高效液相色谱分析

高效液相色谱 几乎可以分析各种物质
可以用于热不稳定物质的分析 色谱柱不能很长，柱效不会很 高 没有较高灵敏的通用检测器①
流动相有毒，费用较高 运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大
① 近来出现的蒸发激光光散射检测器（ELSD）是灵敏度较高的通用检测器
流动相差别
GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。 HPLC：流动相为液体 组分与流动相和固定间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用。 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性 操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动 相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），分离极性 化合物，极性小的先出峰。反之，流动相的极性大于固定液的 极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反。 Ki i aq Mobile phase
峰面积与流动相流 速无关，峰响应值 与流速成正比
大部分常用的液 相色谱检测器都 属于该类检测器
响应值正比于单位时间内通 过检测器的物质的质量即正 比于质量流速
库仑检测器
光学性质 检测器
根据被测物质对光的吸收、 发射和散射等性质进行检测 的
应用范围广，灵敏 度高
按 测 量 原 理 分
紫外-可见检测器 ，示差折光率检 测器，蒸发光散 射检测器，荧光 检测器，化学发 光检测器，手性 检测器 安培检测器，电 导检测器，库仑 检测器，介电常 数检测器，极谱 检测器 光声检测器，热 透镜和光热偏转 检测器
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液
体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀 死体积小，很 适用于梯度洗 提等特性。
2013-12-21
往复式柱塞泵
(2)梯度淋洗装置
外梯度: （低压梯度） 将两种不同极性的 溶剂按一定的比例送入 梯度混合室，混合后进 入色谱柱。 内梯度：（高压梯度） 一台高压泵, 通过 比例调节阀,将两种或 多种不同极性的溶剂 按一定的比例抽入高 压泵中混合。
(一)、HPLC与经典LC区别
经典液相色谱 高效液相色谱
常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高压，40～50MPa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高,40000～60000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次使用 能在线检测
2013-12-21
2013-12-21
2013-12-21
(3) 进样装臵
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装臵，
其结构如图所示：
装入样品 采样环 进样
进色谱柱 泵入溶剂 出口
2013-12-21
(4) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
(二)、HPLC与GC异同点
气相色谱 只能分析挥发性物质，只能分 析20%的化合物 不能用于热不稳定物质的分析 用毛细管色谱可得到很高的柱 效 有很灵敏的检测器如ECD和较灵 敏的通用检测器（FID和TCD） 流动相为气体，无毒，易于处 理 运行和操作容易 仪器制造难度较小
2013-12-21
四、离子色谱
ion chromatograph
五、离子对色谱
ion-pair chromatograph
六、排阻色谱
size- exclusion chromatograph
七、亲和色谱(AC)
Affinity chromatograph
2013-12-21
一、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂：如硅胶、氧化铝等，较常使用 的是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂，“相似相 溶”原理 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；
2013-12-21
检测器的分类 ：
分类标准 种类 总体性能 检测器 按检测 器性质 或应用 范围分 类 响应原理 响应值取决于流出物（包括 样品和流动相）某些物理性 质的总的变化的检测器 特点 有广泛的适用范围 ，基线噪音和漂移 较大，灵敏度低， 不适于痕量分析， 不能用于梯度洗脱 检测灵敏度高，受 操作条件和外界环 境影响小，可用于 梯度洗脱，应用范 围受限制 常用类型 示差折光率检测 器 介电常数检测器 电导检测器 紫外-可见检测器 荧光检测器 化学发光检测器 安培检测器 手性检测器
教学重点、教学难点：
1. 高效液相色谱与气相色谱的异同点 2. 高效液相色谱速率理论方程式在实验条件优化中的应用 3. 分离柱和流动相的选择和匹配 4. 不同种类液相色谱分离的原理上的差异
2013-12-21
第一节 高效液相色谱法概述
Generalization of high performance liquid chromatograph 一、概述 Generalization 二、高效液相色谱仪 HPLC 三、高效液相色谱法的特点 feature of HPLC 四、流程及主要部件 general process and main assembly of HPLC
2013-12-21
四、流程及主要部件
process and main assembly of HPLC
1.流程
液相色谱流程图
PUMP
Detector W
Data station (Recorder)
2013-12-21
or Collection
(1) 高压输液泵
2.主要部件P83
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
2013-12-21
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有
不同官能团的化合物和异构体有较高选择性；
2013-12-21
缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
二、 液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatography
固定相与流动相均为液体（互不相溶）；
基本原理：组分在固定相和流动相上的分Βιβλιοθήκη Baidu；
2013-12-21
示差折光检测器
2013-12-21
d. 荧光检测器
（fluorescence detector）
高灵敏度、高选择性的检测器。对 多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药、药物、氨基 酸、甾类化合物等有响应； 器(电导检测器、伏安检测器等)
e.其它检测器： 电化学检测
2013-12-21
2013-12-21
光电二极管阵列检测器
2013-12-21
c. 示差折光检测器
（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差 值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（ 每种物质具有不同的 折光指数）； 灵敏度低、对温 度敏感、不能用于梯 度洗脱； 偏转式、反射式 和干涉型三种；
电学及电 化学性质 检测器
根据被测物电化学性质进行 检测
热学性质 检测器 积分型检 测器 微分型检 测器
利用热学原理进行检测
按信号 记录方 式分
2013-12-21
显示的信号是指在给定时间 内物质通过检测器的总量 显示的信号表示在给定时间 内每一瞬间时通过检测器的 量
灵敏度低，定性困 难，应用少 灵敏度高

2013-12-21
二、液相色谱仪器
high performance liquid chromatograph
——2004年市场调查报告
2003年全球液相色谱市场的总销售额为25.16亿美金，2010年预计将达到 33.83亿美金。 国内对液相色谱仪的需求量越来越大： 2000年版中国药典规定用液相色谱仪对药物的最终质量控制和检验，较 之95版药典有了大幅度的增加；我国的医药生产、新药开发以及中草药的 研究都大大增加了对液相色谱的需求； 色谱分析已被列为全国化学及相关专业大学生的必修课，全国近 1000 所 大学学生实验用液相色谱仪的需求量将相当可观； 随着国家对环境保护和生态平衡的更加重视，“十五”期间全国各地的 环境监测站也已逐步配备液相色谱仪及其他分析仪器，对水质、大气和土 壤进行监控； 我国进出口国际贸易近年来快速增长，并还将持续大幅度增长，而色谱 分析方法及其色谱—质谱联用技术是世界公认的商品检验手段之一，只有 高质量的色谱仪、色质联用仪和高水平的检验结果才可能被世界各国认可 ，没有足够数量的高质量色谱仪器和色质联用仪就难以“与世界接轨”。 2013-12-21 我国液相色谱仪的发展远远落后于气相色谱仪的发展，目前国内使用的 液相色谱仪90%以上均是进口产品。
第十二章 高效液相色谱分析
high performance liquid chromatograph
2013-12-21
教学目标及要求：
1.掌握液相色谱的特点； 2.掌握液相色谱法的分类； 3.了解影响液相色谱峰扩展及色谱分离的因素； 4.理解液相色谱分离的原理； 5.了解液相色谱的固定相和流动相； 6.了解液相色谱仪的组成和结构原理及主要部件； 7.了解液相色谱分离类型的选择； 8.了解液相色谱的应用。
2013-12-21
一、概述
Generalization
高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。它是在经典 液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用 高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的 快速分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动 化和应用范围广的特点。
2013-12-21
溶质性能 检测器
响应值取决于流动相中溶质 的物理或化学特性的检测器
浓度敏感 性检测器
按测量 信号性 质分 质量敏感 性检测器
2013-12-21
响应值正比于溶质在流动相 中的浓度，测量的是流动相 中溶质浓度瞬间的变化
样品量一定时，检 测器瞬间响应即峰 高响应值和流动相 流速无关，峰面积 与流速成反比，峰 面积与流速乘积为 常数
电导检测器直接测定柱后洗脱液的电导 变化。将被测洗脱液臵于施加电场的两 个电极间，电导值 1／R（R为两电极间 电阻值）与电极截面积A，两电极间距 离 L和各离子的电导总和∑Cⅰλⅰ之间有 如下关系:
2013-12-21
式中Cⅰ为i离子的摩尔浓度，λⅰ为i离子的摩尔电导。
第二节 主要分离类型与原理P70
basic principle and main separating types 一、液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatograph
二、液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatograph
三、离子交换色谱
ion-exchange chromatograph
三、高效液相色谱法的特点和应用
特点： “三高” “一快” “一广” 高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度(紫外：10-9g；荧光：10-11g) 高选择性 分析速度快(＜1h) 应用范围广泛（可分析80%有机化合物） （是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。）
2013-12-21
(5) 液相色谱检测器
理想的HPLC检测器应具有如下特性：
第一，具有高灵敏度和可预测的响应； 第二，对样品所有组分都有响应，或具有可预测的特异性，适 用范围广； 第三，温度和洗脱液流速的变化对响应没有影响； 第四，响应与洗脱液组成无关，因此可作梯度洗脱； 第五，死体积小，不造成柱外谱带扩展； 第六，使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修； 第七，响应值随样品组分量的增加而线性增加，线性范围宽； 第八，不破坏样品组分； 第九，能对被检测的峰提供定性和定量信息； 第十，响应时间快。