实验四 凯氏定氮法测定蛋白质含量
蛋白质含量测定(凯氏定氮法)
食品中蛋白质含量测定(凯氏定氮法）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。
二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。
食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。
因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。
三、仪器与试剂硫酸铜(CuSO4·5H20）硫酸钾硫酸（密度为1.8419g/L）硼酸溶液（20g/L）氢氧化钠溶液（400g/L）0。
01mol/L盐酸标准滴定溶液.混合指示试剂：0。
1%甲基红乙溶液液1份，与0。
1％溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合. 微量定氮蒸馏装置:如图3-所示。
图3-微量凯氏定氮装置1、电炉；2、水蒸气发生器(2L平底烧瓶)；3、螺旋夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处)；5、反应室；6、反应室外层;7、橡皮管及螺旋夹b;8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶.四、实验步骤1、样品消化称取样品约2.00g(±0.001g),移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g 硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热,待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0。
5h,取下放冷，小心加20mL水,放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。
试剂空白实验:取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。
2、定氮装置的检查与洗涤检查微量定氮装置是否装好。
在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性,加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸.测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a ，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b 由橡皮管排出,如此数次，即可使用.3、碱化蒸馏量取硼酸试剂20mL 于三角瓶中，加入混合指示剂2~3滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a 关闭,螺旋夹b 开启的状态下，准确吸取10。
凯氏定氮法实验报告
凯氏定氮法实验总结题目：蛋白质浓度测定（微量凯氏定氮法）姓名：穆拉地力·地力夏提学号：074031141一、【实验目的】1. 掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法2. 学会使用凯氏定氮仪并学会用凯氏定氮仪测出小油馕中的蛋白质含量二、【实验原理】凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。
为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，硫酸铜起催化剂的作用。
使用时常加入少量过氧化氢作为氧化剂以加速有机物氧化。
消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。
滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。
在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。
测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。
以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4 =2C02+3SO2+4H2O+NH3（1）2NH3 +H2SO4 = (NH4)2SO4 （2）(NH4)2SO4+2NaOH=2H2O+Na2SO4+2NH3 （3）反应（1），（2）在凯氏烧瓶内完成，反应（3）凯氏蒸馏烧瓶中进行（图1）。
蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量（约在14％~18％，平均为16％）。
凯氏定氮法测定出的含氮量，再乘以系数6.25，即为蛋白质含量。
三、【试验器材】1. 凯氏定氮仪2. 电炉3. 消化架4. 锥形瓶100ml（×5）5. 量筒10ml(×1)6. 滴定管（5ml，可读至0.02ml）7. 凯氏烧瓶（×2）8. 玻璃珠9. 吸耳球10．移液管（2ml，5ml，10ml×1）四、【实验试剂】1. 浓硫酸（A.R.）2. 硫酸钾-硫酸铜混合物：硫酸钾3份与硫酸铜1份混合研磨成粉末。
蛋白质测定凯氏定氮法
同时做试剂 空白试验
冷却 加20mL水 冷却
至蓝绿色澄清透明 继续加热0.5～1h
2、蒸馏、吸收
仪器及试剂的准备 仪器：
100mL 3只
试剂（混合指示剂）： 2份甲基红乙醇液（1g/L）与1份亚甲基蓝乙醇液（1g/L）
临用时混合。指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈 灰色,在酸性溶液中呈红色。
蒸馏及吸收
10.0mL硼酸溶液→100mL三角瓶→加1～2滴混合指示剂 冷凝管下端插入三角瓶液面下→准确吸取10mL试样→由 小玻杯流入反应室→少量水洗涤小漏斗→盖紧玻璃塞→ 量筒取10.0mLNaOH溶液→倒入小玻杯→提起玻塞使其缓 慢流入反应室→立即塞紧玻璃塞→加水于小玻杯防漏气 通蒸汽→颜色变化时开始计时蒸馏5min →移动接受瓶使 液面离开冷凝管下端→再蒸馏1min →用少量水冲洗冷凝 管下端外部→取下接收瓶
注意：此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生 物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物， 故称为粗pro。
【三、实验步骤】
1、消化
仪器及试剂的准备
仪器：
试剂
作用
硫酸铜 硫酸钾
a催化作用：加速有机物的氧化分解。 b消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明； c蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑色沉淀
④ 在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得 停火断汽,否则会发生倒吸。
⑤ 蒸馏完毕后，先将冷凝管下端离开液面，再蒸1分钟， 将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收 瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸 收液将发生倒吸。
⑥所用的试剂溶液 必须用无氨蒸馏水配制。
3、盐酸滴定
接收瓶 以HCL标准滴定液滴定
【一、实验目的】
简述凯氏定氮法测定蛋白质的步骤
简述凯氏定氮法测定蛋白质的步骤
凯氏定氮法(Kjeldahl法)指的是用硫酸和氨水解液在催化剂的作用下将原料中蛋白质氮转化为氨，并把氨催化时形成的氢气反应吸收后，再以酸-碱滴定法滴定
氨气含量，从而计算出蛋白质氮含量，这种方法就是凯氏定氮法测定蛋白质的步骤。
凯氏定氮法测定蛋白质的步骤如下：
一、样品制备：将取得的样品(乳品、肉品或是其他类型的食物)分割、切碎成
相对细小的粉末，并确保碎片充足或浸入，然后将样品制成稀疏的悬浮液。
二、催化：将处理后的悬浮液放入定氮瓶中，使用有机催化剂，如甲酸钠、钠
邻苯二甲酸、钠邻苯三甲酸等，催化后的悬浮液中的蛋白质被氧化，形成氨气和水溶性的有机化合物。
三、氨气吸收：将催化后的悬浮液加入硫酸，使悬浮液放入高温循环气流，温
度由110℃升高至200℃，然后将催化后的悬浮液中的氨气吸收到硫酸中，使样品
中的氨气进入硫酸中，形成硫酸氨溶液。
四、滴定：将硫酸氨溶液滴定，可以使用酸性和碱性滴定，将硫酸氨溶液与
0.1mol/L的NaOH或HCl滴定，当滴定结束时，酸性滴定液变蓝色，而碱性滴定液
变红色，可以通过比较颜色的深度计算出氨气的浓度
五、计算：根据计量表可以计算出每升催化液中氨气含量，从而得出样品中蛋
白质的氮量。
总之，凯氏定氮法能够有效地测定蛋白质的氮量，是国际上最为普遍使用的蛋
白质分析方法。
岁的定氮法的步骤一般都是相同的，但是根据具体实验的不同，可能会有部分小的差别，而且我们在催化剂的选择上也需要多加慎重、针对性的考虑，以达到理想的测试效果。
凯氏定氮[精彩]
![凯氏定氮[精彩]](https://img.taocdn.com/s3/m/0981fb17a7c30c22590102020740be1e650ecce5.png)
凯氏定氮实验报告一实验目的1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术和凯氏定氮仪的使用方法。
二实验原理蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。
这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。
此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。
由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25g蛋白质。
所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以6.25，就可以计算出样品中的蛋白质含量。
这种测定方法就叫做凯氏定氮法，也称克氏定氮。
凯氏(Kjeldahl)定氮法常用于测定天然有机物(如蛋白质，核酸及氮基酸等)的含氮量生物样品中的含氮量可用以下反应来测定：消化：样品与浓硫酸共热时，浓硫酸是有机物脱水，其中的碳、氢二元素被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质分解出的氨进一步与硫酸作用生成硫酸铵，反应式如下：有机物（C、H、O、N、P、S）+浓H2SO4 （NH4）2SO4 +CO2 + SO2 + H3PO4此消化反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，加速有机物分解，反应式如下：K2SO4 + H2SO4 = 2KHSO42KHSO4 = K2SO4 + H2O + SO32CuSO4Cu2SO4 + SO2 + O2Cu2SO4 + 2H2SO4 2CuSO4 + 2H2O + SO2样品消化后，要使其中硫酸铵中的氨游离出来，浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，可借助水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量及一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中的氢离子浓度降低；然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数(相当于待测物中氨的当量数)即可计算出待测样品中的氮含量。
凯氏定氮法实验报告
一、实验目的1. 掌握凯氏定氮法的原理和操作技术；2. 学习使用凯氏定氮仪进行蛋白质含量测定；3. 熟悉标准溶液的配制和滴定操作。
二、实验原理凯氏定氮法是一种测定有机化合物中氮含量的经典方法。
其原理是将有机化合物中的氮转化为无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨气，通过蒸馏将氨气收集到硼酸溶液中，最后用盐酸标准溶液滴定，计算出氮含量。
蛋白质是一种含氮化合物，其氮含量几乎恒定在15%~16%之间。
因此，通过测定样品中的氮含量，可以计算出样品中的蛋白质含量。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：凯氏定氮仪、电炉、锥形瓶、滴定管、移液管、分析天平等；2. 试剂：浓硫酸、30%氢氧化钠溶液、克氏催化剂、2%硼酸、指示剂、0.1mol/L 盐酸标准溶液、待测样品等。
四、实验步骤1. 样品预处理：准确称取待测样品0.5g左右，置于凯氏烧瓶中；2. 消化：向凯氏烧瓶中加入约10ml浓硫酸，加入少量克氏催化剂，加热至沸腾，保持沸腾状态，直至样品完全消化，溶液呈蓝绿色；3. 蒸馏：将消化后的溶液转移到锥形瓶中，加入约20ml 40%氢氧化钠溶液，连接凯氏定氮仪，加热蒸馏，使氨气进入硼酸溶液中；4. 吸收与滴定：待蒸馏完成后，用移液管将硼酸溶液转移至滴定管中，加入少量指示剂，用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定，直至溶液颜色由蓝紫色变为红色；5. 计算结果：根据滴定消耗的盐酸标准溶液体积，计算出样品中的氮含量，进而计算出蛋白质含量。
五、实验数据与结果1. 样品A：蛋白质含量为5.2g/100g；2. 样品B：蛋白质含量为8.3g/100g；3. 样品C：蛋白质含量为4.0g/100g。
六、实验讨论1. 凯氏定氮法是一种准确、可靠、操作简便的蛋白质含量测定方法；2. 实验过程中，消化阶段是关键步骤，需要控制好温度和时间，以确保样品完全消化；3. 蒸馏阶段要保证氨气完全收集，避免影响测定结果；4. 滴定阶段要准确控制滴定终点，避免误差。
实验四 生物物质含氮量的测定
实验四生物物质含氮量的测定——微量凯氏定氮法一、目的1、了解微量凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理。
2、掌握本试验的操作步骤。
二、原理生物材料中含有许多含氮的有机物,如蛋白质、核酸、氨基酸等，故含氮量的测定在生化研究中十分重要。
知道了含氮量，就可推知蛋白质量，还可以根据N/P比值的高低检验核酸纯度。
本法适于测定0.2～2.0毫克的氮。
有机物与浓硫酸共热,有机物转变为无机氮（氨），氨与硫酸作用生成硫酸铵,后者与强碱作用释放出氨,借蒸汽将氨蒸至硫酸液中和的浓度，即可计算出样品的含氮量。
本实验用直接法来判断中和程度。
用硼酸作为氨的吸收溶液，结果使溶液中氢离子降低，混合指示剂(pH4.3～pH5.4)由黑紫色变成绿色。
再用标准酸来滴定,使硼酸恢复到原来的氢离子的浓度为止,指示剂出现淡紫色终点,此时所耗的盐酸量为氨的量。
NH3+H3BO4 —→ NH4H2BO4NH4H2BO4+HCl —→ NH4Cl+H3BO4为了加速消化，可加入CuSO4作催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高溶液的沸点。
此外硒汞混合物或钼酸钠可作为催化剂，且缩短作用时间，H2O2也可加速反应。
三、试剂和器材1、试剂的配制（1）样液 5g蛋清溶于0.9% NaCl液,并以生理盐水稀释至100ml。
如有不溶物，离心取上清备用。
（2）30% 氢氧化钠溶液 30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml。
（3）2% 硼酸溶液 2g 硼酸溶于蒸馏水，定容至100ml。
（4）混合指示剂 0.1%甲基红酒精溶液和0.1%甲烯蓝酒精溶液按4：1比例（V/V）混合。
本指示剂在pH5.2时为紫红色，pH5.4时为暗蓝(或灰色)色，pH5.6（与原理不吻合）时为绿色，变色点pI为5.4。
（5）1mol/L标准盐酸溶液2、材料硫酸（A.R.）、硫酸钾：硫酸铜=3：1（W：W）混匀研成粉末、凯氏定氮管、凯氏定氮仪两套。
四、操作1、消化取6支凯氏定氮管编号，3支加1.0ml蒸馏水作为空白对照，另3支各加1.0ml 鸡蛋清样液。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
1、按图装好凯氏定氮装置。向蒸汽发生器中的水中 加数滴甲基红指示剂、几滴H2SO4及数粒沸石
2、移取10.0ml样品消化液，经进样口注入反应室内，用 少量水冲洗进样口，然后加入10ml 50% NaOH溶液于反 应室内，塞好玻璃塞，防止氨的逸出。从开始回流记时， 蒸馏4min，移动冷凝管下口使其离开接收液面。再蒸馏， 用纯水洗冷凝管下口，洗液流入吸收液内。 三、NH3的标定 用0.05mol.L-1HCl标准溶液滴定至暗红色为终点。 四、蛋白质含量的计算 蛋白质（%）=总氮量（%）×6.25
反应式为： H2SO4==SO2+H2O+[O]
R. CH.COOH+[O]==R.CO.COOH+NH3 NH3 R.CO.COOH+[O]==nCO2+mH2O
3 2 4 4 2 ，收集于 4 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出 NH H3BO3 溶液 3 中。
2NH +H SO ==(NH ) SO
2008年当奥运圣火熄灭以后，我国各地的新闻版 面相继都在大篇幅的报道关于“大头娃娃”的新 闻。 根据医院的诊断，这些婴儿所患的都是营养不良 综合征，而扼杀这些幼小生命的“元凶”，正是 蛋白质等营养元素指标严重低于国家标准的劣质 婴儿奶粉。
导致“大头娃娃”出现的一个原因就是我们 在食品蛋白质检验过程中存在的问题：通常 我们利用凯氏定氮法测定食品中的氮含量， 再利用以下公式计算出食品中的蛋白质含量
四．解决凯氏定氮法弊端
解决问题的根本方法，是直接测试食品中的真蛋白
质含量。因为，如果能够一次直接测定食品中真蛋白质含 量，以真蛋白质含量为标准，那么就堵住了市场监管上的 漏洞，使伪劣产品无所遁形。因此添加假蛋白质物质，如
凯氏定氮法测定蛋白质原理及操作
一、概述蛋白质是生命活动中不可或缺的重要物质，其含量的测定在生物化学研究和食品加工领域具有重要意义。
针对蛋白质含量的测定方法有许多种，其中凯氏定氮法是一种经典且常用的测定方法，本文将就凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作进行详细介绍。
二、凯氏定氮法原理1. 基本原理凯氏定氮法是通过测定样品中氨基氮的含量来间接测定蛋白质含量的方法。
蛋白质是由氨基酸构成的，而氨基酸中含有氮元素，故可以通过测定样品中氮元素的含量来推算出样品中蛋白质的含量。
2. 操作步骤（1）样品的预处理：将待测样品进行适当的预处理，通常是将样品中的有机物燃烧成气体，从而将其中的氮元素转化为氮气。
（2）氮气的收集：收集样品燃烧产生的氮气，通常是通过化学吸收剂的吸收来将氮气纯化。
（3）氮气的测定：将纯化后的氮气进行定量测定，得出氮气的含量。
（4）蛋白质含量的计算：根据氮气的含量，通过一定的计算公式来推算出样品中蛋白质的含量。
三、凯氏定氮法操作注意事项1. 样品的选择选择代表性好的样品进行测定，避免样品中含有其他干扰物质，影响测定结果的准确性。
2. 仪器的使用严格按照仪器的操作说明进行操作，保证测定过程的准确性和精确度。
3. 数据的处理对测定得到的数据进行严格的处理，计算过程中不应出现错误，以确保蛋白质含量的测定结果准确可靠。
四、凯氏定氮法测定蛋白质的优缺点1. 优点（1）测定范围广：凯氏定氮法可以适用于各种类型的样品，包括食品、饲料、生物组织等。
（2）测定结果可靠：经过严格的样品预处理和操作步骤，测定结果具有较高的准确性和精确度。
2. 缺点（1）操作繁琐：凯氏定氮法的操作步骤相对繁琐，需要较长的操作时间。
（2）不适用于含氮杂质的样品：如果样品中含有其他氮元素化合物的干扰物质，则可能影响凯氏定氮法的测定结果。
五、结语凯氏定氮法作为一种经典且常用的蛋白质测定方法，其原理和操作步骤相对简单明了，但需要严格遵守操作规范，以确保测定结果的准确性和可靠性。
凯式定氮
实验四蛋白质含量的测定――微量凯氏定氮法一、试验原理蛋白质是生命存在的物质基础，生物机体的存在、代谢生长都需要蛋白质。
人体的蛋白质来源无不依赖于所摄取的食物，通过对食物中蛋白质、氨基酸等成分的消化合成，来满足机体对蛋白质的需要。
因此，蛋白质是标志食品营养值的首要成分。
对蛋白质的测定是营养成分分析的主要指标，也是对食品质量及其等级评估的重要依据。
食品中蛋白质含量测定的方法主要有：利用物理特性进行的折射率法、紫外吸收法、旋光法；利用化学特性进行的凯氏定氮法、双缩脲法、Folin－酚试剂法及染色法。
本实验采用微量凯氏定氮法。
用浓硫酸使食品有机物中氮转化为硫酸铵，然后加氢氧化钠，蒸馏使氨逸出，通入硼酸溶液中吸收，生成四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿混合指示剂，用盐酸标准溶液滴定，即可计算出样品中的含氮量。
因硫酸作用甚缓，需加硫酸铜作为催化剂，并加硫酸钾以提高溶液之沸点。
蛋白质是由氨基酸所组成，含有C、H、O及一定量的N和少量的S，所有这些元素在蛋白质中都有一定的比例，其平均值（百分比）是碳为50.6-54.6；氢为6.5-7.3；氧为21.5-23.5；氮为15.0-17.6；硫为0.3-2.5。
由于蛋白质是含有一定氮的化合物，所以可通过测定食品中的含氮量来计算蛋白质含量。
蛋白质中氮的含量平均为16%（100/16=6.25），将分析所得的含氮量乘以6.25，即可计算出蛋白质的含量。
样品测定需经过四个步骤：消化蒸馏吸收滴定各反应方程式如下：a.消化反应：b.蒸馏：(NH 4)2SO 4+NaOH NH 3Na 2SO 4+NH CH C RO n +H 2SO 4CO 2SO 2H 2O (NH 4)2SO 4+++c.吸收：N H 3+H 3BO 3N H 3H 3BO 3d.滴定：H 3BO 3NH 3+HCL (标准)NH 4CL +H 3BO 3二、试剂与器材浓硫酸混合催化剂：0.4 g硫酸铜，6 g硫酸钾或硫酸钠，磨碎混匀。
6种方法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2)(NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。
食品专业生化四个实验
实验一凯氏(Micro—Kjeldahl)定氮法测定蛋白质含量一、实验目的学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
二、实验原理常用凯氏定氮法测定天然有机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮量。
含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢2元素被氧化成二氧化碳和水，而有机氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
此过程通常称为“消化”。
但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，加快有机物分解，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行，还具有作为消化终点和下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。
甘氨酸的消化过程可表示如下：消化：CH2NH2C00H + 3H2S02 — 2C02+ 3S02+ 4H20 + NH32NH3+H2S04 一 (NH4)2SO4蒸馏：(NH4)2SO4 + 2NaOH--- 2H2O +NaSO4 + 2NH3吸收：2NH3 + 4H3BO3 ---- (NH4)2B4O7 + 5H20滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H20----- 2 NH4Cl + 4H3BO3浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。
三、器材1．50 mL消化管或100 2．凯氏定氮蒸馏装置或改mL凯氏烧瓶进型凯氏定氮仪3．50 mL容量瓶4．3 mL微量滴定管5．分析天甲6．烘箱7．电炉8．1 000 mL蒸馏烧瓶9．小玻璃珠10．远红外消煮炉四、试剂1．消化液(过氧化氢：浓硫酸：水=3：2：1) 200mL2．粉末硫酸钾一硫酸铜混合物16gK2SO4与CuS04.5H20以3：1配比研磨混合。
3．30％氢氧化钠溶液1000mL4．2％硼酸溶液500mL5．标准盐酸溶液(约0．01 mol／L) 600mL6．混合指示剂(田氏指示剂) 50mL由50mL 0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL 0．1％甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。
蛋白质的测定实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质的测定原理和方法；2. 学会使用双缩脲试剂和凯氏定氮法测定蛋白质含量；3. 了解蛋白质在生物体中的重要作用。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的大分子化合物，是生物体的重要组成部分。
蛋白质的测定方法有很多，本实验主要介绍双缩脲试剂法和凯氏定氮法。
1. 双缩脲试剂法：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子反应，生成紫红色络合物。
根据络合物颜色的深浅，可以测定蛋白质的含量。
2. 凯氏定氮法：蛋白质分子中的氮含量相对稳定，约为16%。
通过测定样品中的氮含量，可以计算出蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋清、硫酸铵、氯化钠、双缩脲试剂、凯氏定氮试剂、蒸馏水、滴定管、试管、烧杯、电炉、天平等。
2. 仪器：双缩脲比色计、凯氏定氮仪、分析天平、移液管、滴定管、酒精灯等。
四、实验步骤1. 双缩脲试剂法测定蛋白质含量（1）取一定量的鸡蛋清溶液，加入双缩脲试剂，观察颜色变化。
（2）用双缩脲比色计测定吸光度。
（3）根据标准曲线计算蛋白质含量。
2. 凯氏定氮法测定蛋白质含量（1）取一定量的鸡蛋清溶液，加入硫酸铵和氯化钠，混匀。
（2）将混合液转移到凯氏烧瓶中，加入硫酸和硫酸铜，加热消化。
（3）将消化液转移到蒸馏瓶中，加入过氧化氢和氢氧化钠，进行蒸馏。
（4）收集蒸馏液，用滴定管滴定剩余的酸液。
（5）根据滴定结果计算氮含量，进而计算出蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 双缩脲试剂法测定蛋白质含量通过双缩脲比色计测定吸光度，得到蛋白质含量为x g/L。
2. 凯氏定氮法测定蛋白质含量通过滴定计算，得到氮含量为y g/L，进而计算出蛋白质含量为z g/L。
六、实验结论1. 通过双缩脲试剂法和凯氏定氮法，可以测定蛋白质含量。
2. 蛋白质在生物体中具有重要作用，是生命活动的基础。
3. 本实验操作简便，结果可靠，为蛋白质的测定提供了有效方法。
七、注意事项1. 在进行双缩脲试剂法测定时，应确保试剂的准确性，避免误差。
蛋白质的测定方法(剀氏定氮法)
蛋白质的测定方法（凯氏定氮法）一、原理有机物与硫酸共热，其中的氮转变为硫酸铵，然后测定氮量，然后乘以 6.25，即可得到有机物中粗蛋白含量。
二、试剂1.浓硫酸（98%、18mol/l）2.0.1N稀硫酸溶液：取浓硫酸（98%、18mol/l）2.8ml稀释，定容至1000ml。
3.40%氢氧化钠溶液4.0.1N标准氢氧化钠溶液：（1）配制：取氢氧化钠（分析纯）4克溶于蒸馏水中，定容至1000ml。
（2）标定：取配制的氢氧化钠溶液15ml、酚酞指示剂2-3滴，用0.1N的草酸溶液标定，至溶液变为无色时，记下耗用草酸溶液的量，换算成氢氧化钠的实际浓度，记录。
5．混合指示剂（亚甲基蓝+甲基红）：由2倍体积0.1%甲基红无水乙醇溶液与1倍体积0.1%亚甲基蓝水溶液混合而成。
（此指示剂碱性时呈绿色，中性时呈灰色，酸性时呈红色）。
6.混合催化剂：称取硫酸钾100克、硫酸铜10克、硒粉1克均匀混合后研细待用。
7.酚酞指示剂：溶酚酞1.000克于100ml95%乙醇中。
三、操作规程：Ⅰ.样品预处理：将待测物质烘至恒重（70℃条件下）、磨碎，再烘至恒重制成样品装如广口瓶保存于干燥器中以备测定。
Ⅱ.消化（1）取样：准确称取样品0.2000-0.3000克，装入50ml凯氏烧瓶中（将称量纸卷为圆筒状转入），同时加入浓硫酸6ml以及0.5克催化剂。
（2）将凯氏烧瓶放入通风橱中的消化炉，将炉温调至450℃开始消化，开始10分钟左右注意经常摇动凯氏烧瓶以防止样品经碳化变黑后产生的大量炮沫溅出。
注意不能让泡沫及黑色物质上升到烧瓶颈部）。
消化时间一般为5小时，消化完全后样品消化液呈淡蓝绿色。
（3）冷却消化液，将样品消化液无损地转入50ml容量瓶（注意要用蒸馏水把凯氏烧瓶冲洗干净3-4次，洗涤液也转入容量瓶），定容至50ml、摇匀，待测。
Ⅲ.蒸馏（凯氏蒸馏）（1）清洗装置：测定前用自来水冲洗反应室3次，然后空蒸1分钟，以备测定开始。
用凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量
２ 分析过 程
试样制备 ： 固体样品 ： 取有代表性的样品至少 ２ ０ ， ０ ｇ 用研
圉
新 疆 孳教 业
钵捣碎 、 研细 ； 易捣碎 、 细 的样 品应切 （ ） 不 研 剪 成细粒 ； 干固 体样 品用 粉碎机粉碎 ； 液体 样 品 ： 充分混匀 的液 体样 品至 取 少 ２ ０ 。粉状样品 ： ０ｇ 取有代 表性 的样 品至少 ２０ （ ｌ ０ ｇ ￣ 粉粒较 ／ ｌ 大也应用研钵 研细 ）混合 均匀 ； 状样 品： ， 糊 取有代 表性 的样 品至少 ２ ０ ， ０ ｇ混合均匀 ； 固液体样 品 ： 固、 按 液体 比例 ， 取有代
的蛋 白质 系数而求 出蛋 白质的含量 ， 此法 的结果称为粗蛋 白
实验 室常规仪器及下列各项 ： 凯 氏烧瓶 ：０ｒｌ可调式 电炉 ； 汽蒸馏装 置 ； 肉机 ： ５Ｏ ； ａ 蒸 绞
篦孔 径不超过 ｉ ｔ； ｎ 组织捣碎机 ； ｏ 粉碎机 ； 研钵 ： 玻璃或瓷质 ； 化学消化器 ； 氏定氮仪； 凯 空气滤过器。
转化为氨与硫 酸结合成硫酸铵 。 然后取消化液的 １ ０ ／ 加碱蒸 １ 馏 ， 氨 蒸 出 ， 硼酸 吸收后 再 以标 准盐 酸 或硫 酸溶 液滴 使 用 定四 。根据标 准酸 消耗量可计算 出蛋 白质的含量。包括消化、
蒸馏 、 吸收 、 滴定 ４ 个步骤。
１ ． 全量 凯 氏定 氮 法 ．２ ２
１２ 试 验 方 法 ．
１２ １ 微 量 凯 氏定 氮 法 ．．
质含量 ： 由于样品中含有少量非蛋 白质含氮化合物 ， 如核酸 、 生物碱 、 氮类脂 、 含 卟啉 以及含氮 色素等非蛋 白质的含氮化 合物． 氏定氮法是测定总有机氮量较为准确 、 作较为简单 凯 操
微量凯氏定氮法测定蛋白质含量实验报告
微量凯氏定氮法测定蛋白质含量实验报告实验背景：凯氏定氮法：测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
该方法在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由物质含氮量计算其蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
一、实验目的1、掌握凯氏（Kjeldahl）定氮法测定蛋白质含量的原理方法；2、学会使用凯式定氮仪。
二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。
凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。
消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接收瓶内，硼酸接收氨后，形成四硼酸铵，然后用盐酸标准溶液滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。
滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。
测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。
以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3（1）2NH3 +H2SO4→(NH4)2SO4（2）(NH4)2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3↑（3）三、实验器材和试剂1、实验器材：凯氏定氮蒸馏装置、50ml锥形瓶3个、酸式滴定管、酒精灯2、实验试剂：浓硫酸、30%氢氧化钠溶液、2%硼酸指示剂0.2M HCL四、实验步骤1、定氮仪的洗涤（1）测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子P3，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子P1由橡皮管排出，如此数次。
（2）用蒸汽洗涤反应室约10min后，在冷凝管末端小玻璃管的位置放上一个盛硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，将瓶倾斜，以保证冷凝管末端连接的小玻璃管完全浸于液体内。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1.有机物中的铵根在强热和催化剂及浓H2SO4作 用下，消化生成（NH4）2SO4，反应式为：
2NH2+H2S04+2H+＝(NH4)2S04
（其中CuSO4做催化剂）
2.在凯氏定氮仪器中与碱作用，通过蒸馏释放出 NH3，收集于H3BO3 溶液中，反应式为:
(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3↑+2H2O+Na2SO4
2.蒸馏
NaOH、H2O注入管口，用橡胶管套如后分别置于 NaOH、H2O盛器桶内，加液时按面板上相应开关， 液体经电磁泵自动流入消化管内，注入毫升数视 标尺所注位置而定。
蒸馏过程： （1）观察蒸发炉内水位，不能超过不锈钢电 极（如果超过，要先排完水）。
（2）关掉排水阀，打开加热电源，打开冷却 Байду номын сангаас（自来水开关），打开绿色蒸汽开关（只需 打开任意一组），然后，观察电流表；等电流 表升到4A左右，关掉蒸汽开关。待其回到0A后 再打开蒸汽开关。电流升到4A后再关掉，这样 反复开关（0-10）左右直到蒸汽从塑料管内喷 出，让其喷半分钟左右，关掉蒸汽开关，仪器 进入正常的待机状态。
测定范围：含氮在0.1～200mg 测定品种：粮食、饲料、食品、乳制品、饮料、 土壤、水、药物、沉淀物和化学品等。
加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为 催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。
混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液 中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴 甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。
【结果及计算】
按下列式子计算蛋白含量：
蛋白质X %＝ (V1 V2 ) N 0.014 F 100 m
式中： X—样品中蛋白质的含量，% V1—样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml； V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml； N—硫酸或盐酸标准溶液当量浓度； 0.014—1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数； m—样品的质量（体积），g（ml）； F—蛋白质系数，按16%计算乘以6.25即为蛋白质。
（3）250ml三角接收瓶中加入2% H3BO3 50ml和 2~3滴混合指示剂，将接收瓶套在蒸馏器的接收
管上，并且让管口浸没在H3BO3溶液中。
（4）把需要蒸馏的消化管固定在蒸馏器托物架 上，然后按面板上NaOH、H2O开关，分别向消 化管注入蒸馏水（10ml左右）及NaOH溶液（硫 酸用量的5倍,约100ml），然后开启蒸汽开关， 向试管内注入蒸汽、进行蒸馏。
实验一 凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法
是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。 即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有 机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵 盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收， 再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由 于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白 质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法
1.样品消化
称取适量样品（约相当氮30mg～40mg）,移入 干燥的消化管中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及 20ml浓硫酸，置于消化炉上小心加热， 待内容物 全部炭化，泡沫完全消失后，加大火力，并保持 管内液体内微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后， 再继续0.5h～1h。取下放冷待蒸馏用。
（建议：消化炉温控时间及温度：1阶段选择 温度范围280℃左右，时间为20分钟左右； 2阶段 选择温度范围450℃左右，待颜色变蓝绿色后继续 加热0.5h～1h。
2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O
3. 用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCl消耗的 量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算系数，即得 蛋白质的含量，反应式为：
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3
【操作步骤】
基本步骤如下：取样→消化→蒸馏→滴定→计算
【目的】
了解凯氏定氮法测定蛋白质含量的方法、意 义及应用
【原理】
蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫 酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解 的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨 游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根 据酸的消耗量计算出氮的含量，然后乘以相应的 换算系数，即得蛋白质的含量。
待接收瓶内液面高于150ml时将接收瓶下移， 使接收管离开液面、用少量H2O冲洗出气口，继 续蒸馏半分钟，然后取下接收瓶，待滴定用。
甲基红乙醇溶液和溴甲酚绿乙醇配溶液指 示剂，颜色由酒红色变成绿色。
3. 滴定
用0.05mol/LHCl滴定接收瓶内的溶液，滴定至 (暗)灰色时为止，记下消耗HCL的毫升数。