Real time PCR与常规血培养在血流感染未知病原体鉴定中的比较研究

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血流感染的分子诊断研究进展

血流感染的分子诊断研究进展作者：金君孙仁华呼邦传来源：《中国现代医生》2020年第36期[摘要] 血流感染是指病原微生物进入血液循环并生长繁殖，产生毒素、代谢产物，导致全身炎症反应的感染性疾病，是当前全世界临床医生面临的重大挑战之一。

早期诊断并使用有效的抗感染方案能缩短抗生素使用时长、降低患者死亡率。

血培养及药物敏感试验是目前临床诊断血流感染的金标准，但其存在病原学检测结果时间长、阳性率低等缺点，不能满足血流感染危重患者快速及精准治疗的需求。

近年来随着分子检测技术的发展，涌现出DNA微阵列、质谱分析、数字PCR、二代高通量测序等分子诊断技术，较血培养能更快速地识别病原菌及耐药基因、提高检测的阳性率，指导临床医师早期进行目标抗生素干预，对改善血流感染患者临床预后具有潜在价值，并可降低病原菌耐药性。

[关键词] 血流感染;血培养;分子诊断技术;研究进展[中图分类号] R631 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2020）36-0182-06[Abstract] Bloodstream infection is an infectious disease in which pathogenic microorganisms enter the blood circulation， and grow and multiply， producing toxins and metabolites leading to systemic inflammation. It is one of the major challenges faced by clinicians all over the world. Early diagnosis and effective anti-infection regimens can shorten the duration of antibiotic use and reduce the mortality of patients. Blood culture and drug sensitivity test are the gold standards for clinical diagnosis of bloodstream infection， but they have disadvantages such as the time-consuming detection results of etiology and the low positive rate， which cannot meet the needs of rapid and precise treatment for critically ill patients with bloodstream infection. In recent years， with the development of molecular detection technology， DNA microarray， mass spectrometry， digital PCR， second-generation high-throughput sequencing and other molecular diagnostic technologies have emerged. Compared with blood culture， these techniques can quickly identify pathogenic bacteria and drug-resistant genes， improve the positive detection rate， guide clinicians to conduct targeted antibiotic intervention in the early stage， and have potential value in improving the clinical prognosis of patients with bloodstream infection， and in the long run， reduce the resistance of pathogenic bacteria. Therefore， this paper reviews the research progress of molecular diagnostic techniques for bloodstream infection.[Key words] Bloodstream infection; Blood culture; Molecular diagnostic technique; Research progress近年來，血流感染（Bloodstream infection，BSI）的发病率呈上升趋势，这与重症病房侵入性操作多、广谱抗生素使用不合理、多重耐药菌的增多及人口老龄化等因素相关。

基因测序(一代测序和二代测序)-用于临床疑难病原体鉴定精选全文

（一）难鉴定细菌真菌一代测序方法
细菌核糖体基因结构特征
➢ 16S rRNA编码基因约1500 bp，包含约50个功能域。 ➢ 为细菌分类的金标准，由可变区和保守区组成。 ➢ 保守区为细菌共有，可变区有属或种特异性。
真菌核糖体基因结构特征
➢ 18S RNA基因、5.8S rDNA、28S RNA基因较保守，不适合区分不同属种。
➢诊断不清、治疗无效、束手无策
二代测序案例分析
➢48小时 ➢完成脑脊液标本二代测序
➢ 提示钩端螺旋体感染 ➢475条序列，占比0.016% ➢改用青霉素治疗
➢32天 ➢男孩痊愈出院
二代测序案例分析
共得到序列数 3,063,784
二代测序过程 PCR扩增选择性，可丢失大量病原体片段
二代测序案例分析
➢ 1个样品3000元以上。
二代测序流程
样本收集保存转运
RNA病毒也可建库
二代测序百万序列
7000种病原体分析
区分致病菌污染菌
华大基因二代测序可检测病原体近 7000种
可检测病原种类细菌真菌病毒
寄生虫分枝杆菌（结核和非结核）
支原体/衣原体
种类数量/种 2328 199 4189 135 83 41
病毒有DNA病毒和RNA病毒之分，如怀疑流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒等RNA病毒，需要注意送检RNA检测流程。
迅敏康IngeniGen公司二代测序可检测病原体14000多种
可检测病原种类细菌真菌病毒
寄生虫分枝杆菌（结核和非结核）
衣原体支原体立克次氏体
种类数量/种 5682 812 7098 138 94 85 96 90
➢ 间隔区ITSl、5.8S rDNA和间隔区ITS2 在不同真菌属及种间表现出较高的差异，目前已用于真菌分类鉴定和分子检测，以ITS2应用最广泛。

血液培养技术用于血流感染诊断临床实践专家共识

血液培养技术用于血流感染诊断临床实践专家共识汇报人：日期:•引言•血液培养技术概述•血流感染的诊断标准及临床实践•血液培养技术的结果解读与临床应用目•血流感染防治策略与持续改进•结论与展望录引言01血流感染可能导致败血症、感染性休克等危及生命的并发症。

威胁生命多样病原体需要快速诊断血流感染涉及细菌、真菌、病毒等多种病原体，临床表现复杂多样。

血流感染病情凶险，快速、准确的诊断对于及时启动有效治疗至关重要。

030201血流感染的临床意义血液培养技术能够有效检测出血液中的病原体，为血流感染提供直接证据。

病原体检测通过血液培养技术确定病原体种类和药物敏感性，有助于指导临床合理用药。

指导治疗血液培养结果可作为血流感染患者预后评估的重要指标之一。

预后评估血液培养技术的重要性通过制定专家共识，规范血液培养技术的操作流程，提高检测结果的准确性和可靠性。

规范操作流程为临床医生提供血流感染诊断的参考依据，提高临床治疗的针对性和效果。

指导临床实践促进血流感染诊断领域的学术交流和研究合作，推动学科发展和进步。

推动学科发展专家共识的目的和意义血液培养技术概述02血液培养技术是一种用于检测和识别血液中的微生物，特别是细菌和真菌的实验室诊断方法。

定义描述其主要目的是诊断血流感染，血流感染是指微生物进入血液并繁殖，导致全身性感染的情况。

目的说明血液培养技术的定义技术演进随着技术的进步，自动化血液培养系统和更先进的检测技术（如质谱技术）逐渐被引入，提高了检测的准确性和效率。

初始阶段早期的血液培养技术主要依赖简单的肉汤培养基和观察微生物的生长。

未来趋势目前，血液培养技术正朝着更高通量、更快速和更灵敏的方向发展。

血液培养技术的发展历程血液培养技术的原理及操作方法•原理描述：血液培养技术基于微生物在特定培养基中的生长和代谢来检测微生物的存在。

当微生物在培养基中生长时，会触发一系列生化反应，这些反应可被检测系统捕获并转化为阳性信号。

操作步骤1. 采集患者的静脉血液样本。

realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点

real-time PCR技术的原理及应用摘要：一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

（二）实时原理 1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。

PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。

2023版血液培养技术用于血流感染诊断临床实践专家共识解读ppt课件

2023版血液培养技术用于血流感染诊断临床实践专家共识解读
汇报人：xxx 2023-1-03
目录
• 共识背景与目的 • 共识内容概述 • 共识详细解读 • 共识实施建议与挑战 • 未来展望与研究方向
01 共识背景与目的
血流感染现状及挑战
血流感染发病率
血流感染是一种常见的严重感染类型，发病率较高，且呈上升趋势。
提高患者及家属认知度与配合度
宣传教育
通过开展讲座、发放宣传资料等形式，向患者及家属普及血流感染相关知识，提高认知度。
心理疏导
对患者进行心理疏导，减轻其焦虑和恐惧情绪，提高治疗依从性。
家属参与
鼓励家属积极参与患者护理过程，提供情感支持和生活照顾，减轻患者负担。
优化抗菌药物使用与管理政策
严格执行抗菌药物使用指南
根据共识和指南，规范抗菌药物的使用种类、剂量和疗程，降低耐药风险。
加强抗菌药物监管
定期对医院抗菌药物使用情况进行监测和评估，确保药物使用的合理性和规范性。
完善抗菌药物管理政策
建立抗菌药物分级管理制度，加强处方审核和点评，促进抗菌药物合理使用。
05 未来展望与研究方向
新型血液培养技术应用前景
病原体多样性
导致血流感染的病原体种类繁多，包括细菌、真菌、病毒等，给诊断和治疗带来挑战。
耐药性问题
随着抗菌药物的广泛使用，耐药菌株不断增多，给血流感染的治疗带来困难。
临床诊断需求
血流感染的早期诊断和病原体鉴定对于制定治疗方案和改善预后具有重要意义。
血液培养技术应用与发展
血液培养技术原理
通过制定共识，规范血液培养技术的临床应用，提高血流感染的诊断准确性和及时性。
促进抗菌药物合理使用

血流感染的早期诊断与病原菌识别

• 研究期间，共发生58例由多种病原体导致的血流感染，该类患者前三次血培养的阳性率为100%
N=58例
阳性率
Lee A et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2007;45(11):3546–3548
病原体血培养的阳性率与采血体积相关
• 导致血流感染的G-菌、G+菌、厌氧菌及真菌，其血培养的阳性率均与采血体积相关
血流感染早期诊断治疗存在的问题
病死率
血流感染病情凶险，死亡率高达 26-41%
临床表现缺乏特异性，诊断困难
血培养
阳性率低，培养结果所需时间长（2-5天）
不恰当的经验性治疗易导致细菌耐药及医疗资源浪费
临床表现
治疗问题
早期诊断与病原菌识别的主要方法
血培养
血流感染诊断的金标准，但阳性率低，检测周期长（3-7天）
Crit Care Med 2001; 29: 1303-10
国内血流感染的病死率
结论：普通住院患者BSI的病死率为20.7%，烧伤、血液病肿瘤以及ICU患者病死率更高，而新生儿病房、肝病及糖尿病患者则相对较低。医院BSI 病死率为26.8%，明显高于社区BSI的病死率。近几十年来，BSI住院病死率呈下降趋势。
荧光原位杂交技术-细菌早期识别
新的荧光原位杂交技术对血培养阳性快速病原体识别
结果显示：152例患者血养阳性的个
标本中，FISH鉴定细菌生长的阳性例标本数145个。在病原菌鉴别中138例准确， 7例错误，微生物识别准确率95.2%,可信区间95%。在需氧菌和厌氧菌的鉴别没有差异。对血培养阳性病原菌鉴别时间为30分钟，上机时间仅需10分钟。结论：荧光原位杂交技术对于血流感染的快速诊断和病原菌精确识别具有重要的临床意义

PCR检测技术在常见细菌中的运用

Application of PCR Detection Technology in Common Bacteria
orresponding author）
（Department of laboratory, Wuxi NO.2 People’s Hospital, Jiangsu Province，Jiangsu Wuxi）
感性为 30.00%，PCR 检测技术敏感性、特异性明显高于血培养（P<0.05）。结论 PCR 检测技术在血流感染患者常见细菌中具有较高的应用价值。
关键词：PCR 检测技术；细菌；运用中图分类号：R9 文献标识码：A DOI: 10.3969/j.issn.1671-3141.2016.86.035
0 引言
近年来，随着抗菌药物的广泛使用，临床耐药率逐渐上升，对此已受到临床学者的重视。而目前首要解决的问题为细菌的耐药性分析和检测。目前面对细菌耐药情况，临床上使用药物治疗，而在选择药物中，耐药性和分子生物学较为重要。至今为止，临床上常使用的生物学技术为 PCR 检测技术，为了探索其检测技术的有效性 [1]。本文旨在探索 PCR 检测技术在常见细菌中的临床意义，具体的内容可见下文描述。
1 资料和方法
为了探索 PCR 检测技术在细菌中的特异性，本院选取 53 例疑似血流感染患者为此次研究对象，所有患者均在 2013 年 5 月至 2015 年 5 月期间收集。本次研究的患者年龄在 20 ～ 75 岁之间 , 平均年龄为（52.47±8.85）岁。选取引起血流感染常见的病原菌，包括革兰阴性杆菌中的：铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形菌、大肠埃希菌；革兰阳性球菌中的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌。引物设计：使用 PRIMER 5.0 引物设计软件，分为两条引物，根据每种细菌的 16S rRNA 进行引物的设计及 PCR 的扩增。仪器和试剂： DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；引物的合成和测序（上海生工）； 2*TaqPCR MasterMix 检测试剂（南京诺唯赞生物工程有限公司）； JD-801 型凝胶成像分析系统（捷达科技）； Engine opticon2 型 PCR 仪（美国 MJ 公司）； VITEK-2 细菌分析仪（法国梅里埃公司）。模板 DNA 的提取：严格按说明书要求进行提取。 PCR 扩增条件：模板 5.0ul， 5U/ul TAQ 酶 0.25ul， 20umol/ L 引物 1ul， 10× 缓冲液 5ul， 25mmol/L MGCL 2 4ul， 2.5mmol/ L dNTPS 4ul，加入双蒸馏水至 50ul。随后预变性 5 分钟（保

realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点

（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

Real Time PCR 检测方法原理

Real Time PCR 检测方法原理■ 嵌合荧光染料检测法(SYBR Green I)SYBR® Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与双链DNA非特异性结合，结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中的SYBR® Green I 荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

通过PCR反应生成双链DNA，SYBR® Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。

具体原理见下图。

嵌合荧光染料法原理图■ TaqMan探针法TaqMan®探针法是使用5’端带有荧光物质（如：FAM等)，3’端带有淬灭物质（如:TAMRA等）的TaqMan探针进行荧光检测的方法。

当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约，不能发出荧光。

而当TaqMan®探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。

当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。

进一步在PCR反应的延伸过程中，Taq DNA聚合酶的5’→3’Exonucl ease活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。

通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。

具体原理见下图。

TaqMan探针法原理图■ CycleavePCR法原理CycleavePCR法是由RNA和DNA构成的杂合Cycling 探针与RNase H组合使用的高灵敏度检测方法，能够高效率地检出目的基因。

Cycling 探针内部夹有RNA部分，一端标记荧光物质，另一端标记淬灭物质，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光，但当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，RNase H在RNA部分将探针切断，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光，通过测定荧光强度，能够实时监测扩增产物量。

血培养在血流感染中作用和最佳操作-BestPracti

Cockerill, et al., CID 2004
败血症的诊断Diagnosis of Sepsis
• 血培养 • 怀疑有感染病变的身体其它部位的
细菌学培养 • 开始经验抗感染治疗
怀疑感染病人的经验性抗感染治疗 Empirical Therapy in Suspect Patient
• 使用广谱抗生素开始抗感染治疗
Hours to Days
Sepsis
Severe Septic Shock Sepsis
%+
17
Blood
CHale Waihona Puke ltures2569
*Rangel-Frausta, 1995 JAMA 273:117-23
Blood Cultures to Detect Sepsis 血培养检测败血症
• 阳性百分率（％）
菌血症和真菌血症 ----直接威胁生命的感染性疾病
• 阳性的血培养报告应被视为潜在的医疗紧急状态警报。
• 发展为败血症的比率高达40%~90%。
• 血培养阳性的患者应尽可能快地给予适当的抗感染治疗。
一过性菌血症（Transient bacteremia）菌血症的类型
• 对感染组织的处理：如：脓肿、疖、蜂窝组织炎
感染治疗
药敏实验结果：
• 50%病例根据快速药敏结果报告（样本采集后的24小时之内）调整抗感染治疗方案
Winchester et al., 1977
Detection of Positive BC 阳性血培养的检测
• 选择正确的抗感染治疗方案
• 纯培养菌株的准确鉴定 • 血培养的直接鉴定
• 调整经验治疗方案 • 停止经验治疗
• Volume of blood inoculated（接种血液数量）

实时定量PCR与传统培养方法在血流感染病原体检测中的应用分析

实时定量PCR与传统培养方法在血流感染病原体检测中的应用分析目的：探讨实时定量PCR与传统培养在血流感染病原体检测中的临床应用价值。

方法：收集医院各科室血流感染患者血液标本106份，同时进行实时定量PCR和血培养，检测和计算实时定量PCR的特异性、敏感性，以及与血培养的一致性。

结果：106份样本中检测出10中病原体，实时定量PCR检测出24份阳性，82份阴性，其中阳性与血培养一致的有8份，阴性与血培养一致的有77例，两种检测方法一致性为80.2%；实时定量PCR的NPV为93.9%，敏感度为61.5%，特异性为82.8%；5例为PCR阴性血培养阳性，16例为PCR阳性而血培养阴性；此外有1个样本超出PCR检测范围，而血培养为阳性。

结论：实时定量PCR检测血流感染患者病原体，具有速度快、敏感性好、特异性好的优势，但在临床应用中仍需将常规细菌培养作为重要补充。

标签：实时定量PCR；血流感染；病原体血流感染是菌血症和败血症的统称，近年来由于诊疗技术的提高和激素、抗生素的廣泛运用，血流感染的发生率不断升高[1]。

血流感染患者病死率较高，住院时间也相对较长，不仅增加患者经济负担，也给患者造成较大危害。

因此，快速、准确的检测出血流病原体，并及时给予患者针对性的抗生素治疗，对于降低病死率有重要意义。

传统的培养方法主要是血培养，但培养结果需要等待较长时间，尤其是某些营养需求复杂、生长缓慢的病原体，培养时间甚至超过48小时。

此外患者接受抗生素治疗后，其血培养的阳性率也会明显降低[2]。

为了提高血流感染诊断的敏感性、特异性和速度，本文利用实时定量PCR检测血流感染病原体，取得较满意的结果，现将详细情况做如下汇报。

1.资料与方法1.1一般资料选取我院各个科室收治的血流感染患者82例，总共取得106份样本。

其中男性48例，女性34例，年龄29～56岁，平均年龄（42.8±12.4）岁。

其中有55例患者来自肿瘤科、麻醉科和ICU，其余来自血液科与内科。

Bio-Rad定量PCR说明书

Reality vs. Theory
Amplification is exponential, but the exponential increase is limited:

Log Target DNA

A linear increase follows exponential Eventually plateaus
However… Molecular Beacons Are DIFFICULT to Design and Synthesize Does NOT generate a cumulative fluorescence signal, much weaker signal than the 5’ Nuclease Assay (Cleavage probe) Expensive!
Q F
Tubulin
Q H
GapdH
Q
TX
b-actin
Q
Cy5
Cyclophilin
Multiplexing
1000
Tubulin
Log Relative Fluorescence
Cyclophilin beta Actin GAPDH
Texas Red FAM
Hex Cy5
100
10
10
13
16
SYBR Green I Experiment
Typical “first step” experiment: • Evaluate Primer Specificity
Using Melt Curve Analysis
• Evaluate Primer Pair Efficiencies

多通路微滴数字PCR用于诊断疑似血流感染文献汇报ppt

四、BSI和ddPCR结果的定义
阳性/阴性：如果检测到1个或更多的目标细菌，ddPCR结果被认为是阳性，如果没有检测到，则认为是阴性。多菌种感染：通过ddPCR或血培养检测到一种以上的微生物的标本。一致性/不一致性：BC和ddPCR的结果被分为一致的（都是阳性和阴性）或不一致的。 ddPCR和BC结果不一致：该组分类为高度疑似血流感染（probable BSI）、疑似血流感染(possible BSI)和推测假阳性。 ➢ 高度疑似血流感染: ddPCR结果在七天内与从其他血液外部位采集样本的微生物学检测一致； ➢ 疑似血流感染: 无微生物学结果，但根据临床表现和实验室检查表现不一致。
（n=12）、金黄色葡萄球菌（n=9）。
➢ 51个真菌：白色念珠菌（n=23）、光滑念珠菌（n=13）、
热带念珠菌（n=5）和近平滑念珠菌（n=10）。
四、BC和ddPCR多种病原菌合并感染结果：
血培养组：8.0%（6/71） ddPCR组： 38.3%（69/180）在传统的BC方法中诊断多菌种感染具有一定难度，
20.0%，真菌42.5%，包括肺炎克雷伯菌（n=9），白色念珠菌（n=6）、光滑念珠菌（n=5）、近平滑念珠菌（n=5）、金黄色葡萄球菌（n=3）、铜绿假单胞菌（n=3）、鲍曼不动杆菌（n=2）、大肠杆菌（n=1）、粪肠球菌（n=1）、屎肠球菌（n=4）和热带念珠菌（n=1）。
表2：ddPCR与BC检测病原菌种类和次数
二、检测现状
病原体鉴定和抗菌药物敏感性的金标准是血液培养(Blood culture, BC)，然而，在疑似菌血症、脓毒症、脓毒性休克等患者中，该方法因灵敏度较低而受到限制。因此，当务之急是在急诊和ICU等科室开发一种能用于 BSI病原体快速检测的诊断工具。

Real time PCR与常规血培养在血流感染未知病原体鉴定中的比较研究

Real time PCR与常规血培养在血流感染未知病原体鉴定中的比较研究作者：焦巍彭莉来源：《中外医疗》 2014年第15期焦巍彭莉长沙市妇幼保健院检验科，湖南长沙 410007[摘要] 目的观察real time PCR在血流感染病原体检测中的敏感性和特异性，并与常规血培养对比，探讨其临床应用价值。

方法以该院各临床科室收集的108份脓毒血症患者血液标本进行real time PCR检测，同时进行常规血培养，比较两种方法的特异性和敏感性。

结果108份标本当中，两种方法检测出12种病原微生物。

Real time PCR共检测出阳性标本25份，阴性标本83份。

其中与血培养共同阳性标本9份，共同阴性标本78份。

两方法的一致性为80.6%。

Real time PCR的阴性预测值是0.94，敏感性64%，特异性83%。

16例标本real time PCR阳性而血培养阴性，5例标本血培养阳性而real time PCR阴性。

同时，有2病标超出real time PCR的检测范围，而血培养阳性。

此外，real time PCR无法检测光滑念珠菌。

结论real time PCR虽然能快速检测血液感染中病原微生物，但依然不能完全替代血培养。

[关键词] 实时定量PCR；血流感染；血培养[中图分类号] R4[文献标识码] A[文章编号] 1674-074２（２０１4）05（c）－０031-02[作者简介] 焦巍（1974.9-），男，辽宁鞍山人，本科，副主任技师。

研究方向：病原体的快速诊断与防治。

E-mail：****************。

对于脓毒血症患者而言，准确快速快速血流病原体，是指导抗生素治疗最有效的措施[1]。

尽管经验性使用抗生素可及时挽救患者生命，但由于耐药菌逐年增多，因此对于抗生素疗效甚微的患者，有必要根据病原体的类型调整治疗手段[2]。

传统诊断血流感染的方式是血培养，虽然目前全自动的仪器已经广泛应用与临床，但最终的培养结果往往是需要等待12～48 h。

血培养vs分子生物学

PCR(-) • 检测限：将ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coli
Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21
6
阳性血培养－基于PCR的检测
• 最常见病原体多重PCR
– 电泳谱、ELISA杂交、多重Real-time PCR – Hyplex BloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重
– 基质会干扰被检测分子质谱峰的大小和浓度；不同类型的分析物选择不同的基质
MALDI-TOF MS
• 飞行时间（TOF）
– 原理：离子源产生的离子在加速电场获得动能，当进入高真空无电场飞行管道并在此管道内飞行时，质量较轻的离子飞行速度快，早到达检测器；质量较重的离子飞行速度慢，晚到达检测器。因此依据离子的飞行时间与其质荷比平方根（m/z）成正比的关系，通过测定飞行时间，计算出相应离子的分子量。
26
小结
• BSI发病率逐年升高，尤其是革兰阳性菌和真菌 • BSI病原菌耐药率持续升高 • 优化血培养流程，提高阳性率，降低污染率 • 结合临床分析血培养结果 • 分子生物学技术快速诊断BSI，MALDI-TOF MS、商
品化多重PCR检测平台、PNA-FISH成为未来发展方向 • 血培养不可被分子方法取代！
Langenbecks Arch Surg (2012) 397:447–455
VYOO®检测能力评估
Sepsis
非感染SIRS 血培养阳性
血培养阴性，其它标本培养阳性 Sepsis,所有培养阴性 PLoS ONE. 2012,7 : e38916
VYOO®
• 与微生物学一致性为46.2%
• 仍需改进

RQ-PCR技术检测白血病融合基因及其临床应用

RQ-PCR技术检测白血病融合基因及其临床应用江梅【摘要】@@ 实时荧光定量PCR技术(real time quantitative PCR,RQ-PCR)是由美国ABI公司于1995年研发用于核酸定量检测技术,目前该技术在科研和临床上已得到了广泛的应用,也为白血病的分子生物学研究提供了新的手段,已有很多临床血液病学家和检验学家应用该技术在白血病融合基因检测及其临床应用进行了大量的研究报道,本文拟就国内外的相关研究报道对检测白血病融合基因的RQ-PCR 技术作一综述.【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2010(028)005【总页数】4页(P469-472)【关键词】白血病;融合基因;RQ-PCR;分析性能【作者】江梅【作者单位】南昌大学第一附属医院检验科,江西,南昌,330006【正文语种】中文【中图分类】R596.1%R733.7%Q754实时荧光定量PCR技术 (real time quantitative PCR，RQ-PCR)是由美国ABI公司于1995年研发用于核酸定量检测技术，目前该技术在科研和临床上已得到了广泛的应用，也为白血病的分子生物学研究提供了新的手段，已有很多临床血液病学家和检验学家应用该技术在白血病融合基因检测及其临床应用进行了大量的研究报道，本文拟就国内外的相关研究报道对检测白血病融合基因的RQ-PCR技术作一综述。

1 白血病融合基因多数白血病患者具有特异性染色体异常：如急性早幼粒细胞白血病 (APL)、慢性粒细胞白血病(CML)等，由于染色体易位、倒位等变异，使得基因结构重排而产生融合基因，而成为白血病特异性的分子标志，因此对融合基因的检测可用于白血病的分子生物学分型诊断、预后观察及微残留病灶(MRD)的诊断，目前常见于临床的白血病融合基因有以下几种[1-2]。

1.1 bcr-abl融合基因：是由 t(9；22)(q34；q11)，使9q34上的原癌基因abl与22q11上的bcr基因合并形成bcr-abl融合基因，并转录产生8.5kb的融合mRNA。

血流感染实验室诊断.pptx

血培养污染菌
• 在多次血培养中单次培养下列细菌阳性 • 凝固酶阴性葡萄球菌 • 棒状杆菌 • 微球菌 • 丙酸杆菌 • 芽孢杆菌
• 如多次培养阳性，可能为条件致病菌，需结合临床分析
26
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为什么需氧+厌氧？
两种组合均能检测
非条件致病菌 Mayo Clinic
Pathogen No.
or <4 G/L or >10% 未成熟中性粒细胞 • 32%患者有1瓶以上CNS阳性，BSI68 %，污染12% (p <0.001) • 没有SIRS症状：BSI 5%，污染29% (p <0.001)
Clin Microbiol Infect. 2012 online
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单瓶血培养CNS的BSI和污染患者区别
OR=1.23
OR=0.93
Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online
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抗菌药物治疗与血流感染死亡率
死亡率
Chest 115 (2): 1999 第40页/共70页
血培养三级报告制度
血培养阳性
终报告
40
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血培养结果回报对治疗的影响
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阳性血培养－基于PCR的检测
• PCR特异性检测
• 病原特异性PCR
• 特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA, 肠球菌van • 细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数
• 广谱检测：PCR扩增特定靶位
• 多态性分析 • 测序 • 后续基因检测 • 种特异性real-time PCR
• 血流感染（bloodstream infection, BSI）：败血症和菌血症目前统称为血流感染。

探讨血培养阳性标本检测中两种细菌鉴定法的

探讨血培养阳性标本检测中两种细菌鉴定法的哈尔滨市第五医院150040【摘要】目的临床在开展血培养阳性标本检测中使用两种不同细菌鉴定法,分析两种鉴定方法产生的效果方法随机抽取90例发热患者血液标本，时间为2021年3月到2022年3月，随机将两组患者进行分组，各45例，A组使用常规药敏试验，B组使用直接药敏试验，比较两种不同试验方法的符合率。

结果 90例血液标本中，34例阳性标本，直接法革兰氏阳性球菌、阴性杆菌符合率各为80.00%、87.50%，和常规法无较大差异（P＞0.05）。

结论在开展血培养检验的过程中，使用直接药敏试验方法以及常规药敏试验方法符合率相对比较高。

然而，直接药敏试验花费的时间比较少，操作简单。

【关键词】血培养；两种；细菌鉴定法：药敏试验[Abstract] objective to clinical use in carry out blood culture positive samples of two different bacterial identification method, analysis the effect of the two methods of identification methods randomly, 90 cases of fever patients' blood samples, the time for March 2021 to March 2022, the two groups at random grouping patients, 45 cases, using conventional drug susceptibility test of group A and group B, medicine sensitive experiment using direct comparison the coincidence rate of the two different test method. The results of90cases of blood specimen, 34 cases positive specimens, the direct method of gram positive coccus, negative bacilli coincidence rate was 80.00%, 87.50%, and the conventional method is no big difference (P > 0.05). Conclusions in the process of carry out blood culture test, using direct drug susceptibility test methods and conventional drugsusceptibility test methods coincidence rate is relatively high. However, direct drug susceptibility test time is less, the operation is simple.[Key words] blood culture； Two； Bacteria identification method；Drug sensitive test菌血症及败血症会威胁患者生命安全，这两种疾病具有较高的致死率，所以临床诊断治疗的重点对菌种进行鉴定以及开展药敏试验。