋白质概述
蛋白质是食品营养价值的重要指标，含N是蛋白质区 别其他有机化合物的主要标志。大多数蛋白质含氮量
接近，一般来说，pro的平均含氮量为16%，即一份 氮相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。
注意：
不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、 青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大 豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、 燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳及其 制品为6.38。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量【凯氏定氮法测定蛋白质含量】引言：蛋白质是生物体中非常重要的一类有机物质，它在细胞结构、代谢调节、酶催化等方面都起到至关重要的作用。
因此，准确测定蛋白质的含量对于研究生物体的生理功能和代谢过程十分重要。
凯氏定氮法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，它利用蛋白质中的氮元素与含氮化合物反应，通过测定反应生成物中的氨基氮含量来确定蛋白质的含量。
本文将一步一步地介绍凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理、实验步骤以及注意事项。
一、原理：凯氏定氮法的原理基于蛋白质是含有较高比例的氮元素的化合物。
测定蛋白质的含量可以通过测定样品中氨基氮的含量来实现，其中氨基氮与蛋白质的含量呈线性关系。
凯氏定氮法的核心步骤是将蛋白质样品与含有氧化剂的酸溶液一起加热，使蛋白质中的氮元素被氧化转化为氨基氮，然后用氨盐指示剂反应形成带有颜色的化合物，最后通过比色分析来测定蛋白质中氮元素的含量。
二、实验步骤：1. 实验前准备：根据实验需求准备蛋白质样品、凯氏试剂、氨盐指示剂等。
2. 样品制备：将蛋白质样品称取适量，加入酸性溶液中溶解，使其完全溶解。
注意保持溶液的酸性，并避免样品中的氨基酸被过度氧化。
3. 氮元素的氧化：将样品溶液与凯氏试剂混合，在适当的温度下加热，使样品中的氮元素被氧化转化为氨基氮。
反应时间根据样品的性质而定，一般为1-2小时。
4. 反应结束：冷却样品溶液，使其达到室温。
反应结束后，样品中的蛋白质会被转化为氨基氮。
5. 比色分析：将反应溶液与氨盐指示剂进行反应，形成带有颜色的化合物。
然后使用分光光度计测定化合物的吸光值。
通过与标准曲线进行比较，可以确定样品中氨基氮的含量，进而计算出蛋白质的含量。
三、注意事项：1. 样品的选择：样品的选择取决于实验的目的，可以是纯蛋白质样品，也可以是含有蛋白质的复杂混合物。
样品的含量和浓度应该适当，以保证实验结果的准确性。
2. 温度和时间的控制：样品与凯氏试剂的加热温度一般为75-105摄氏度，反应时间根据样品的性质而定。
蛋白质测定-凯氏定氮法
精品课件
准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml， 移 取 5ml 消 化 液 进 行 蒸 馏 ， 用 20ml 硼 酸 吸 收 ， 再 用 0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的 蛋白质含量？
试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消 化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？
精品Байду номын сангаас件
凯氏定氮蒸馏装置
传统装置
1：电炉 2：水蒸气发生器 3：螺旋夹 4：小玻杯及棒状玻塞 5：反应室 6：反应室外层 7：橡皮管及螺旋夹 8：冷凝管 9：蒸馏液接收瓶
精品课件
水蒸气发生器： 装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇
指示剂数滴及硫酸数ml，使水呈微红色（保持酸性 以防水中氨的逸出）→按上图所示搭好装置
精品课件
凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的 测定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉 以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为 粗蛋白质含量。
若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶 液,使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品
及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋 白质含量:
实验 奶粉中蛋白质的测定
——凯氏定氮法
精品课件
【基础知识】
蛋白质概述
蛋白质是食品营养价值的重要指标，含N是蛋白质区 别其他有机化合物的主要标志。大多数蛋白质含氮量 接近，一般来说，pro的平均含氮量为16%，即一份氮 相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。
注意： 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、 青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大 豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、 燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳及其 制品为6.38。
牛奶中蛋白质含量的测定---- 凯氏定氮法
牛奶中蛋白质含量的测定---- 凯氏定氮法一：实验目的：掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理学会凯氏定氮法的操作技术二：实验原理：◆蛋白质的含氮量较恒定，一般为16%，上下略有浮动◆N/16%=N*6.25=蛋白质的含量◆样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。
然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收，再以标准盐酸溶液滴定，测出释放的氨含量，并计算氮素含量，再乘以6.25即为蛋白质的含量。
◆整个过程分三步：消化、蒸馏和吸收、滴定1：消化：蛋白质+ H2SO4 →（NH4)2SO4 + SO2↑+ CO2↑+ H2O瓶颈45度角倾斜2：蒸馏：消化液+ 氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气2NaOH＋(NH4)2SO4＝2NH3 ↑＋Na2SO4 ＋2H2O3：吸收与滴定（1）用4%硼酸吸收（2）用盐酸标准溶液滴定（3）混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂）指示剂：红色———→绿色———→红色（酸）吸收（碱）滴定（酸）3NH3 + H3BO3→(NH4)3BO3(NH4)3BO3+ 3HCl →3NH4Cl + H3BO3三：实验步骤1、消化：准确量取牛奶0.5mL，移入干燥的凯氏烧瓶中（勿粘附在瓶壁上），加入0.2g硫酸铜、0.3g硫酸钾、10mL浓硫酸，小心摇匀，于通风橱内消化（先小火，待炭化完全后，加大火力至溶液呈蓝绿色），冷却至室温，定容至25mL。
同时消化一份空白试剂为对照。
2、蒸馏、吸收◆取40mL硼酸溶液于锥形瓶中，加2d混合指示剂，置于冷凝管下端，为接受瓶。
◆量取5mL样品消化液由加料口加入反应室，用5mL蒸馏水冲洗加料口，再加入40%NaOH10mL（溶液呈蓝褐色），不要摇动，立即封口。
◆夹紧缓冲管下口，开始蒸馏，当接收瓶溶液颜色变化时，继续蒸馏3-5min，下降接收瓶，使硼酸液面离开冷凝管口，继续蒸馏1min，用蒸馏水淋洗浸入硼酸的管外壁，移出接收瓶，滴定。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量摘要：凯氏定氮法被广泛应用于测定蛋白质含量。
本文主要介绍凯氏定氮法的原理、步骤和应用，并对该方法的优缺点进行了分析和讨论。
结果表明，凯氏定氮法具有简便、灵敏度高、重现性好等优点，适用于各种样品的蛋白质含量测定。
关键词：凯氏定氮法，蛋白质含量，测定方法，优缺点引言：蛋白质是生物体内最基本的组成成分之一，对于了解生物过程、疾病诊断和治疗等方面具有重要作用。
因此，准确测定蛋白质含量对于科学研究和医学实践具有重要意义。
目前，常用的蛋白质测定方法包括比色法、光谱法、生物学活性法和凯氏定氮法等。
其中，凯氏定氮法因其简便、灵敏度高、重现性好等优点而被广泛应用。
一、凯氏定氮法的原理凯氏定氮法是基于蛋白质中含有氮元素这一特点进行测定的。
该方法的原理是将样品中的蛋白质完全燃烧后，收集生成的氮气，并用浓碱溶液吸收氮气生成氨水。
然后使用酸滴定法测定可滴定酸的用量，从而间接计算出样品中蛋白质的含量。
二、凯氏定氮法的步骤凯氏定氮法的步骤主要包括样品的预处理、加热燃烧、氨水吸收和酸滴定等。
1. 样品的预处理：将待测样品称取适量，根据样品的特性选择适当的方法进行分解或加热处理，以使蛋白质完全释放出来。
2. 加热燃烧：将经过预处理的样品放入燃烧器中，加热到适当温度，使样品中的蛋白质完全燃烧产生氮气。
3. 氨水吸收：将生成的氮气通过吸收瓶中的浓碱溶液，生成氨水。
氨水的生成量与样品中蛋白质的含量成正比。
4. 酸滴定：用标准酸溶液滴定氨水中的可滴定酸，测定可滴定酸的用量，进而计算出样品中蛋白质的含量。
三、凯氏定氮法的应用凯氏定氮法广泛应用于生物化学、食品科学、环境监测等领域的蛋白质含量测定。
其应用范围包括但不限于以下几个方面：1. 食品科学：凯氏定氮法可以用于测定食品中的蛋白质含量，包括肉类、豆类、谷物等。
2. 生物化学：凯氏定氮法可用于测定细胞培养基中蛋白质的含量，用于生物过程的研究和细胞培养的质量控制。
3. 环境监测：凯氏定氮法可用于测定水样中蛋白质的含量，用于环境污染的监测和评价。
蛋白质的测定方法(剀氏定氮法)
蛋白质的测定方法（凯氏定氮法）一、原理有机物与硫酸共热，其中的氮转变为硫酸铵，然后测定氮量，然后乘以 6.25，即可得到有机物中粗蛋白含量。
二、试剂1.浓硫酸（98%、18mol/l）2.0.1N稀硫酸溶液：取浓硫酸（98%、18mol/l）2.8ml稀释，定容至1000ml。
3.40%氢氧化钠溶液4.0.1N标准氢氧化钠溶液：（1）配制：取氢氧化钠（分析纯）4克溶于蒸馏水中，定容至1000ml。
（2）标定：取配制的氢氧化钠溶液15ml、酚酞指示剂2-3滴，用0.1N的草酸溶液标定，至溶液变为无色时，记下耗用草酸溶液的量，换算成氢氧化钠的实际浓度，记录。
5．混合指示剂（亚甲基蓝+甲基红）：由2倍体积0.1%甲基红无水乙醇溶液与1倍体积0.1%亚甲基蓝水溶液混合而成。
（此指示剂碱性时呈绿色，中性时呈灰色，酸性时呈红色）。
6.混合催化剂：称取硫酸钾100克、硫酸铜10克、硒粉1克均匀混合后研细待用。
7.酚酞指示剂：溶酚酞1.000克于100ml95%乙醇中。
三、操作规程：Ⅰ.样品预处理：将待测物质烘至恒重（70℃条件下）、磨碎，再烘至恒重制成样品装如广口瓶保存于干燥器中以备测定。
Ⅱ.消化（1）取样：准确称取样品0.2000-0.3000克，装入50ml凯氏烧瓶中（将称量纸卷为圆筒状转入），同时加入浓硫酸6ml以及0.5克催化剂。
（2）将凯氏烧瓶放入通风橱中的消化炉，将炉温调至450℃开始消化，开始10分钟左右注意经常摇动凯氏烧瓶以防止样品经碳化变黑后产生的大量炮沫溅出。
注意不能让泡沫及黑色物质上升到烧瓶颈部）。
消化时间一般为5小时，消化完全后样品消化液呈淡蓝绿色。
（3）冷却消化液，将样品消化液无损地转入50ml容量瓶（注意要用蒸馏水把凯氏烧瓶冲洗干净3-4次，洗涤液也转入容量瓶），定容至50ml、摇匀，待测。
Ⅲ.蒸馏（凯氏蒸馏）（1）清洗装置：测定前用自来水冲洗反应室3次，然后空蒸1分钟，以备测定开始。
蛋白质测定-凯氏定氮法
在蒸馏过程中，要确保冷凝器 工作正常，以免造成氨气泄漏
。
在滴定过程中，要控制好滴定 速度，避免过快或过慢，影响
测定结果的准确性。
实验环境要求与维护
实验室应保持整洁、干燥、通风良好。
实验器具应妥善保管，避免损坏和污 染。
实验台面应定期清洁，保持无尘状态。
实验室的电源和加热设备应定期检查 和维护，确保安全可靠。
体积误差、氮换算系数误差等。
误差传递
02
根据误差来源，评估其对最终结果的影响程度，并计算误差传
递系数。
结果可靠性评估
03
根据误差传递结果，对测定结果的可靠性进行评估，判断是否
需要重新进行实验或采取其他措施来减小误差。
05
注意事项与安全
实验安全注意事项
01
实验操作应在通风橱中 进行，以避免吸入有害 气体。
结果计算
根据实验数据，计算样品 中的蛋白质含量。
误差分析
对实验结果进行误差分析， 确保测定结果的准确性和 可靠性。
04
结果分析与解读
数据记录与整理
实验数据
在实验过程中，需要准确记录每 个步骤中的数据，包括样品质量 、滴定体积、空白实验滴定体积 等。
数据整理
将实验数据整理成表格，列出每 个样品的各个测量值，以便后续 计算和分析。
限制
由于凯氏定氮法操作繁琐、耗时长、试剂消耗量大等缺点，对于一些低蛋白质含量的样 品或者特殊样品（如含有大量非蛋白质氮的样品），该方法可能不太适用。同时，凯氏 定氮法测定的结果受样品处理和操作过程的影响较大，需要严格控制实验条件和操作步
骤。
02
实验材料与设备
实验材料
硫酸铜
用于样品消化，提 供催化剂。
蛋白质含量测定(凯氏定氮法)
食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）一.目标与请求1.进修凯氏定氮法测定蛋白质的道理.2.控制凯氏定氮法的操纵技巧,包含样品的消化处理.蒸馏.滴定及蛋白质含量盘算等.二.试验道理蛋白质是含氮的化合物.食物与浓硫酸和催化剂配合加热消化,使蛋白质分化,产生的氨与硫酸联合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸接收后,再用盐酸尺度溶液滴定,依据酸的消费量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量.因为食物中除蛋白质外,还含有其它含氮物资,所以此蛋白质称为粗蛋白.三.仪器与试剂硫酸铜（CuSO4·5H20）硫酸钾硫酸（密度为 1.8419g/L）硼酸溶液（20g/L）氢氧化钠溶液（400g/L） 0.01mol/L盐酸尺度滴定溶液.混杂指导试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份,与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混杂.微量定氮蒸馏装配：如图3- 所示.图3- 微量凯氏定氮装配1.电炉;2.水蒸气产生器（2L平底烧瓶）;3.螺旋夹a;4.小漏斗及棒状玻璃塞（样品进口处）;5.反响室;6.反响室外层;7.橡皮管及螺旋夹b;8.冷凝管;9.蒸馏液接收瓶.四.试验步调1.样品消化称取样品约2.00g（±0.001g）,移入湿润的100mL凯氏烧瓶中,参加0.2g硫酸铜和6g硫酸钾,稍摇匀后瓶口放一小漏斗,参加20mL浓硫酸,将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上,应用万用电炉,在通风橱中加热消化,开端时用低温加热,待内容物全体炭化,泡沫停滞后,再升高温度保持微沸,消化至液体呈蓝绿色澄清透明后,持续加热0.5h,取下放冷,当心加20mL水,放冷后,无损地转移到100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀备用,即为消化液.试剂空白试验：取与样品消化雷同的硫酸铜.硫酸钾.浓硫酸,按以上同样办法进行消化,冷却,加水定容至100mL,得试剂空白消化液.2.定氮装配的检讨与洗涤检讨微量定氮装配是否装好.在蒸气产生瓶内装水约三分之二,加甲基红指导剂数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,参加数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸.测定前定氮装配如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反响管三分之一体积）通入蒸汽煮沸,产生的蒸汽冲洗冷凝管,数分钟后封闭夹子a,使反响管中的废液倒吸流到反响室外层,打开夹子b由橡皮管排出,如斯数次,即可应用.3.碱化蒸馏量取硼酸试剂20mL于三角瓶中,参加混杂指导剂2~3滴,并使冷凝管的下端拔出硼酸液面下,在螺旋夹a封闭,螺旋夹b开启的状况下,精确汲取10.0mL样品消化液,由小漏斗流入反响室,并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反响室,棒状玻塞塞紧.使10mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯,提起玻塞使其徐徐流入反响室,用少量水冲洗立刻将玻塞盖坚,并加水于小玻杯以防漏气,开启螺旋夹a,封闭螺旋夹b,开端蒸馏.通入蒸汽蒸腾10min后,移动接收瓶,液面分开凝管下端,再蒸馏2min.然后用少量水冲洗冷凝管下端外部,取下三角瓶,预备滴定.同时汲取10.0mL试剂空白消化液按上法蒸馏操纵.4.样品滴定以0.01mol/L盐酸尺度溶液滴定至灰色为终点.5.数据记载五.成果盘算式中 X——样品蛋白质含量（g/100g）;V1——样品滴定消费盐酸尺度溶液体积（mL）;V2——空白滴定消费盐酸尺度溶液体积（mL）;c——盐酸尺度滴定溶液浓度（mol/L）;0.0140 ——][Lmolc 尺度滴定溶液相当的氮的质HCl()000/.1量（g）;m——样品的质量（g）;F——氮换算为蛋白质的系数,一般食物为 6.25;乳成品为6.38;面粉为5.70;高梁为 6.24;花生为 5.46;米为5.95;大豆及其成品为5.71;肉与肉成品为6.25;大麦.小米.燕麦.裸麦为 5.83;芝麻.向日葵5.30.盘算成果保存三位有用数字.六.留意事项及解释1.本法也实用于半固体试样以及液体样品检测.半固体试样一般取样规模为2.00g~5.00g;液体样品取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30mg~40mg）.若检测液体样品,成果以g/100mL暗示.2.消化时,若样品含糖高或含脂及较多时,留意控制加热温度,以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶,造成样品损掉.可参加少量辛醇或液体白腊,或硅消泡剂削减泡沫产生.3.消化时应留意扭转凯氏烧瓶,将附在瓶壁上的碳粒冲下,对样品完整消化.若样品不轻易消化至澄清透明,可将凯氏烧瓶中溶液冷却,参加数滴过氧化氢后,再持续加热消化至完整.4.硼酸接收液的温度不该超出40℃,不然氨接收削弱,造成检测成果偏低.可把接收瓶置于冷水浴中.5.在反复性前提下获得两次自力测定成果的绝对差值不得超出算术平均值的10%。
凯氏定氮法蛋白质含量计算公式
凯氏定氮法蛋白质含量计算公式
凯氏定氮法是一种应用于测定蛋白质含量的分析法，此方法基于蛋
白质可以被完全氮被氧化至碳酸亚索、亚磷酸钠和尿素的原理，根据
经典的凯氏定氮实验技术，可以确定某个样品可溶性物质或有机物的
含氮量，从而计算蛋白质含量。
具体的计算公式如下：
蛋白质含量（mg）= 含氮量（V1）×标定液浓度（C2）× 5.7 / 样品容
量（V2）
其中，含氮量V1表示体外侦测到的样品中有害氮含量；标定液浓度
C2为参照品经过分析所得的含量浓度；样品容量V2 表示所测样品的
容量；5.7反映了蛋白质中氮的原子重量的比例，是蛋白质的标准组成
成分，且加上水中的水分，回到常温下蛋白质的总重量。
凯氏定氮法是一种精确的定量分析方法，广泛应用于蛋白质含量分析，能反映一定样本蛋白质组分的定量分析，是分析蛋白质含量的金标准。
同时，它不仅适用于研究蛋白质的含氮分析，还可以用于研究某些有
机物中的氮含量。
但是，它也存在一定的局限性，比如无法对非氨基
酸形式的氮进行检测，也无法对非氨基酸的含量进行计算。
此外，凯
氏定氮法需要大量的实验环境及相关仪器设备，且严格控制实验过程
条件，才能得出准确的蛋白质含量分析结果。
蛋白质制备及含量测定(凯氏定氮法)
实验六蛋白质制备及含量测定—微量凯氏（Mirco-Kjeldahl ）定氮法一、实验目的要求1、了解蛋白质提取的一般方法和原理2、了解蛋白质含量测定的常用方法3、学习微量凯氏定氮法的原理4、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋白质含量的换算等。
二、实验原理1、蛋白质的提取与制备蛋白质的提取与制备方法与生物材料的类型及蛋白质的存在部位有关。
如果是胞内蛋白，首先必须要进行细胞破碎。
细胞破碎的方法与细胞的类型有关，包括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。
如果是胞外蛋白，可以根据相应蛋白质的性质进行提取分离纯化。
如果待提取的蛋白质是具有生物活性的蛋白质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化过程中需注意防止蛋白质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。
2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定的方法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯氏定氮法等。
3、凯氏定氮生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。
生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。
凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。
其原理如下：（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。
为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。
这一步约需2〜3h,视样品的性质而定。
天然的含氮有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水；蛋白质分解,而有机氮则变成氨（无机氮）, 并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
此时程称之为“ 消化”。
但是,这个反应进行得比较缓慢,通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点, 并加入硫酸铜作为催化剂, 以促进反应的进行。
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5、计算
c为标准盐酸溶液摩尔浓度(0.0098M)；
V1为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mL数； V2为滴定空白液用去的盐酸溶液mL数；
w为样品重量(1g)。
14为氮的相对量子质量。
消化液总量500ml, 蒸馏时消化液用量3ml
样品蛋白质含量(％)=总氮量×6.25
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注意事项
• 冷凝水的开、关 • 自由夹：中间 • 酒精灯：加到2/3，防止燃烧中途不够 • 蒸汽发生器中：水到瓶颈凹陷处 • 火焰
实验二 蛋白质含量的测定―凯氏定氮法
一 目的： • 学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理 • 掌握蒸馏、滴定操作技术
三聚氰胺 C3N6H6
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“蛋白精”
二、原理：蛋白质含N量约为16％，测出含氮量推知蛋白含量
。
消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮-
--硫酸铵。添加硫酸铜和硫酸钾的混合物，前者为催化剂 ，后者提高硫酸沸点。
•
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蒸馏吸收
• 准备: – 取50 mL锥形瓶3个，各加入5 mL 硼酸溶液和1滴指示剂，溶液呈淡紫色，表面皿 覆盖备用。 – 关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将锥形瓶放在冷凝器下， 冷凝器下端浸没在液体内。
• 加样:
– 移液管取3 mL消化液（空白液和样品消化液分别做），加入反应室，用小量筒
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mg，消化液5 mL。3及4号瓶中各加相 加样时应直接送人瓶底，不 同量的催化剂和消化液-----对照，以测 要沾在瓶口和瓶颈上。
定试剂中可能含有的微量含氮物质。
消化开始时应控制火力，不使液体
冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开
始分解并放出SO2白烟后，适当加强火 力消化，直至消化液呈透明淡绿色。
• 定容：冷却后，加蒸馏水(慢加，随加 随摇)。将瓶中液体倾入50 mL或100 mL容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次， 洗液并入容量瓶，定容。
滴定：标准HCl滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度
为止，根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩 尔数)，计算出样品中的总氮量。
NH42B02O02/1+1/1H4Cl → HBO2+NH4Cl
滴定
• 取凯氏烧瓶 标号。各加几颗玻璃珠; • 1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂200
2、消化
– 小心照看，防止反应液喷出 – 防止烧到橡胶管
• 冷凝管末端不用时防在干净的烧杯中，防止NaOH污 染
• 空白：蒸10分钟未变色，再蒸3分钟 • 铁架台：夹子口朝上
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思考题
• 1、何谓消化？如何判断消化终点？ 2、在实验中加入粉末硫酸钾―硫酸铜混合物的作用是什么？ 3、固体样品为什么要烘干？ 4、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？ 5、如何证明蒸馏器洗涤干净？ 6、本实验应如何避免误差？
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4、滴定
• 全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量， 硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。
• 注意：使用前检查酸式滴定管漏不漏？止滴定过头！
•
及时记录读数
• 要求：空白液1次，样品消化液2次
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• 总氮量 (％) =
加NaOH溶液5mL，关闭自由夹，少量水封口。 • 蒸馏:
– 关闭自由夹，打开冷凝水。 – 点燃酒精灯，蒸馏开始，锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时(约2-3分钟)开始计时，蒸
馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，继续蒸馏1分钟，取下锥 形瓶，表面皿覆盖。 – 蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。 重复3次。最后将自由夹同时 打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。
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3、蒸馏吸收： 改进型凯氏定氮仪
• 特点：将蒸汽发生器、蒸 馏器和冷凝器组成一个整 体，体积小，安装容易， 操作简便。 1)水蒸汽发生器和反应室 2)冷凝器和通气室 3)排水柱
• 关键：搞清水管系统
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蒸馏器的洗涤
• １.接通冷凝水，向蒸汽发生器中加入 一定量的水(以排水口高度为宜)，酒 精灯加热烧开。
CH2NH2COOH+3H2SO4
2CO2+3SO2十4H2O十NH3
2NH3+H2SO4
(NH4)2SO4
蒸馏吸收：浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，
借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸氨后使溶
液中的氢离子浓度降低，指示剂变色
消化 蒸馏、吸收
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2H2O + 2NH3↑ NH3 + HBO2→ NH4BO2 （H3BO3 → HBO2 + H2O）
• ２.水的自动喷出： – 将蒸馏水从加样室加入反应室 – 将酒精灯移开片刻，反应室内水 自动喷出到蒸汽发生器 – 打开蒸汽发生器出水口，放水。 – 如此反复清洗3-5次。
• ３.清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛 有5 mL，2％硼酸溶液和1～2滴指示 剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装 置内部已洗涤干净。