2015-11-固定化酶_378506984

生物化学工程基础 Biochemical Engineering
（三）共价交联法
OHC－（CH2）3－CHO ＋ 酶E
－CH＝N－酶E－N＝CH－（CH2）3－CH＝N－酶E－N=CH—
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N
N
║
║
CH
CH
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第一篇报道是戊二醛交联羧肽酶
得到一种分子间交联的固定化酶
李强 化工系生化所 抗体与生物催化工程实验室
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（一）吸附法
2.离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载体结合 第一个离子结合法固定化酶：
DEAE — Cellulose 二乙氨基乙醇（DEAE）， 固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
（1）葡萄糖电极
半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
ß－D－葡萄糖＋O2
D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O
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（2）脲电极 Urea + 2H2O
脲酶
2NH4++2HCO3-
产生的2NH4+为阳离子电极感应。
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11.4 细胞的固定化方法
⑶交联法 用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方 法。
⑷无载体法 靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的 技术。
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4. 酶学特性的变化
①底物专一性
②最适pH ③最适温度 ④米氏常数 ⑤最大反应速度
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固 定 化 酶
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（三）共价交联法
优点：固定化时以共价结合，酶结合牢固、稳定。分子
的构象很可能发生变化。
缺点：分子的构象变化、交联的反应位点不确定，容易
破坏酶催化中心，酶失活多。
载体：各种能与交联剂结合的载体如表面带氨基、羧基
、羟基的载体。
对羟基苯甘氨酸 ＋ 6－APA
固定化酶
阿莫西林
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此外还有： 氨基酸电极
醇电极
尿酸电极
乳酸电极
青霉素电极
亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3 。。。。。。。。。
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在医药工业中的应用
酶促反应的工程特点 工艺简单 效率高
生产成本低*
环境污染小 产品收率高 纯度好（质量好）。
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从青霉素G生产6－APA
所 用 酶：青霉素酰化酶 酶 来 源：多种细菌、动物体、基因工程菌表达获得 产生形式：胞内、胞外 用 途：制备6—APA，合成半合成青霉素
青霉素G
固定化酶
苯乙酸 ＋ 6－APA
水不溶性载体
固定化技术
非分散细胞 （固定化细胞）
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11.3 细胞的固定化
2.固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称
为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位 置的细胞称为固定化细胞。
2.固定化方法与载体的选择依据
固定化方法的选择 ⑴固定化酶（细胞）应用的安全性 ⑵固定化酶（细胞）在操作中的稳定性 ⑶固定化过程的成本
载体的选择 载体成本 固定化的难易程度 失活的固定化酶（细胞）的处理（污染）
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11.1 酶的固定化
1. 什么是酶的固定化？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术
水不溶性酶 （固定化酶）
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3.固定化细胞的特点
• 优点
1.效率高，酶回收率高，无需进行酶的分离纯化， 2.胞内酶辅助因子可以再生 3.抗污染能力强 4.微生物可以高密度 5.固液分离效果好 6.对环境的耐受力强(如pH、温度、有机溶剂、有毒物质) 7.复杂催化过程（全细胞酶催化）
11.1 酶的固定化
2.固定化酶的定义： 固定化酶是指限制或固定于特定空间位置
的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理， 使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又 能发挥催化作用的酶。
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11.1 酶的固定化
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（一）吸附法
优点：固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。 缺点：结合力弱，易解吸附。 载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等。
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（二）胶格包埋法
CH2=CH C=O 丙烯酰胺
NH2
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH)mCH2-CH
C=O
C=O C=O
NH2
NH CH2
NH2
NH
C=O
CH2-CH ( CH2-CH)nCH2-CH( CH2-CH)mCH2-CH
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生物化学工程基础
Biochemical Engineering
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化工系生化所 抗体与生物催化工程实验室
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第十一讲：酶（细胞）的固定化
11.1 酶的固定化 11.2 酶的固定化方法 11.3 细胞的固定化 11.4 细胞的固定化方法 11.5 固定化方法比较 11.6 固定化酶的应用 11.7 固定化酶和固定化细胞反应器
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添加大标题
交联剂
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
• 酶分子；
（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的 固定化酶；
（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
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11.5固定化方法比较
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11.6 固定化酶在工业上的应用
L-丙氨酸生产 乙酰 -DL — Ala
L — Ala ＋乙酸 ＋乙酰 -D — Ala
Aminoacylase
氨基酰化酶
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• 缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活
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11.1 酶的固定化
5. 酶固定化的具体对象
固定化酶
自由酶 自由酶＋辅酶
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C=O
C=O
NH2
NH2
聚丙烯酰胺
CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O
CH2=CH
N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
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（二）胶格包埋法
优点：固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。 缺点：网格做的很小不容易，容易漏酶。机械强度差。
11.2 酶的固定化方法
酶固定化方法
载体结合法 交联法
包埋法
网格型 微囊型 物理吸附法 离子结合法 共价结合法
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酶固定化模式
（一）吸附法
1. 物理吸附法
• 静止法 • 混合浴或振荡浴吸附法
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颗粒大，内扩散阻力大
载体：卡拉胶、聚丙烯酰胺、海藻糖、聚丙烯酸等。
（三）共价交联法
双功能试剂（交联试剂）：
常用的是戊二醛
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
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11.4 细胞的固定化方法
1.细胞的固定化方法
⑴载体结合法 是将细胞悬液直接与水不溶性的载体相结合的
固定化方法。 ⑵包埋法
将细胞定位于凝胶网格内的技术。 聚丙烯酰胺 海藻酸钙 卡拉胶
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（四）微型胶囊法
酶 微胶囊
产物
底物
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11.3 细胞的固定化
1. 什么是固定化细胞？
分散细胞
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A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化 酶柱子
消
泵
离心机
旋
反
应
器
反应产物
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
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固定化酶在医学上的应用
3. 游离酶催化存在的问题
稳定性差 价格昂贵 不能（容易）重复使用
为什么 要固定
化？
分离困难，严重影响产品质量
其它用途：生物传感器
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11.1 酶的固定化
4. 固定化酶的特点
• 优点： 1. 不溶于水，易于与产物分离； 2. 可反复使用； 3. 可连续化生产； 4. 稳定性好。
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（二）胶格包埋法
酶
底物、产物
首先被采用的胶格包埋法是：
• 固定化胰蛋白酶 • 木瓜蛋白酶 • －淀粉酶 丙稀酰胺、N-甲叉双丙稀酰胺—聚丙烯酰胺
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• 缺点：固定化过程也会引起酶的失活
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4. 固定化细胞的具体对象
固定化细胞
活细胞 静止活细胞 增殖活细胞 固定化死细胞（通透处理）
固定化细胞器
线粒体 叶绿体 微粒体
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固 定 化 细 胞
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生物化学工程基础 Biocheபைடு நூலகம்ical Engineering
5.固定化后酶活力和稳定性
⑴酶活力的变化 ⑵酶稳定性的变化
①操作稳定性 ②贮藏稳定性 ③热稳定性
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3.固定化后催化剂（酶、细胞）的性质
游离的酶固定化后会引起的酶性质的改变，一 般认为其原因可能有下列几种：
分子构象的改变 微环境的影响(温度、pH…) 底物在载体内和溶液间存在
着分配效应 扩散效应
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