实验2 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶2

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蔗糖酶的分离提纯及酶促反应动力学实验

11.04.2024
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3、蔗糖酶粗品（E1）的制备
①自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀，再于35℃ 恒温水浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象；
②抽提：补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35℃ 恒温过夜， 8000r/min
7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择确
定酶促反应最适条件（温度、pH值、离子浓度等）的方法；
8.学习《正交试验法》中最简单的入门知识：用正交表设计
试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验结果。
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Байду номын сангаас
二、实验原理
前言
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。
② 工作以曲葡线萄。糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出
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3，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作
试号含糖量葡萄糖标准液去离子水 3，5-二硝基水杨酸试剂 A540
（mg）（ml）（ml）
（ ml）
10
0
2.0
3
2 0.4 0.2
1.8
3
3 0.8 0.4
⑥ 保存成品E3
测酶E3活力及蛋白质浓度
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成品E3 计算出E3浓度
周六（全天）上午8：00开始
(1).蔗糖酶米氏常数的测定
(2).用正交法测定几种因素
对蔗糖酶活力的影响
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酵母蔗糖酶的提取分离纯化及其蛋白质浓度和酶活力测定(126)

实验十
酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及其蛋白质浓度和酶活力测定
蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果糖蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式 :

存在于细胞膜外细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50％（质量分数）糖成分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式

存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。
定。
分实验二：蔗糖酶各级分酶活力的测定一、实验目的
掌握蔗糖酶活力测定方法
二、实验原理
蔗糖酶能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-
糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。每
摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解
速率可以通过斐林试剂法测定还原糖的产生数
量来测定。
蔗糖葡萄糖
果糖
蔗糖酶
+
斐林试剂法测还原糖含量灵敏度较高，其原理是：
离心去除酵母菌体而得到蔗糖酶溶液
加热去除热不稳定的杂蛋白
乙醇沉淀获得粗提酶。三、实验材料、仪器和剂实验材料：安琪酵母
仪器和试剂:
研钵，离心管，滴管，量筒，恒温水浴锅，烧杯，高速冷冻离心机， pH值试纸二氧化硅，去离子水，冰，食盐，1mol/L乙酸， 95％乙醇.
四、操作步骤
提取
分转入水相中。
（4）平衡，4℃、10000rpm离心10min （5）将上清液倒入量筒，量出体积并记录，转入清洁烧杯中。（6）用pH试纸检查上清pH值，用1mol/L 乙酸将pH值调至5.0。（7）将其置于50℃的水浴，经常缓慢搅拌，30min。（8）于冰浴中迅速冷却，倒入100ml的离心管中，4℃，离心 10分钟。（9）取上清液，量体积并记录，得粗酶液1，同时预留2.0 ml 测定用。

生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)

生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。

实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。

酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。

但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。

有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。

操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。

蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。

它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。

蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。

本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。

在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。

在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。

关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离 DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。

随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。

这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。

由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。

各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。

酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。

就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。

其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。

浙江大学生物化学丙实验报告

. . . . 实验报告课程名称：生物化学实验（丙）指导老师：方祥年成绩：实验名称：离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶同组学生：金宇尊、鲍其琛一、实验目的和要求（必填）二、实验容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理；2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。

二、实验容和原理（1）实验原理 1、离子交换层析：以离子交换剂为固定相，液体为流动相进行。

离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。

这些过程都是可逆的。

在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。

当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。

离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。

基质电荷基团反离子电荷基团反离子电荷基团反离子基质基质—＋—＋＋可逆交换可逆交换＋＋溶液中的离子（交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖)— ——阳离子交阴离子交换剂专业：农业资源与环境姓名：李佳怡学号： 3130100246 日期： 2015.5.19地点：生物实验中心310装订线由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的目的。

2、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），能催化非还原性双糖（蔗糖）裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。

生化实验报告-离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶

实验报告一、实验目的和要求三、实验材料和主要仪器五、实验数据记录和处理七、实验讨论和心得二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、实验内容和原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的pI 偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。

2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。

（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。

（100℃显色）三、实验材料和主要仪器1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液⑶ 20mmol/L Tris-HCl （1mol/L NaCl ）pH7.3缓冲液 ⑷ 0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器（1）高速冷冻离心机（2）层析柱（φ1.0×20㎝）(1支/组）（3）ÄKTA TM start（1套/组）（4）部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）（5）－20℃冰箱（保存样品用）（6）微量移液枪 200ul、1000ul（7）1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）（8）7ml离心管（留样品Ⅳ用）（9）恒温水浴（50℃、100℃）（10）试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接（1）接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。

酵母蔗糖酶的提取及其性质研究

改变溶液的pH值和盐离子浓度，结合力最小的蛋白质先洗脱下来。
离子交换层析(sephorase DEAE fast flow)
离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）。在纤维素上结合了 DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14NH+，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO-），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
利用一定大小孔隙的具有网状结构的凝胶作层析介质（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等），根据被分离物质的分子大小、形状不同扩散到凝胶孔隙内的速度不同，因而通过层析柱的快慢不同而分离的一种层析法。
离子交换层析
利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶电荷不同，因而与离子交换树脂有不同之吸附力而分离之
2.装柱与平衡：
先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗琼脂糖凝胶几次，装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近
时即可上样。（一般洗2-3个柱体积）
3.上样与洗脱：
上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用30ml 0.02M
pH7.3的Tris-HCl缓冲液和30ml含1MNaCl的0.02mol/L

生物化学实验-离子交换层析

1、仪器连接
AB
开关
A、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓
冲液
B、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，（0.5
mol/L NaCl） pH7.3缓冲液 1.接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置
A，B两个溶液瓶中。注意B为含NaCl溶
液。1：缓冲液阀（Buffer valve） 2. 点2：击混电和脑器桌（面M上ixUenri）corn软件图标，打开软3：件样。品选阀择（SySsatemmplCeovnatrlovel ，）点击OK ，进4：入泵操（作P界u面m。p）点击Connect 3. 在5：操压作力界传面感的器工（具P栏re，ss点u击reMannual Rusne。n出so现r）FlowRate 窗口，调节flowrate 为 61：ml清/m洗in，阀确（定Wa。sh valve）
Wash valve Collector
（1）连接混和器及样品阀，流速调整为1.0ml/min （2）切换至BufferB，直至Conductivity到达40mS/cm （3）连通BufferA，直至Conductivity接近2并平稳，准备装柱
3、装柱和平衡：（1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。（2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（mixer) 相连，下端接头与样品阀（sample valve)相连。
实验器材与仪器
1、高速冷冻离心机 2、层析柱（φ1.0×20㎝）(1支/组） 3、ÄKTATM start（1套/组） 4、部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组） 5、－20℃冰箱（保存样品用） 6、微量移液枪 200ul、1000ul 7、1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用） 8、7ml离心管（留样品Ⅳ用） 9、恒温水浴（50℃、100℃） 10、试管、移液管、试管架等

实验2 蛋白质的分离纯化

实验二蛋白质的分离纯化
离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。二、实验基本原理 1、离子交换层析离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
实验操作方法和步骤
1、离子交换剂准备：(实验室已准备好）
DEAE-Sepharose Fast Flow ，取适量DEAE-Sepharose Fast Flow ，加入0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl溶液，轻轻搅拌，浸泡0.5小时，用布氏漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，
同上，用去离子水洗至近中性，（DEAE-
Sepharose
Fast Flow，用后务必回收）。浸入20mmol/L TrisHCl pH7.3 缓冲液中平衡备用。
2、样品处理：
将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于10ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3
缓冲液；4℃ 12000r/min, 离心10分钟，收集样品上清液（样品Ⅲ）测量总体积(ml数），留取1ml（样品Ⅲ）用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解反应的酶，广泛存在于生命体内，具有重要的应用价值。

本文主要介绍了蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测方法。

一、蔗糖酶的提取1、选择合适的菌株：蔗糖酶广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体中，但不同菌株对蔗糖酶的产生能力存在差异，因此需要根据实际需求选择产酶能力较高的菌株。

2、液态培养：选用适宜的培养基和培养条件，促进菌株生长和蔗糖酶的合成。

一般情况下，最佳培养条件为温度在35℃左右，pH值为7.0左右，培养时间为24-48小时。

3、离心沉淀：将菌液离心，取上清液即为蔗糖酶提取液。

1、离子交换层析：通过调节液相pH值，利用离子交换材料对蔗糖酶进行吸附、洗脱和分离。

2、凝胶过滤层析：利用凝胶材料对蔗糖酶进行筛分，分离出不同分子量的蔗糖酶。

3、亲和层析：在固相材料上引入亲和基团，用于特异性地吸附蔗糖酶，洗脱和分离目标蛋白。

1、透析：通过半透膜对蔗糖酶真空透析，去除杂质。

2、浓缩：利用超滤膜对蔗糖酶进行浓缩。

3、电泳：运用电泳等方法对混合蛋白进行分离和分析，以实现蔗糖酶的纯化。

蔗糖酶的活性检测方法多种多样，以下介绍其中几种常见的方法。

1、邻苯二甲酸法：通过对邻苯二甲酸恒量反应条件下，测量比色产物的吸光度来检测蔗糖酶的活性。

2、甲酚磺酸法：测量甲酚磺酸转化为带电离子的速率，来判断蔗糖酶活性的多少。

3、蔗糖酶显色法：在蔗糖酶的作用下，蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，再利用淀粉-碘酒作为指示剂，显色程度来反映蔗糖酶的活性。

总结：蔗糖酶是一种重要的酶类，在生命科学和工业生产等领域具有广泛应用。

其提取、分离、纯化及活性检测方法多种多样，需要根据不同的实验条件和需求来选择合适的方法。

生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)

酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。

但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。

蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。

蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。

生物化学实验-蔗糖酶的提取

三、实验材料与试剂
1、实验材料市售干酵母粉 10g/组(3～4人）
2、实验试剂
⑴ 石英砂，
⑵ 95% 乙醇(-20℃），
⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。四、实验器材与仪器 1、电子天平（称量样品）； 2、研砵（每组一套）； 3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）； 4、托盘天平（离心管平衡用）； 5、高速冷冻离心机； 6、恒温水浴箱（50℃）； 7、制冰机； 8、1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架； 9、7ml离心管（留样品Ⅲ用）及离心管架； 10、－20℃冰箱。
五、实验操作方法和步骤分组操作：每组3～4人。
1、酵母细胞破碎称取市售干酵母粉10g，约3g石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积50ml 的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min离心15分钟，收集上清液（样品I）并量出体积V1,另留1ml上清液（标注样品I ）放置－20℃冰箱保存，用于后续实验。
七、思考题本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了哪些方法？你认为Leabharlann 有哪些方法可以运用？说说你的设想。
下次实验
实验二离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
实验一蔗糖酶的提取
一、实验目的和要求学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。
二、实验基本原理 1、酵母细胞破碎
细机械法胞破碎的常用方法非机械法
液体剪切法超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法
固体剪切法

实验1 蔗糖酶的提取

七、思考题本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了哪些方法？
你认为还有哪些方法可以运用？说说你的设想。
显示桌面 .scf
下次实验
实验二离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
预习参考资料
李建武等生物化学实验原理和方法
北京大学出版社
赵永芳生物化学技术原理及应用（第三版）科学出版社
3、有机溶剂（乙醇）沉淀：
将热处理后的上清液逐滴加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温
和搅动混匀，至少放置20分钟，然后转移至两支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃，12000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰箱保存，以备用于下周实验——实验二离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶。六、实验结果分析讨论
实验一蔗糖酶的提取
一、实验目的和要求学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。
二、实验基本原理 1、酵母细胞破碎
细机械法胞破碎的常用方法非机械法
液体剪切法超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法
固体剪切法
压力和研磨
物理法、化学渗透法、酶溶
本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。
2、蔗糖酶的初步分离纯化蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进
行初步的提纯。由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯
度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到

蔗糖酶分离纯化与活力测定

考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理
考马斯亮兰G 250在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。在酸性溶液时呈茶棕色 465nm 当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，在10当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm， 10595nm 100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比蛋白质浓度范围内成正比； 100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比；测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，使其测定值在标准曲测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，线的直线范围内根据所测定的A595nm值在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量，根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量， A595nm 从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL) 从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)
热处理和乙醇沉淀
预先将恒温水浴调到50℃ 将盛有粗级分I 50℃， (1) 预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥下保温30分钟，地放入水浴中，50℃下保温30分钟地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。摇离心管。取出离心管，冰浴中迅速冷却， 4℃，10000rpm， (2) 取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离 10min。心10min。将上清液转入小烧杯中，放入冰盐浴（ (3) 将上清液转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇），逐滴加入等体积预冷至乙醇，入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟， 30分钟 10分钟同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。 4℃，10000rpm，离心10min 倾去上清， 10min，以沉淀完全。于4℃，10000rpm，离心10min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“级分Ⅱ ）。后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“级分Ⅱ”）。

生化实验报告离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶

实验报告一、实验目的和要求三、实验材料和主要仪器五、实验数据记录和处理七、实验讨论和心得二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、实验内容和原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的偏酸性,所以在7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。

2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。

（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。

（100℃显色）三、实验材料和主要仪器1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂 ⑴⑵ 20 7.3 缓冲液⑶ 20 （1 ）7.3缓冲液 ⑷ 0.2乙酸缓冲液，4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器（1）高速冷冻离心机（2）层析柱（φ1.0×20㎝）(1支/组）（3）Ä （1套/组）（4）部分收集器及收集试管（4管）（1台/组）（5）－20℃冰箱（保存样品用）（6）微量移液枪 200、1000（7）1.5离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）（8）7离心管（留样品Ⅳ用）（9）恒温水浴（50℃、100℃）（10）试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接（1）接通各仪器电源，将泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。

注意B为含溶液。

（2）点击电脑桌面上软件图标，打开软件。

选择，点击，进入操作界面。

点击（3）在操作界面的工具栏，点击。

实验2 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶2

流动相由于蔗糖酶的pi偏酸性所以在ph73缓冲液的环境中粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和与离子交换剂的亲和力降低把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来从而达到分离蔗糖酶的目的
实验二
记录仪
记
录
右
仪
左侧
设
侧灵敏
纸速
置
度、
等调
说
记录
控
明
面
笔等
板
调
控
面
板
1. Chart speed 调为0.5； Range 调为50(mV)；速度设置为mm/min(按下)；
2. Pen up 用adjust调整笔的位置 Zero 一定要保持在弹起的状态
3. 按下record on和pen down开始走纸
0.8ml～1ml/min，洗去DEAE－Sepharose Fast Flow未吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。用0.15mol/LNaCl 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液继续洗脱被吸附的蔗糖酶蛋白，洗脱流速为0.8ml～1ml/min，4ml/管/5min，直至待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。测定各接收管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，量出总体积（ml数）（样品Ⅳ），并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析以及用于“用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响”（半自主性设计实验），样品－20℃低温保存备用。
离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。
固定相…………..基质电荷基团

蔗糖酶的离子交换层析纯化

蔗糖酶的离子交换层析纯化
蔗糖酶是一种能够水解蔗糖的酶，广泛应用于食品工业、糖化工业以及医药工业等领域。

对蔗糖酶进行纯化是保证其高效、稳定和经济使用的关键。

离子交换层析作为常用的蛋白质纯化方法之一，也被广泛应用于蔗糖酶的纯化。

它基于离子交换树脂与蛋白质之间的静电作用，通过调节pH值、离子强度以及离子性质等条件，实现不同离子性质的蛋白质的选择性吸附和洗脱。

在蔗糖酶的离子交换层析纯化中，通常采用弱阳离子交换树脂作为层析介质，pH值调节在6.0-7.0范围内，离子强度控制在
0.1-0.5mol/L范围内。

在样品加载后，先用缓冲液进行洗脱，去除无关物质，然后通过渐进性提高盐度的方式进行洗脱，以逐步去除吸附于树脂上的蛋白质，直到目标蛋白质被完全洗脱。

此外，为了提高蔗糖酶的纯度和收率，也可以采用多步层析的方法，如离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等，以进一步去除杂质、提高目标蛋白的纯度。

同时，也需要注意在层析过程中保持样品的活性和稳定性，以保证最终产品的质量。

综上所述，离子交换层析是蔗糖酶纯化常用的方法之一，可通过调节pH值、离子强度等条件实现对蛋白质的选择性吸附和洗脱，从而获得高质量、高纯度的蔗糖酶产品。

实验蔗糖酶的提取

⑸ 将实验室产生的实验废物和垃圾倒掉。对于不能做好值日工作的同学，下次实验后应补做。
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四．其他１．上实验课请不要迟到早退，如有事请向任课老师事先请假或
事后说明。２．在实验室里上课时不要玩电脑游戏。
３．进入实验室要衣着整洁，要求穿实验服做实验，不能穿拖鞋
进实验室做实验。实验过程中不要随便串走，保持安静，不
6．严禁在实验室吸烟。
7．禁止在实验室用电炉或明火取暖。
8．实验时，应保持桌面的整洁不乱；实验结束后，应将自己的桌面收拾干净方可离开实验室。
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9．在每次实验结束后，安排卫生值日的同学应自觉地完成以下
工作：
⑴ 收理实验用试剂、器材和仪器。
⑵ 将实验桌上的废液缸中的废物倒掉洗净，并把桌面擦干净。 ⑶ 把使用过的仪器及仪器桌面擦拭干净。 ⑷ 把实验室的地面扫清拖净。
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二．实验仪器使用
1．学生实验使用仪器前，应在教师讲解了使用方法后，或在已学会
如何使用的情况下，方可自己单独操作有关仪器；如违反操作规程，将仪器损坏，应由当事人按规定处理。
2．仪器如果以小组为单位共同使用，某一同学如出现不当操作损坏仪器，则以小组为单位共同赔偿损失。
3．如因教师没有讲解好仪器的使用方法等原因造成学生损坏仪器，应由教师负全责，并按规定处理。
录。请保存好，实验结束后上交，作为实验报告成绩的一部分！
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实验成绩
1、实验报告成绩（纸质版） 70％ 2、实验平时成绩 30％
(1)到课情况（签到、迟到、早退和请假） (2)实验操作，器材、仪器使用 (3)值日情况 (4)实验预习、实验过程和实验记录（实验记录本）

离子交换层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究

S tud ie s on M e thod D e ve lopm e n t of Inve rta s e Ion Excha nge C h rom a tog ram P urifica tion
X U P ei2y a, Q IU L e2quan (Co llege of B io log ica l and Environm en ta l Eng. , Zhejiang U n iv. of T echno logy, H angzhou 310032, Ch ina)
Sep h ro se 314. 8
2. 05
2. 87
110. 3
109. 7
98. 2
293. 4ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
0. 49
0. 92
200. 4
318. 9
43. 4
93. 2
浓缩倍数
2. 03
1. 82
2. 91
4 结语
经过上述几种纯化方法的比较, 采用 Q Sep ha ro se 纯化方法进行实验改进, 具有如下特点。
100m in 缩短到现在的 50m in, 减少不必要的实验重复, 实验过程比较紧凑。
(3) 节约实验支出。离子交换介质D EA E2纤维素由于流速慢, 柱床高度会随缓冲液浓度及 pH 改变, 不能承受 0. 1M 以上 N aO H 清洗, 重生效果差, 寿命短。琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。且其化学稳定性极高, 不易破碎, 可以承受 1M N aO H 的清洗, 重生效果好, 可以使用数百至上千次, 因而降低了成本。
采用 Pha rm acia 公司生产的琼脂糖为基质的弱阴离子交换柱 D EA E Sep ha ro se 16×10 用起始缓冲液 0. 05M T ris2HCL pH 7. 3 缓冲液平衡, 加样, 先用0. 05 M T ris2HCL 缓冲液洗脱, 流速为每分钟 1mL , 然后盐度梯度洗脱, 经 100m in 流动相由 0. 05M T ris2HCL pH 7. 3 缓冲液到 1M N aCL 的 0. 05M T ris2HCL pH 7. 3 缓冲液, 每管收集 3mL , 进行紫外检测 (280nm ) 和酶活力测定。

食品生物化学实验教案

精心整理精心整理食品生物化学实验指导高建华曹劲松宁正祥编华南理工大学二OO 六年三月实定 1 一胶 1 二备 1 2 实析 5 一析 5 二析 6 实验四氨基酸纸电泳分离鉴定-------------------------------------------------------------------7 实验五激活剂、抑制剂、温度及PH 对酶活性的影响------------------------------------9一、激活剂、抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响10----------------------------------------------二、温度和pH值对а-液化淀粉酶活力的影响-------------------------------------------- 1012 实验六果蔬中过氧化物酶活力测定-------------------------------------------------------------实验七酶催化转氨基反应的纸层析鉴定14 -----------------------------------------------------实质17 Array实性质19实取23 实取25实脱盐28 实糖酶303538 实验七43 实验八蔗糖酶的酶活特性研究45------------------------------------------------------------------精心整理辅助性实验实验一蔗糖酶活力测定--------------------------------------------------------------------------46实验二Folin-酚法测定蛋白质含量-------------------------------------------------------------48实验三考马斯亮蓝染料比色法测定蛋白质含量---------------------------------------------- 50 实验四紫外吸收法测定蛋白质浓度51 附表：附表1053附表2实取实物实观察实含量实验实测定-----------------------------------------------辅助性实验：实验一油脂过氧化物值的测定545556 58 60 626667 70 72精心整理----------------------------------------------------------------实验二油脂酸价的测定---------------------------------------------------------------------------实验一果胶的制备和特性测定一、果胶的制备（一）目的要求了解果胶的基本结构、果胶的分类及提取原理和方法。