检定菌种传代记录
菌种传代记录
菌种名称
菌种代数
传代传代次数
传代数量
传代人
传代结束日期
保存温度
培养时间（小时）
传代步骤：
1、在无菌条件下，将经复活后的菌种置于洁净工作台面。
2、点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作。
3、灼烧接种环，环进入试管的部分，在通过火焰灼烧。灼烧时，把环置于酒精灯的外焰上，灼烧完毕将环稍冷片刻再进行操作。
7、先将灼烧过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，如有熔印则表明接种环未冷却，能烫死细菌。一定待冷后，再从斜面上挑取菌苔少许。取出时接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管，在斜面上轻轻划线接种。划线时先由下而上划一直线后，再由下而上划曲线。操作过程应迅速，勿使菌苔沾至管壁或管口。
8、当接种完毕，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁塞上棉塞，不要将管口离开火焰旁去迎接右手的棉塞。最后将接种环灼烧灭菌放置原处，再把可能未塞紧的棉塞塞紧，即可进行培养。
9、每支菌种需标明菌株编号、传代次数、菌种名称、接种日期、有效期、接种人。
10、将接种好的培养基放置培养箱中（按照菌种说明书所规定的时间和温度要求培养），观察菌种生长情况。
传代管编号：________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
4、菌种管与接种管持在左手，菌种管在前，接种管在后。应斜持试管呈45°角，使试管斜面向上。
5、以右手在火焰旁转动两管的棉塞，以便接种易于拔取。再以右手持接种环的柄端，把接种环在火焰上烧灼。顶端的环必须烧红，以彻底灭菌。
菌种记录表格
操作人
数量
编号
有效期
保存
方法
数量
编号
有效期
保存
方法
分离与纯化过程
附表3：《检定菌种使用登记台账》
记录名称
检定菌种保存、领用登记台账
代码
页次
1
共1页
收到日期
名称及编号
数量
接收人
移交人
领用日期
用途
数量
发放人
领用人
附表4：《检定菌种观察记录》
记录名称
检定菌种观察记录
代码
页次
1
共1页
日期
冰箱温度（℃）
塞子是否松动
是否霉变
处理措施
观察人
附表5：《检定菌种鉴定记录》
记录名称
检定菌种鉴定记录
代码
页次
1
共1页
菌种名称及编号
鉴定原因
开始鉴定日期
鉴定人
复核人
年月日
鉴定项目
菌落形态
革兰染色
显微镜下形态
典型生化反应特征
鉴定结论
日期：年月日
附表6：《检定菌种使用登记台账》
记录名称
检定菌种使用登记台账
代码
页次
1
共1页
领用日期
名称及编号
数量
使用人
制备菌悬液浓度
(CFU/ml)
用于检验的
产品批号
记录名称
废弃菌种（物品）销毁处理记录
代码
页次
1
共1页
日期
被处理菌种（物品）名称
销毁原因
处理方式
批准人
操作人
监督人
备注：废弃菌种要标明编号、数量（支）
实用标准菌种管理系统规程
标准菌种管理规程目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
职责：QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发，微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。
内容：1 术语标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
2.标准：2.1检定菌的申购QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。
2.2检定菌的接收菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并储存于2-8˚C直到需要使用时。
储存期最长不超过5年。
2.3 检定菌的保存2.3.1 工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1个月；酵母菌：2个月；霉菌及芽胞：3个月。
检定菌的管理规程
检定菌的管理规程一、目的：建立检定菌的管理规程，规范使用检定菌。
二、适用范围：本标准适用于质保部QC室的检验过程中三、责任人：QC人员。
四、监督执行人：QC主任。
五、内容：1、检定菌的验收1.1从药检所购买回检定菌种后，立即由QC检验员验收。
1.2 检定菌种购买回后，保管人员应仔细检查，检定菌种名称和代码应与购买计划单相符，检定菌种的容器应完好、无破损及裂纹，符合要求时方能入库领用。
1.3填写检定菌种领用保存管理记录。
记录内容应包括：检定菌种名称、数量、检定菌种编号、购买单位、贮存条件、领用时间等。
2、检定菌种的保存保存的检定菌种必须具备相关细的历史及有关资料。
这些资料应包括：名称及编号、购入日期、形态特征、最适宜培养条件、保存方法、贮存条件和保存地点等。
2.1常用保存法：将检定菌种按规定间隔时间接种在规定的培养基中，按规定的培养条件（温度和时间）培养后，再于普通冰箱中继续保存。
检定菌种保存条件与转种间隔时间2.2转种并培养好的检定菌种，应在容器外加贴标签，注明检定菌种名称、检定菌种编码（或代码）、转种日期、传代次数等。
我公司购进的检定菌种，传代次数，最多五代。
2.3检定菌种转种时须核对编码、传代次数、传代日期、所用培养基；培养好后应再与原种的编码、名称核对，检查培养特征无误后时方可继续保存并记录。
每次转种传代一般7支，选第1支做传下代用，其余6支供试验用，试验前分别将6支供试验用菌种稀释到所需浓度（50～100cfu/ml），连续使用10～11天后销毁。
2.4每日检查保存菌种的冰箱温度，检查菌种管（瓶）的瓶塞是否松动、生霉，如有异常应及时处理，并记录。
2.5购进菌种编号若购进时有编号，延用原编号前加菌种名称的前两位汉字拼音字母，若无，用购进日期代替（例：2004年1月15日购进的无编号大肠埃希菌菌种，自编号为DC040115）2.6传代编号规定：传代编号包括原菌种号－传代次数－本次传代支数顺序号，例：DC040115第1次传代的第3支，编号为DC040115-1-3。
细菌传代操作规程
细菌传代操作规程细菌传代操作规程引言：细菌传代是一种实验室技术，用于研究细菌在连续传代中的生物学特性和遗传变异。
正确的传代操作是维持细菌群体稳定且准确反映遗传特性的关键。
为了保证传代操作的成功和规范性，制定相关的操作规程是必要的。
一、实验前准备：1. 确定传代实验的目标和方案。
2. 准备所需的培养基、试剂和实验器材。
3. 检查实验器材的清洁和消毒情况，保证无污染。
二、细菌传代操作步骤：1. 第一代接种：a. 从冷冻细菌库中取出所需的细菌母种，转接到含有适当培养基的培养皿中。
b. 用接种环或接种针沾取适量的细菌悬液，均匀涂布在培养皿的表面。
c. 恒温培养箱中培养，温度和时间根据不同的菌株而定。
2. 后续代接种：a. 从前一代的培养皿中取适量的细菌悬液，转接到新的培养皿中。
注意保持接种量的一致性。
b. 重复上述步骤，逐代传代。
三、传代操作注意事项：1. 操作均需在无菌工作台或无菌条件下进行，以避免外源性污染。
2. 接种时避免直接接触培养基和装置内壁，以减少细菌的外源污染。
3. 接种环或接种针在使用前需经过高温炉高温灼烧，以杀灭潜在的细菌。
4. 尽量避免细菌的暴露在空气中的时间过长，以保证其活力。
5. 传代时应注意接种量的一致性，以减少菌群的变异。
四、细菌传代操作记录：1. 每次操作均需详细记录传代实验的日期、细菌菌株、传代代数等信息。
2. 记录每次传代的细菌生长情况，如菌落形态、数量等。
3. 定期保存样品用于后续的分析和验证。
五、实验后处理：1. 做好实验区域的清理和消毒，防止细菌污染蔓延。
2. 注射器、接种环和接种针等实验器材彻底清洗和高温灼烧。
3. 储存冷冻细菌库中的细菌母种。
六、应急措施：1. 若在实验过程中出现异常情况，如培养皿内出现异常菌落、污染等，应立即停止传代操作，并采取必要的消毒措施。
2. 若实验结果与预期不符，可重新设计实验方案或检查实验操作是否存在问题。
结语：细菌传代操作规程旨在规范实验操作过程，确保细菌传代的准确性和连续性。
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程
菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。
3、定义➢标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
➢传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
➢工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
➢菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
4、职责4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。
4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
5、规程5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。
5.2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。
5.3菌种的保存5.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
保存时间根据菌种种类而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。
菌种传代、接受和使用记录
菌种名称：
□Staphylococcus aureus /S.a/金黄色葡萄球菌□Escherichia coli /E.c/大肠埃希氏杆菌□Pseudomonas aeruginosa /P.a/铜绿假单胞菌□Bacillus subtilis /B.s/枯草芽孢杆
□Clostridium sporogenes /C.s/生孢梭菌□Candida albicans /C.a/白色念珠菌□Aspergillus niger /A.n/黑曲霉菌
菌种编号：
、、、
、、、
、、、
□传代菌种□工作菌种
保存条件：
传代所用菌种编号：
传代人/日期：
复核人/日期：
培养基/批号：
培养温度
□30-35℃
□20-25℃
培养时间：
□h
□d
传代数量：支
编号：
编号：
传代所用菌种编号：
传代人/日期：
复核人/日期：
培养基/批号：
培养温度
□30-35℃
□20-25℃
培养时间：
保存温度
有效期
复核人/日期
使用人/日期
用途
复核人/日期
备注
□ -20 ℃ □ 2-8 ℃
□ -20 ℃ □ 2-8 ℃
□ -20 ℃ □ 2-8 ℃
□ -20 ℃ □ 2-8 ℃
□ -20 ℃ □ 2-8 ℃
□ -20 ℃ □ 2-8 ℃
工作菌种接受和使用登记
菌种名称：
□Staphylococcus aureus/S.a/金黄色葡萄球菌□Escherichia coli/E.c/大肠埃希氏杆菌□Pseudomonas aeruginosa/P.a/铜绿假单胞菌□Bacillus subtilis/B.s/枯草芽孢杆
检定菌种接收、传代记录(附表1-7)
用途 用于 20220301 批次产品初始污 染菌阳性对照菌 用于洁净区环境监测沉降菌阳 性对照菌 用于菌悬液的制备
文件编号：
废弃菌种（物品）销毁记录
日期 被处理菌种（物品）名 销毁原因 处理方式
销毁人 销毁监督人
备注：废弃菌种要标明编号、数量（支）
表码： 接收日期
名称
代号
编号
标准菌株库存记录 数量 代次
来源
检查情况 保存条件 接收人Biblioteka 备注：表码： 接收日期
名称
编号
检定菌种接收记录
数量 代次
来源
检查情况 保存条件 接收人
备注：
表码： 菌种名称
传代前菌种代次 传代前菌种状态
检定菌种传代记录
大肠埃希菌
0代 正常
菌种代号
传代前菌种保存方 法
传代数量
备注
表码： 日期
检定菌种观察记录
塞子是否
冰箱温度（℃）
是否染菌
松动
处理措施
记录人
文件编号： 菌种名称及编号
鉴定原因
菌落形态
检定菌种鉴定记录 开始鉴定日期
革兰氏染色
鉴定 项目
显微镜下形态
典型生化特征 鉴定结果：
备注：
操作人：
复核人：
文件编号： 领用日期 菌种名称
检定菌种使用登记台账
菌种编号
数量
使用人
CMCC(B)44102
冷藏＞-30℃ 1支
传代日期
2022.3.1
编号
E.c-G1-220301-01
传代用菌种
□工作用菌种
培养基信息 生产批号：
胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）
生产日期：
菌种传代操作规程2024版药典菌种传代
菌种传代操作规程2024版药典菌种传代
菌种传代操作规程2024版药典菌种传代将依照以下步骤进行：
1. 准备工作：确保操作台面和工具已经经过清洁和消毒处理，确保操作室内环境的无
菌状况。
准备所需的培养基、试管、移液器、平板等。
2. 菌种接种：将初代培养物中适量的菌液采用无菌的移液器转接到新的无菌培养基中，或将菌液均匀地刷在无菌平板上。
注意避免交叉污染。
3. 培养：将接种好的培养基或平板放置于恒温箱中，在适当的温度和湿度条件下培养
一定时间，以确保菌种生长繁殖。
4. 传代：在培养基的不同时间点上，将菌种取出进行传代。
传代时，选择菌落或液体
中适量的菌液接种到新的无菌培养基中，或刷在无菌平板上。
5. 观察和记录：观察传代后菌种的生长情况，如菌落形态、色素等，进行记录。
注意
观察菌种的纯度和无菌状态。
6. 储存：将传代后的菌种保存在适当的条件下，如冷冻保存或冷藏保存，以备后续使用。
7. 清理：完成菌种传代后，及时清理操作区域和工具，进行消毒处理，确保无菌状态。
以上操作规程为菌种传代的基本步骤，根据具体的实验目的和条件，还可以根据需要
进行相应的修改和调整。
GMP质量体系检定菌传代记录
GMP质量体系检定菌传代记录GMP（Good Manufacturing Practice）质量体系是一种合乎标准的制药生产管理体系，旨在确保药品的质量、安全和有效性。
在GMP质量体系中，对于菌传代记录的检定是非常重要的一个环节。
下面是一个关于GMP质量体系检定菌传代记录的示例，共计1200字以上。
1.菌种准备和菌株鉴定1.1选择合适的菌株作为菌种，并确保其完全符合产品标准要求。
1.2进行菌种的准备，包括培养基的制备、菌株接种等。
1.3对于新购的菌株，应进行鉴定和鉴定记录的保留。
2.1每一批菌传代都应有详细的记录，包括传代方法、传代时间、传代次数等。
2.2记录每次传代的起始菌株数量、培养基的配比和加料时间等信息。
2.3记录每次传代后的培养条件，如温度、湿度等。
2.4注意记录传代过程中的观察结果，如菌株的生长情况、菌落形态等。
3.菌株存储管理3.1定期对菌株进行冷冻保存，以确保菌株的长期稳定性和可用性。
3.2记录每次菌株的冷冻保存情况，如保存时间、保存温度等。
4.菌株使用及应用4.1对于每一次使用菌株进行实验或生产，需在记录中注明使用的菌株编号、存储位置等信息。
4.2记录每次使用菌株的数量、菌种起始数量等，以便于对菌株的使用情况进行追溯。
4.3记录每次使用菌株的实验目的、实验方法和实验结果等信息。
5.不合格菌株的处理5.1若发现菌株存在异常情况，如生长受阻、菌落变异等，应立即停止使用，并记录详细情况。
5.2对于不合格的菌株，应进行进一步的分析和实验，以确定问题的原因，同时记录处理过程和结果。
6.菌传代记录的存档和保存6.1菌传代记录应及时整理和分类，并进行存档，以便于日后查阅。
6.2存档的菌传代记录应包括传代的详细信息，记录的时间和创建人等。
6.3存档的菌传代记录需要进行定期的备份和保存，以防止信息的丢失或损坏。
以上内容是一个关于GMP质量体系检定菌传代记录的示例，涉及到菌种准备和菌株鉴定、菌株传代记录、菌株存储管理、菌株使用及应用、不合格菌株的处理以及菌传代记录的存档和保存等方面。
菌种的复苏传代及保存标准程序
菌种得复苏传代及保存标准程序目得:建立菌种得复苏、传代及保存标准程序、范围:适用于检定用菌种得复苏、传代及保存得操作、职责:质管部生物测定人员对本规程得实施负责。
内容:菌种得复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行、操作中使用过得滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡,试验结束后经1２1℃３0分钟高温灭菌处理。
１.菌种得复苏1.1冻干菌种得复苏检定用标准菌种,由中国药品生物制品检定所提供,为冷冻干燥菌种(0代)。
使用前需将其复苏。
1．１.１准备:①用具:灭菌1ｍl滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。
②培养基:根据菌种得性质选择合适得液体培养基(营养肉汤培养基或改良马丁培养基)、营养琼脂(或改良马丁琼脂)斜面数支。
③消毒液:7５%酒精、碘酒、0.1％新洁尔灭或84消毒液等。
1.１。
2操作:1。
1。
２.１将准备妥得冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台、1.1.2。
2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕,再７5％酒精棉擦净菌种管外壁,放在灭菌双碟内待干。
1.1。
2。
3点燃酒精灯,将菌种安瓿得封口一端在火焰上灼烧红热,用灭菌滴管吸取液体培养基少许,滴在灼热得菌种安瓿封口一端,使其骤冷而炸裂。
１．1.2.4取灭菌镊子,在火焰旁,将炸裂得管口打开后,把菌种安瓿放入灭菌双碟内。
1．1。
2、5另取一支灭菌滴管,在火焰旁吸取适用液体培养基少许,加至菌种管底部,将冻干菌搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,接种至液体培养基内、用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。
1.1。
2。
6将已接种得液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下(一般细菌在3０~35℃,真菌在23~28℃)培养24ｈ。
１。
1.2。
7 取出培养物(第1代),仔细观察菌苔形态、有无杂菌,必要时涂片、革兰氏染色镜检,若呈典型菌落即可应用。
如发现菌型不典型,可进行平板分离单菌落。
１、２为保证工作用菌株得传代次数不超过5代,并减少购买冻干菌种得次数,可在对冻干菌种复苏得同时制备部分菌悬液(第1代)冷冻保存,并将此冻存菌液复苏后得第２代培养物冻存保藏。
检定菌管理规程
检定菌管理规程1. 目的规范检定菌种的管理与使用程序，确保菌种的溯源性和稳定性，保证微生物限度检查的结果准确可靠，保证检验人员的安全。
2.范围检定菌的申购、接收、保存、传代、使用与销毁等。
3.术语或定义3.1标准菌株：来自认可的国内或国外菌种保藏机构，其复苏、复壮或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。
3.2 标准储备菌株：从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
3.3 工作菌株：是指用标准储备菌种接种至普通琼脂斜面培养基上，作为以后工作使用的菌株。
4. 职责4.1 质量控制部主任负责菌种的申购。
4.2 微生物检验人员负责菌种的验收、保管、传代、使用及销毁等。
4.3 质量管理负责人负责菌种申购计划的批准。
5. 程序5.1 检定菌种的购买质量控制部主任根据菌种使用情况（包括临时检验需要），提出申购计划，由质量管理负责人批准后，申购记录（附件1）交给物供部负责人购买。
5.2 检定菌种的接收菌种到达实验室后，由微生物检验人员验收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在检定菌种接收记录（附件2）上，内容包括：菌种名称、数量、编号、代数、来源、接收日期、接收人等。
5.3 检定菌种的保管5.3.1 菌种保管应有专人负责，保存于加锁的冰箱中，将购进的试管斜面菌种放入（2～8℃）冷藏保存，有效期为3个月。
确保菌种安全，因工作变动时，必须做好交接工作。
5.3.2 工作用菌种采用斜面低温保存法。
5.3.3 检定菌种的定期检查在菌种的保存期间，应每周检查保存菌种冰箱的温度、菌种管的塞子是否松动或生霉，并及时填写《检定菌种观察记录》（附件3），如有异常应及时灭活处理后销毁。
5.3.4 所保管的菌种，不能随意转让其他单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供应。
5.4 检定菌种的传代5.4.1 1代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养物中培养，任何形式的转种均被认为是传代1次，从菌种保藏机构获得的标准菌种为第0代。
检定用菌种传代、贮存、接种操作细则
检定用菌种、传代、贮存、接种操作细则传代与接种操作步骤：1、先点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作，烧灼接种环。
2、再将菌种管（即原有的菌种斜面培养基）与待接种的新鲜斜面培养基（接种管）持在左手拇指、食指与中指之间，要注意能清楚的观察到斜面，菌种管在前、接种管在后，应斜持试管显45℃角，使试管内斜面上，两试管口平齐，注意不要持成水平，以免底管凝聚小浸湿培养基表面。
3、用右手将两管棉塞转动，以便接种时易于拔取。
再灼烧接种环注意灼烧时，接种环应垂直或稍斜的在外焰上灼烧，外焰温度与内焰高，顶端的环必须烧红，以彻底灭菌，环以上进入试管部分也应充分通过火焰灭菌。
4、使用右手小指与无名指及无名指中指之间，在火焰旁分别拔下两只试管的棉塞、持住，将试管口通过火焰，以杀灭管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。
5、将灼烧过的接种环伸入菌种管，先接触无军生长的培养基快速冷却，若接触的培养基有熔印时则表明接种环未冷却，能烫死细胞。
待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，在火焰旁边，迅速踌躇接种环伸入接种管，在管内斜面上划线接种。
划线时在斜面上应先由内向外划一直线后，再由内向外划曲线。
*注意事项：1、整个操作过程应迅速且在酒精灯上方操作，勿使菌苔沾至管壁或管口。
2、从菌种管取出少量菌种苔后接种环，切不可通过火焰，以免菌种被烧死，也不宜火焰太远。
（避免污染）3、接种完毕后，立即在火焰旁塞上棉塞，再将接种环灼烧灭菌放回原处，再把可能未塞紧的棉塞塞紧，即可置适宜温度培养。
4、操作过程中，若棉塞不慎触及火焰而着火，切忌用口吹，若是棉塞进试管塞内一端着火，可在刚刚着火时迅速塞入试管，因管内氧气不是会很快熄灭，若棉塞外着火，可用手捏熄，若棉烧坏不宜再用，可另取未接种斜面培养基的灭菌棉塞，代替塞上。
5、借重完毕，应做好记录。
菌种的分离鉴别操作细则目的：当菌种污染某菌时，可将菌种接种于平板培养基进行分离，再根据菌种形态，挑取典型纯菌落并鉴别制成菌种管。
分离方法及步骤：1、取已污染某菌的菌落管，左手拿着菌种管拧松棉塞。