大肠癌淋巴结抗体Fab段基因的扩增

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抗双股去氧核醣核酸抗体的重组Fab片断之表现及其特性分析

抗雙股去氧核醣核酸抗體的重組Fab片斷之表現及其特性分析
全身性紅斑性狼瘡 (Systemic Lupus Erythematosus，SLE) 是一種具有各式各樣臨床症狀的自體免疫疾病，患者最特別的地方在於血清中有各種自體抗體的產生，其中最常見到的自體抗體是抗雙股去氧核醣核酸抗體 (anti-dsDNA antibodies)，它也被認為是導致SLE最主要的自體抗體，尤其是和狼瘡性腎炎 (lupus nephritis) 有關。在本實驗中，我們利用聚合酶鏈鎖反應 (Polymerase Chain Reaction，PCR) 來放大老鼠融合瘤細胞 (hybridoma cell) 所分泌的腎原性 (nephritogenic) 抗雙股去氧核醣核酸抗體的重鏈 (Heavy chain) 和輕鏈 (Light chain) 基因片段，我們將反應產物選殖入pComb3H載體中，然後利用限制酵素作用於重組DNA，以分析在隨意挑選的菌株中，確認已含有重鏈及輕鏈基因片段，接著再將它們以大腸桿菌來表現Fab片段並分析其免疫特性。利用西方墨點法 (Western blot)、抗老鼠IgG抗體分析後，結果證實8個能夠表現Fab片段的菌株 (T1, T3, T4, T5, T8, T9, T10, 及T11) 都有50 kDa的Fab蛋白存在。酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 則顯示這8 個能夠表現Fab的菌株與dsDNA呈現較低的結合能力。由於DNA序列分析的結果顯示這些菌株的重鏈和輕鏈來自於相同germline的免疫球蛋白基因，因此我們的實驗結果指出抗雙股去氧核醣核酸抗體的Fc片段對於其抗原結合力具有關鍵性的影響。
Expression and cahgaariancsttedriozuatbiole

医学免疫基础习题

医学免疫基础习题单项选择题，每题1分，共100分，在规定时间内可多次作答，最终取同名同号的最好成绩。

1. 现代免疫的概念是 [单选题] *机体抵抗外来异物的功能机体抗微生物的过程机体防御、识别和清除非已的过程，对机体无害机体防御、识别和清除非已的过程，对机体可有害(正确答案)2. 机体杀伤和清除体内异常突变细胞和病毒感染细胞的能力称为 [单选题] *免疫监视(正确答案)免疫自稳免疫耐受免疫防御3. 机体防止外来病原体的入侵及清除已入侵病原体的能力称为 [单选题] *免疫监视免疫自稳免疫耐受免疫防御(正确答案)4. 机体识别和清除自身衰老、损伤的组织和细胞的能力称为 [单选题] *免疫监视免疫自稳(正确答案)免疫耐受5. 机体免疫系统对自身组织成分不应答的状态，称为 [单选题] *免疫监视免疫自稳免疫耐受(正确答案)免疫防御6. 免疫防御功能低下的机体易发生 [单选题] *肿瘤超敏反应感染(正确答案)免疫耐受7. 免疫防御功能过高的机体易发生 [单选题] *肿瘤超敏反应(正确答案)感染免疫耐受8. 胃蛋白酶水解IgG所获片段，正确的是 [单选题] *2个Fab段1个Fc段pFc’段(正确答案)1个Fd段9. 免疫监视功能低下的机体易发生 [单选题] *肿瘤(正确答案)自身免疫病免疫耐受10. 用无毒力牛痘苗接种来预防天花的第一位医生是 [单选题] * KochJenner(正确答案)PasteurVonBehring11. 最早提出克隆选择学说的科学家是 [单选题] *Burnet(正确答案)PasteurPorterJenner12. 最早制备出狂犬病毒减毒活疫苗的科学家是 [单选题] * KochJennerPasteur(正确答案)Behring13. 机体的中枢免疫器官包括 [单选题] *胸腺和脾脏胸腺和骨髓(正确答案)脾脏和淋巴结脾脏和骨髓14. 胸腺的功能不包括 [单选题] *T细胞成熟场所建立自身耐受机体细胞免疫的基础与机体液体免疫毫无关系(正确答案)15. T淋巴细胞来源于 [单选题] *胸腺骨髓(正确答案)淋巴结脾脏16. NK细胞来源于 [单选题] *骨髓(正确答案)胸腺脾脏黏膜相关淋巴组织17. 建立自身耐受的免疫器官组织是 [单选题] *胸腺(正确答案)骨髓淋巴结脾脏18. 免疫器官组织中局部免疫应答发生的部位是 [单选题] *脾脏骨髓淋巴结黏膜相关淋巴组织(正确答案)19. 人类最大的外周免疫器官是 [单选题] *扁桃体淋巴结脾脏(正确答案)胸腺20. 胸腺对前T淋巴细胞的阳性选择结果是 [单选题] *选择出CD4+CD8-T细胞/CD8+CD4- 细胞(正确答案)选择出自身不耐受的T细胞选择出双阳性的T细胞选择出自身耐受的T细胞21. TCR识别抗原的特点是[单选题] *可识别天然的抗原或抗原肽-MHC分子复合物可识别游离的抗原肽只能识别抗原肽-MHC分子复合物(正确答案)只能识别天然的抗原22. 固有免疫分子不包括 [单选题] *防御素补体系统细胞因子抗体(正确答案)23. 人体T淋巴细胞的成熟场所是 [单选题] *胸腺(正确答案)骨髓淋巴结脾脏24. APC提呈内源性抗原的关键分子是 [单选题] *MHC I类分子(正确答案)MHC II类分子共刺激分子黏附分子25. MHCMHCⅡ类分子将抗原肽提呈给类分子将抗原肽提呈给 [单选题] * Th(正确答案)CTL巨噬细胞NK细胞26. 与免疫应答密切相关、决定移植组织是否相容的基因群 [单选题] * MHC(正确答案)CDAMIFN27. 人体T细胞发育过程中，经阳性选择和阴性选择后最终形成 [单选题] * CD4＋CD8＋T细胞；CD4-TCD8-T细胞；对自身抗原敏感的CD4＋/CD8＋T细胞；对自身抗原耐受的CD4＋/CD8＋T细胞；(正确答案)28. 未成熟T细胞在胸腺内进行阴性选择的结果是 [单选题] * T细胞获得对MHC分子限制性T细胞对自身抗原形成免疫耐受(正确答案)T细胞分化为记忆细胞T细胞分化为双阴性细胞29. 抗原分子的免疫反应性是指 [单选题] *诱导机体免疫耐受的特性；诱导机体产生免疫效应物质的特性；与大分子载体结合的特性；与免疫应答产物发生特异性反应的特性。

抗EV71病毒人源抗体Fab段表达基因的构建及序列分析

单克隆抗体库奠定基础。方法从ＥＶ７１病毒中和抗体阳性且免疫功能健全的成人全血中，分离淋巴细胞并提取总ＲＮＡ，经
反转录获得ｅＤＮＡ。用一组人ＩｇＧＦａｂ基因特异性引物，从合成的ｃＤＮＡ中分别扩增抗体轻、重链可变区，应用重叠ＰＣＲ技术构建Ｆａｂ段表达基因，测序分析抗体基因的多样性。结果成功扩增人抗体可变区基因并组装Ｆａｂ段表达盒，表达盒的长度约为１５００ｂｐ，测序分析结果表明，Ｆａｂ段的多样性可达９４．１２。结论成功构建入源抗体Ｆａｂ段基因，为抗ＥＶ７１病毒人源性单克隆抗体库的制备奠定了基础。
ＦａｈｆｒａｇｍｅｎｔｓａｇａｉｎｓｔＥＶ７１．ＴｏｔａｌＲＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄ［ｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｏｆａｎｏｒｍａｌａｄｕｌｔｔｈａｔｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｗｉｔｈＥＶ７１ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｗｉｔｈｔｈｅｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｃＤＮＡｓａｓｔｅｍｐｌａｔｅｓ。ｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｇｅｎｅｓｏｆｌｉｇｈｔａｎｄｈｅａｖｙｃｈａｉｎｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙｈｕｍａｎＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｉｍｅｒｓｅｔｓ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｓｆｏｒＦａｂｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｓｐｌｉｃｉｎｇｂｙｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲ（ＳＯＥ — ＰＣＲ）．Ｉｔｗａｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｂｙｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｂｔａｉｎｅｄ１５００ｂｐａｍｐｌ —

抗角蛋白Fab抗体在大肠杆菌中的表达与复性研究

·论著·文章编号:1007-8738(2004)04-0441-03抗角蛋白F ab 抗体在大肠杆菌中的表达与复性研究樊建勇1,王　刚1,李　巍1,吴元明2,刘玉峰13(第四军医大学:1西京医院全军皮肤性病中心;2基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西西安710032)收稿日期:2004-02-25;　修回日期:2004-03-16基金项目:国家高技术研究发展计划(863)资助(N o.2001AA215361);国家自然科学基金资助项目(N o.30371650)作者简介:樊建勇(1972-),男,山西原平人,博士生.T el :(029)83375406;Email :fanjiany ong fmmu @3C orresponding authorExpression of human F ab antibody against keratin in E.coli and its renatu 2rationF AN Jian 2yong 1,WANG Gang 1,LI Wei 1,WU Yuan 2ming 2,LIU Yu 2feng 131Dermatology Center of Chinese P LA ,X ijing H ospital ;2Department ofBiochemistry and M olecular Biology ,F ourth M ilitary MedicalUniversity ,X i ’an 710032,ChinaAbstractAIM :T o expre ss Fd fragment and L chain of human anti 2keratin Fab in E.coli BL21(DE3)re spectively and obtain human anti 2keratin Fab by renaturation in vitro.METH ODS :Gene s of L chain and Fd fragment of anti 2keratin antibody from the pla smids p3MH/Fab were subcloned into vector p ET 32a re spectively.The recombinant pla smids p ET L and p ETFd were transformed into E.coli BL21(DE3)and induced to expre ss with IPTG.Fd fragment and L chain inclusion bodie s were solubilized and com 2bined in equal molar ratio in the refolding solution.The renatured Fab wa s characterized by SDS 2PAGE ,We stern blot and E LISA.RESU LTS :Fd fragment and L chain of human anti 2ker 2atin Fab were efficiently expre ssed.E LISA and We stern blot showed that the renatured Fab could bind with human keratin.CONC L USION :The succe ssfully prepared anti 2keratin Fab with binding activity to human keratin laid a solid foundation for its fur 2ther application.K eyw ords :Fab ;keratin ;expre ssion ;renaturation摘要目的:用大肠杆菌分别表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd 片段,体外复性得到Fab 抗体。

人结直肠癌BRAF基因V600E突变阐述

人结直肠癌BRAF基因V600E突变阐述目前，临床中有超过30种BRAF突变类型，大约90%突变处在第15外显子，而V600E突变则是最为常见的一种突变。

本文将人BRAF基因V600E突变位点作为等位基因特异性扩增引物，经等位基因特异性扩增技术检测且与金标准Sanger测序法，分析其可行性。

1 资料与方法1.1 一般资料选用的人大肠癌SW480、HT29细胞均通过测序显示为BRAF野生型、携带BRAFV600E杂合突变。

80例结直肠癌标本均由医院病理科提供。

其DNA肿瘤组织切片通过镜检显示肿瘤细胞水平超过90%。

1.2 方法提取DNA，并将模板DNA放置到-20℃环境内保存。

等位基因特异性扩增法：将人大肠癌细胞株SW480、HT29与80例肿瘤标本予以等位基因特异性扩增，PCR体系总体积是20μL ，含有Mg2+buffer2μL，dNTPmixture1.5μL，上、下游引物各有0.5μL（10μmol），模板DNA30ng，置入灭菌去离子水达到20μL。

通过95℃预变性30s；95℃变性10s；67℃退火20s；72℃延伸30s，总45个循环进行反应。

将肿瘤标本取出1μL进行第一次扩增，并将其产物用作二次扩增物，采用同样扩增方法。

将PCR产物采集5μL实施琼脂糖（2%）凝胶电泳，持续30min，然后予以显像。

标本与细胞株均通过PCR测序且对比等位基因特异性扩增的结果。

PCR反应条件为：含有Mg2+buffer2μL，dNTPmixture1.5μL，上、下游引物各有1μL （（10μmol），模板DNA30ng，置入灭菌去离子水达到20μL。

通过95℃预变性30s；95℃变性10s；54℃退火20s；72℃延伸30s，总40个循环。

将PCR 产物通过琼脂糖（2%）凝胶电泳显示目的条带扩增完成后进行测序。

采集SW480、HT29细胞株DNA，通过核酸定量仪进行定量，达到30ng，依据一定比例通过携带BRAF野生型（SW480）的核酸与包含BRAFV600E突变（HT29）的核酸相混合，获得包含50%、25%、12.5%、6.2%、3.1%、1.5%的突变DNA混合模板，然后再分别采集30ng实施等位基因特异性扩增，且对比普通PCR后测序的灵敏度。

生物制药细胞工程单克隆抗体

专一性反应
交叉反应
沒有反應
2
123
2
1 2 3 1’ 2 0x
yz
Ag A
Ag A’
Ag B
+
?
-
可生产有用抗体的淋巴細胞若与癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。
癌细胞可培养生长
浆细胞 B cell 可分泌抗体一個 B cell 只产生一种抗体
YY Y
Y YY
YYY
YY YY Y
Elan
Elsai Eli Lilly Genzyme Transgenics Genentech Genmab Hoffman-La Roche ICOS Pharm IDEC Pharm/Mitsubishi ImClone Sys Immunotech Kanebo Knoll Pharm
LeukoSite Medarex Medimmune Norvartis Ortho Biotech Pasteur-Merieux Progenics Protein Design Lab Schering SmithKline Beecham Tanox Biosystems Techniclone Xoma Zenyaku
所用材料必须是新鲜或低温保存的
洗去血迹及污物
脏器进行灌洗
NS内含0.5g／L NaN2
去除包膜或结缔组织
冷浴中组织剪碎
装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液
上清液澄清
去除细胞碎片及微小组织
3000r／min×10min
取上清液
离心
NS稀释至 2～5%
绵羊红细胞的制备流程图
摇动 1520min
Xoma

大容量非免疫人源性fab噬菌体抗体库构建及初步筛选

二结果与分析（一）总ＲＮＡ的提取提取人外周血淋巴细胞总ＥＮＡ，经１％琼脂糖凝胶电泳后可见２８Ｓ和１８Ｓ两条清晰条带（图４），表明提取的总Ｐ，ＮＡ完整性较好，可作为模板进行转录。

图４淋巴细胞提取总ＲＮＡＦｉｇ．４日ｅ曲ｏｐｈｏｒｅ５ｉｓｏｆｔｏｔａｌＲＮＡ白ｏｍｌｙｍｐｈｏｃｙｔｃｓＭ：ＤＬＭａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）（二）ＰＣＲ扩增重链（Ｆｄ）和轻链（、＿，ＣＬ）基因以ｃＤＮＡ第一链为模板，以轻链和重链Ｆｄ段特异性引物的不同组合进行ＰＣＲ扩增轻链基因和Ｆｄ，１％琼脂糖凝胶上电泳显示，纯化的轻链和Ｆｄ段扩增产物于７００ｂｐ左右处可见较亮的特异性条带（图５，６）。

图５纯化的轻链基因ＰＣＲ扩增产物Ｆｉｇ．５ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｉｇｈｔｃｈａｉｎＭ：ＤＬＭａｒｋｅｒｆＤ屯２０００）Ｌｉ∞ｌ－７：Ｐｒｏｄｕｃｔｏｆ±７００ｂｐｉｓｅｘｐｅｃｔｅｄ圈６纯化的重链侧）基因ＰＣＲ扩增产物Ｆｉｇ．６ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｄｆｓａｇｍｅｎｔＭ：ＤＬＭａｌｋｅｒ（ＤＬ２０００、Ｌｉｎｅｌ－８：Ｐｒｏｄｕｃｔｏｆ士７０曲ｐｉｓｅｘｐｅｃｔｅｄ（三）噬粒ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ的鉴定自转化了ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ的大肠杆菌ＸＬｌ－Ｂｌｕｅ中提取质粒，以ＳｐｅＩ和ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ和Ｓａｃｌ分别双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳显示分别释放出３００ｂｐ和１２００ｂｐ外源片断（图７）。

圈７提取的噬粒ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ醇切电泳Ｆｉｇ．７ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｍｉｓｏｆｐＣｏｍｂ３ＸＳＳｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍ轧１－ＢｌｕｅＭＩ：ＤＬＭａｒｋｅｔ（ＤＬｌ５０００）Ｍ２：ＤＬＭａｚｋｃｒ（ＤＥ２０００）Ｌｉｎｅｌ－３：Ｄｏｕｂｌｅ－ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＳａｃＩａｎｄＸｂａＩＩＪｎｅ４－６：Ｄｏｕｂｌｅ－ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＳｐｃＩａｎｄＸｈｏＩ（四）轻链插入的鉴定随机挑取ＬＢ—Ａ（Ａｍｐｌ００／“ｇ／ｍ１）平板上１０个转化菌落，分别提取质粒后以ＸｂａＩ和Ｓａｄ双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳显示，其中８个释放出７００ｂｐ左右的片段（图８），即相应质粒中有轻链基因片段，插入率为８０％。

可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析

可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析PILII!…,】l,,v,ResearchPapers墨滋龃可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析朱进㈤赵萍lI2焦永军王昕"曹伯良,卜冯振卿"管晓虹"fl'南京医科大学卫生部抗体技术重点实验室,南京210029;)VrdnAndelResearchInstitute,AntibodyLaboratory,MI,49503,USA;,南京军区军事医学研究所,南京2100021摘要应用噬菌体展示技术制备抗Met(HGF受体,'个与肿瘤发生,侵袭和转移相关原癌基区l产物)特异性,高亲和力的全人Fab片段.Fab基因分三步合成,以从错配PCR突变库中筛选出的Fab基因可变区为模板,扩增VH和VL基因,分别与CHl,CL基因融合,合成Fd和L基因,再拼接合成Fab基因,克隆于pComb3XSS中,构建Fab次级抗体库.经细胞筛选和固相筛选,获得高亲和力阳性克隆.工程菌经IPTG诱导表达,SDS—PAGE和蛋F1质印迹分析,在25ku和27ku出现预期大小蛋白质条带.Fab分子经流式细胞术,免疫沉淀,细胞免疫荧光检测,结果表明,Fab能够与sll4和MKN45细胞膜上的Met胞外区特异性结合,而与阴性细胞NIH3T3不结合.抗体内化分析显i,Fab 能够与标记肥皂草毒素(ZAP)的抗人IgG结合,并进入细胞内,抑制Met阳性细胞的牛长,揭示该抗体能够与Met特异性结合,并H被细胞内化.该抗体有望成为肿瘤临床诊断或治疗的候选分子.关键词肝细胞生长因子受体,噬菌体抗体库,亲和力成熟,内化抗体学科分类号Q78随着恶性肿瘤对人类健康威胁的加剧,抗肿瘤研究已成为当令生命科学中极富挑战性且意义重大的领域.研究发掘选择性作用于特定靶点的高效,低毒,特异性强的新型抗癌药物是当今抗肿瘤药物研究的重要方向.而以酪氨酸激酶为靶点的药物研发已成为国际抗肿瘤药物研究的热点[121.目前为止, 已有十多种蛋白酪氨酸激酶抑制剂和抗体进入临床或临床前试验阶段,并取得了令人鼓舞的治疗效果,如1998年美国食品和药物管理局(Foodand DrugAdministration,FDA)批准Herceptin用于治疗某些HER2阳性的转移性乳腺癌f31.蛋白酪氨酸激酶有近6O种,分属2O个家族,其中包括HGF受体Met家族.目前已开展针对HGF/SF和Met的肿瘤治疗,包括应用HGF/SF受体的反义核酸分子,小分子RNA,酪氨酸激酶抑制剂,HGF/SF或/和Met拮抗剂以及抗Met或抗HGF/SF的抗体等『4~叼.2O世纪9O年代重组DNA技术促进了鼠源抗体的临床应用,有上百种抗体药物已进入临床或后期临床试验,如抗肿瘤抗体药物Herceptin,Rituxan等在美国相继批准用于临床,单抗治疗得到了迅速发展,成为生物技术药物研究开发的热点【7j.为了克服单克隆抗体分子质量过大,免疫原性强等缺点,科研人员发展了嵌合抗体,人源化抗体,天然全人抗体以及转基因小鼠等技术,在此基础之上开发出许多小分子抗体片段【81.由于基因工程抗体自身的特点,使其在肿瘤的导向治疗,抗病毒治疗,基因治疗及临床诊断等方面均得到发展,具有广阔的应用前景.本研究以Met为靶标,以噬菌体抗体展示技术为平台,通过抗体重链与轻链互补决定区(CDR.H和CDR.L1部分基因的突变,构建抗Met通讯联系人.Tel:025—86663100,E-mail:*******************.cn 收稿日期:2006—05—31,接受日期:200609.3074生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.的次级抗体库,筛选高亲和力,可内化的抗Met全人基因工程小分子抗体,为研制抗肿瘤药物,肿瘤的诊断和临床治疗提供新的选择.1材料与方法1.1载体和菌株噬菌粒pComb3XSS和pComb3XTT由Barbaslaboratory.theScrippsResearchInstitute惠赠,XL1.Blue购自Invitrogen公司,TOP10F为Stratagene公司产品.1.2工具酶,酶标抗体和引物Taq酶,T4DNA连接酶为Invitrogen公司产品,I内切酶为Roche公司产品.HRP标记的抗M13抗体购自AmershamPharmaciaBiotech公司,Rhodemine标记的抗人Fab购自Sigma公司,FITC标记的抗兔IgG标抗体购自JacksonImmunoresearch公司,其他常规试剂均为Invitrogen和Sigma公司产品,Fc—Met融合蛋白购自R&D公司.实验中所用引物由lnvitrogen公司合成.1.3细胞株S114细胞为稳定表达人Met蛋白的NIH3T3转化细胞株;MKN45为过表达Met的人脑胶质瘤细胞株.培养液为DMEM加入10%FBS,培养条件为37℃,5%CO.1.4抗MetFab抗体次级库的构建1.4.1根据实验室筛选出的全人抗MetFab抗体重链和轻链基因的互补决定区列和Kobat抗体库基因序列数据,设计并合成数/,J核苷酸引物,分别在CDR—Hl,CDR—H2,CDR—H3,CDR—L2和CDR—L3引入有限突变和随机突变.1.4.2以经过错配PCR突变和亲和力初步成熟并筛选出的抗MetFab抗体重链和轻链可变区基因为模板,通过不同引物的配对组合,VL1NL3,VL2/VL4在轻链可变区CDR—L2,CDR—L3引进随机突变,VH2/VH6,VH1/VH4(VH3/VH6),VH1/vH5在重链可变区的CDR—H1,CDR—H2, CDR—H3引入有限突变或随机突变,合成高度多样性的重链可变区基因和轻链可变区基因,经重叠延伸PCR,扩增并拼接合成VH和vL基因库.1.4.3pComb3XTT重组载体为模板,扩增重链,轻链恒定区基因.重链与轻链可变区基因vH,vL和IgG1的CH1,CL为模板,经重叠延伸PCR合成Fd和L基因,将Fd和L基因融合,经3轮PCR合成编码Fab基因.1.4.4Fab基因和pComb3XSS载体分别经I酶切,纯化和连接后,重组质粒用电转化法导入感受态大肠杆菌XL1一Blue中.1.5抗Met特异性内化抗体的筛选1.5.1基于活细胞表面受体的抗MetFab抗体的筛选.以转化并稳定表达Met基因的细胞系S1l4为阳性靶分子进行筛选,以NIH3T3细胞作为阴性筛选细胞.将新鲜制备的,约10"噬菌体抗体首先与S114的前体细胞NIH3T3(Met一)相混合并孵育一定时间,去除抗体库中能够与NIH3T3相结合的非特异性抗体.孵育混合物的上清再与S114细胞(Met) 共同孵育,用完全培养液洗涤细胞10次.将细胞重悬于适量的培养液中,置于细胞培养箱,37~C孵育1h,让结合于细胞表面的噬菌体抗体内化.用甘氨酸缓冲液(pH2.8)洗涤细胞,去除未内化但仍结合于细胞上的噬菌体抗体.冻融并超声破碎细胞,胰酶消化被内化的噬菌体,感染大肠杆菌XL1一blue, 进行下一轮的扩增和筛选.1.5.2噬菌体抗体的固相筛选.将经过NIH3T3/S114细胞系5轮阴性/阳性细胞筛选并富集的噬菌体,进一步用固相抗原筛选.加入经细胞筛选的噬菌体抗体于Met抗原包被的免疫板中孵育,37~C1h.用不同的洗涤试剂如PBST或NHSCN经过多次不同强度的洗涤,去除未结合或者亲和力比较弱的噬菌体,胰酶消化结合在抗原上的噬菌体,感染大肠杆菌XL1一blue,进行下一步分析.1.6Fab的表达与纯化取PhageELISA值最高的克隆,构建TOP10表达工程菌,取单菌落过夜培养并经IPTG诱导表达.表达上清与细菌沉淀高渗提取上清混合,经FPLC纯化,与ProteinL结合的Fab经洗脱和透析处理后,用于活性分析.1.7Fab的免疫学特性分析1.7.1ELISA分析.用羊抗人IgG2mg/L包被酶联板,4℃过夜,次日用封闭液37℃封闭1h后洗板,加入Fc—Met融合蛋白4℃过夜.次日用封闭液37℃封闭lh后洗板,加入梯度稀释的Fab抗体,37~C孵育lh洗板,加入l:l000稀释HRP标记的羊抗人Fab,37~C孵育lh后洗板,显色,酶标仪测A吸光度值.1.7.2免疫沉淀.将Sl14,MKN45和NIH3T3细胞裂解液经冻融,超声和离心后,分别取lml上朱进等:可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析?75? 清夜加入10g的Fab,4~C旋转孵育2h,加入洗涤后rProteinG50l,4~C旋转孵育过夜.样品经PBST2次洗涤后,加入5012xSDS.PAGE电泳上样缓冲液处理,蛋白质印迹检测.1.7.3流式细胞术分析.用S114和NIH3T3细胞在4℃条件下3%BSA封闭15min,洗涤后加入Fab,4"C孵育30min,加入FITC标记的羊抗人Fab,4℃孵育30min.细胞经PBS洗涤两次后,用FACSCaliburcytometer检测,CellQuest分析软件分析(BectonDickinson,Heidelberg,Germany).1.7.4免疫荧光双染检测.将MKN45和NIH3T32种细胞同时培养于同一细胞室中,固定后用封闭液室温封闭30min,同时加入Fab和兔抗人Met抗体,37℃孵育1h.加入Rhodemine标记的抗人Fab和FITC标记的抗兔IgG2种二抗,37~C孵育1h,PBS洗涤后用DAPI染色,LeicaTCSNT激光共聚焦显微镜分析.1.8亲和力测定参照文献[9],用非竞争ELISA法测定抗体的亲和力.1.9Fab内化特性分析为分析Fab分子的内化,用标记肥皂草毒素(saporin1的抗人IgG的Hum—ZAP间接标记Fab分子.肥皂草毒素能够与细胞核糖体亚基结合,抑制细胞蛋白的合成,引发细胞的死亡.Hum—ZAP为连接有肥皂草毒素的抗人IgG,能够与人源抗体分子IgG或Fab特异性结合,被具有内化特性的抗体分子带入细胞内,抑制细胞的蛋白质合成.Hum—ZAP 与抗MetFab按比例混合后,加入培养有NIH3T3和Sl14细胞的96孔培养板中,MTS/PMS法检测.2结果2.1抗Met次级抗体库的构建Fab基因合成分3步进行(图1,2).Fab抗体基因和pComb3XSS载体分别用I酶切,经胶回收并定量后,16℃连接过夜,多次电转导入感受态大肠杆菌XL1一blue,获得了库容为8.96x10.全人抗MetFab抗体库.随机挑取转化克隆,提取重组质粒.DNA测序结果表明,在18个VH和16个VL克隆中,序列正确的克隆分别为15个和13个,其正确率分别为84.2%和83.3%.()臣王懑口ll_[][二二OmpAvLCLpelBpelBvHCHl(d)■■【二二Fd二匿■■[二Fab/[_[二].+---//pLacZFabgene~IFig.1SchematicoutlineoftheapproachusedforFablibraryconstructionLight-chainandheavy—chainFdfragment—encodingDNAsequenceswereamplifiedindependently,fusedbyoverlap—extensionPCR,andcloneddirectionallybyusingtwoasymmetricsitesoftherarecuttersfiI.F abWastranscribedas asingledicistronictranscriptunderthecontrolofoneLacZpromoter. Theamberstopcodon(cross)betweentheantibody genesandbacteriophagegeneⅢenablestheproductionofsolubleFabfragmentsinanon—suppressorstrainofEcoli.(a) Thegenesforthevariableandconstantregionswereamplifiedseparately.(b)Heavy—chainFdandlightchainDNAswere assembledbyvariableregionsandtheirconstantcounterpartrespectivelyusingoverlapPCR .(C)FdandlightchainwerefusedtOformFab—encodingsequencesbyoverlapPCR.(d)FabgenesweredirectionallyclonedintopComb3X SSphagemidbymakinguseoftheIsite.bp65O—+850—400—300一生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.Fig.2ThreeroundsnfPCRforFabrepertoirecloning:DNAladderfbps).2Fah:3Fdfi'agmemofhea~'chain4:I.ign1 "chain;j:Constantregionlighlchain:6:Con~tamc)nofheavy chain:7V ariablere,on01lightchain:.V adablcregionofheavy chain2.2阳性噬菌体抗体克隆的筛选经过5执NIH3T3,,'Sl14细胞筛选和2次固州筛选的噬菌体.感染大1j而十十菌xL1一Blue,随机挑取80个克隆以phageELISA进行咎定,t}-66个为阳性克降阳性牢为825%选取PhageEL1SA检测结果较高的阳性兜隆.过夜培养后提取质串盘许测序.DNA序列分析结果表明,10个【确序列中,有2种不同的『列,分别为Fl和F2F】为8个,F2为2个重复PhageELISA结粜表ll』j.Fl的^.值最高_}鞍稳定.提示F】可能足和力较高的克隆.2.3抗MetFab抗体的表达及纯化Fab诱导表达结果显示.温度对Fab分泌性表达影响较大.在37℃条件下,培养}清未见Fab蛋白.在25℃和20℃时.上清中出现Fab,表达量较低诱导表达前的培养液II加入2%萄褚抑制基础表达.新鲜培养液重悬卸l蔚,;01l八fa1ku36—22—--IFig.3SDS-PAGEandWesternblotanalysisofpurified Fabfa}Fabcoomassiebluestaining.,Standardmol~utemassmarker.j: Fab;m1WestemblotofFobIPTG在25℃条件F诱导表达.{J_硅提高Fab的分泌.表达最l3).2.4抗MetFab抗体免疫学特性分析FobELISA榆测分析我刚.Fab稀释滴度从40糟剑2560倍时,^.Corr值从()782降低剑0I】2(Blank0078l;纪嫂淀结果硅示,Fab能够结台sl14干uMKN45纠抛中的Met}jJ_『体蛋白(17Oku)千¨Met功能赁1(140ku){41.12jku=::Met170—-{:;MetL40一::=:Fig.4[mmunopreeipitathmandWesternblotanalysisofFob Metprotemfromcellexlmcts…immunoprecitatedwithFaband dcl~clcdbyW~lemblolanaly4s,2MKN45S1I4andNIH3T3 celllysatc~mnlunopreclpitalcdwithFab:{:g1I4[ysalconly:5.6: MKN45andSII4celllv--ale1ml1_unaprecipltaledw~thoulFah FACS分所结果显示该Fab抗体能够与犬鞋表达Met基因的S1I4细胞特性结台.与:刘j蛙细胞NIH3T3胞没有构结合(罔51荧光烈染结果挺I归,Fab抗体引驯-r2细胞MKN45的结合信号.抗Met的彩克隆抗体信号番,而阴对州钏胞NIH3T3基本没有信号(6l,显示Fob抗体是特异性结合丁划胞表面的HGF受件Met蛋臼以们f究结果表明.Fab分子具有与Met胞外I的灭然构象结合的能力柯l特异陀,萁亲和常数,14763×10mol/L,i突变前抗体的亲霉J力Kd值5.24xl0mol,'Ll丰HlE,提一断约90倍.2.5抗MetFab抗体内化特性分析MTS,,'PMS榆}结果示,100ngFal0(】ngHum—ZAP能够有效抑制细胞的生长DIl入的药物增加I圳胞生长抑制摩电I孵增r'加八的Fab,"Hum.ZAP量从l∞ng增加剑800ng叫,孵育96h后,圳咆牛抑制率2599%提高到7338%,而仅加入抗体或毒豢的sI14细咆和加入两者混台物的NIH3T3细胞晌}乏未受明显影响(罔7).该结果提,Fah分子能够s114细胞表面的Met特异性结台.并HlJ成的抗原一抗体复合物能够被转入细胞内此该Fob分子I-rJHJ偶联抗f=ll}j癣的毒素,化学药物或放射性物质.作为肿痛牛物治疗的性选分子)lcn¨{l20l帅4|l朱进等:可内化的人源抗r~lel基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特畦分析F#5rhebindingabilityqpFFabwtesledbyFAt'SanalysisNIl1I3……lhl川wilhhh…1l川-Ⅲda…tihLlm口1]nh0u,【mJ]liLt)l¨witlnl㈨l4cl……cubawilhhb帅lIIT(咄…nnli-IFal,'¨岫Ivc"dl……1n…}ahfrc…IJ1c1¨gn(loealiLufl●l¨deteeti¨i1i (I)F?lhand_uhbilnII.MIanlFh●Jdy,andRh..damln.c0Ⅷadanti-FnI,mibod)a『IdFIq(-conjugatedanti—rahbilantibodMKN45klllt~NiltlIccll~wlLuh[ir~dⅢtP1c.…lch口ⅢbcFjg?7InhibitionratioonSI14cell,aryingccIllr…liFabnndIlun-ZAI,in96h●bab;=/Ap:-FabizAP3讨论77HGF受诈(Met)客脆以异策¨帕形^.世卅个50ku"刊个145kIl岫B,"p.,【肚以航键十『i琏.q,他J肚仆.Bl,}{f胞外Ji,』々}ff…地目『x3j仆爿i』,}地～斛氨腹馓怖Mcl自J呲ff-7.s川u也【【Ir(hepaLocytegrowthfactor,HGF),',fj_【【J(scat~etlhctortSF)Me1HGF/SF1痈,帅帆删K朦瓢眦)黼帛,r惭煽帆『订别癌和腑城惭等gm豪哒J此Met已戚『:物淆疗的怀.凡源执Met节m～__一∞l_l==一_.』㈣如m0tlIl1_l…78生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys. 工程抗体成为较好的"导弹"本实验室从天然抗体库中筛选出抗MetFab分子,但其亲和力较低,需进行亲和力成熟,而抗体库的筛选是抗体亲和力成熟的重要步骤.抗体库的筛选策略直接影响筛选的结果.目前,有固相筛选,液相筛选和活细胞筛选等方法,不同的方法各有优缺点,需要结合实验目标进行选择和优化组合.在本研究中,首先选用Met过表达细胞Sl14和阴性细胞NIH3T3进行5轮消减筛选,再用Met包被的免疫板筛选2轮.细胞筛选的优势是,细胞表面膜蛋白多经过翻译后修饰,具有特定的空间构象,筛选出的抗体能够高效,特异地结合靶标,可以直接用于体外或体内的研究.固相筛选可以提高筛选的特异性和筛选效率【l31.实验结果表明,利用该方法获得的随机克隆的阳性率为82.5%.在抗体筛选过程中,洗涤的严谨性和洗涤强度对实验结果同样有着明显影响.洗涤强度过弱,出现较高的假阳性,超过85%的克隆含空载体或截短的抗体基因片段.因为噬菌粒较小的噬菌体,包装速度相对要快,外源蛋白的毒性也影响着噬菌体的增殖.在宽松的洗脱条件下,经过几轮扩增,这些非特异的噬菌体会迅速增~jH[14,151.在抗体免疫学特性分析中,采用酶联免疫,免疫沉淀,流式细胞术,细胞双染等方法,从多个方面验证该抗体的特异性.在ELISA检测中,采用真核表达的Met抗原包板,使筛选和鉴定抗原尽可能与细胞表面的抗原结构相一致,细胞筛选和固相筛选相结合,提高了筛选的效率.在II)和FACS中,用Sl14细胞(Met转化的NIH3T3细胞)和NIH3T3细胞作对照研究,提高了实验结果的准确性,用两种荧光染料和抗Met特异性单抗scFv,同时检测培养在同一培养室中的MKN45和NIH3T3,保证了实验结果的可靠性.基因工程抗体具有免疫原性弱,组织穿透能力强,便于大规模生产等优点,但抗体的亲和力仍然是人源基因工程抗体临床应用的瓶颈.已有的文献表明,大量的研究工作致力于高亲和力抗体的筛选.Weinstein等的研究认为,过高的亲和力抗体导致位阻效应的产生,影响抗体的穿透力,尤其是针对实体瘤的抗体.抗体的亲和常数达到10～10一s具有较好的临床应用价值1.在本研究中,抗体的亲和力从值5.24x10mol/L,增加到4.763×10mol/L,提高约90倍,同时保持与Met胞外区结构域的结合特异性,通过与特定抗肿瘤药物偶连,可强化临床治疗效果11,从而为肿瘤的临床治疗提供候选药物.参考文献lFabbroD,RuetzS,BuchdungerE,et.Proteinkinaseastagetsfor anticanceragents:frominhibitorstousefuldrugs.FharmacolTher. 2002,93(2～3):79~982ShawverLkSlamonD,UllrichA.Smartdrugs:tyrosinekinase inhibitorsincancertherapy.Cancercell,2002,l(2):117--1233CiardielloF,TortoraG.Anovleapproachinthetreatmentofcancer: targetingtheepidermalgrouthfactorreceptor.ClinCancerRes, 2001,7(1O):2958~29704MatsumotoK,NakamuraT.NK4(HGF—antagonist/angiogenesis inhibitor)incancerbiologyandtherapeutics.CancerSci,2003,94(4):321～3275CaoB,SuYL,OskarssonM,eto1.Neutralizingmonoclonal antibodiestohepatocytegrowthfactor/scatterfactor(HGF/SF) displayantitumoractivityinanimalmodels.ProcNatlAcadSciUSA,2001,98(13):7443~74486BorowiakM.Metprovidesessentialsignalsforliverregeneration. 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ThepurifiedFabwasverifiedbySDS—PAGEandWestemblot,whichshowedtwobandsatabout25kuand27ku attheexpectedsizes.ToanalyzetheimmunologicalcharactersofFabforMetbinding,flowcyt ometryand immunoprecipitationassaysweresetupandcarriedoutwithS114,MKN45andNIH3T3celll ines.Theresults demonstratedFabcouldbindnativeMetspecificallyontheS114andMKN45cellsurface.Inv itrocytotoxicassayshowedthatonlyHum—ZAP/anti—MetFabcomplexcouldinhibittheMetpositivecellgrowth,itilluminatedthatanti—MetFabboundtheMetonMetpositivecellsurfaceandwereinternalized.ForMetnegativecel llineNIH3T3, nosignificantinhibitionamongthedifferentdosagesofFabandHum—ZAP.Theresultsshowedthatanti—MetFab antibodyfragmentscouldrecognizeMetextracellulardomaininnativeconformationwithre lativelyhighaffinity.Importantly,theseantibodyfragmentswereabletobeinternalizedintoMetover—expressedtumorcelllinesthroughbindingtotheMetreceptor,andcouldbeappliedasapotentialpowerfulreagentsforcl inicaltherapy.Keywordshepatocytegrowthfactorreceptor(Met),phage—displayedantibodylibrary,affinitymaturation,internalizedantibodyCorrespondingauthor.Tel:86—25—86663100.E—mail:*******************.cn Received:May31,2006Accepted:September30,2006'。

基因拷贝数变异与肿瘤的关系

基因拷贝数变异与肿瘤的关系在人们的日常生活中，我们经常可以听到肿瘤这个词汇。

肿瘤是一种常见的疾病，它可以在人体的任何一个器官内部形成。

许多因素可以导致肿瘤的发生，其中包括基因拷贝数变异。

基因拷贝数变异是指一个基因在一个体细胞中重复或缺失的拷贝数。

它在人类的基因组中非常普遍，然而，大多数变异对身体功能没有影响。

但是，一些基因拷贝数变异可能会增加某些疾病的风险，包括肿瘤。

基因是人类体内的遗传信息的承载者，拥有正常的基因拷贝数可以确保人类身体正常发育和正常功能。

然而，当基因拷贝数变异后，它可能会导致基因过度或不足表达，从而影响细胞的生长和分化，引起肿瘤的产生。

此时，肿瘤细胞内的基因拷贝数变异会比正常细胞更加明显。

为了更好的研究基因拷贝数变异与肿瘤之间的关系，我们需要先了解一下基因拷贝数变异的类型和机制。

基因拷贝数变异分为两种类型：第一种是拷贝数增加，也称为基因扩增；第二种是拷贝数减少，也称为基因缺失。

基因扩增是指某段基因重复拷贝的次数较正常倍数更多，而基因缺失则是指某些基因被删除。

基因拷贝数变异的机制是与重组过程、不完整复制和修复损伤的DNA等过程有关。

基因拷贝数变异的频率在人类中非常高，因此基因拷贝数变异与许多人类疾病相关。

肿瘤是一种由于基因突变导致的疾病。

它可以在身体的任何一个器官内部形成，并且有许多不同的类型。

在这些不同类型的肿瘤中，基因拷贝数变异在不同程度上发挥了影响。

然而，在某些肿瘤类型中，基因拷贝数的变异是非常普遍的。

例如，乳腺癌、卵巢癌和儿童脑瘤等常见肿瘤。

在这些肿瘤中，基因扩增和缺失是非常常见的。

基因扩增与肿瘤的关系非常密切。

了解基因扩增的机理可以帮助我们更好地理解其与肿瘤的关系。

一些基因扩增可以导致肿瘤细胞内特定蛋白质表达水平的上调或失调。

这些蛋白质可能参与癌细胞的增殖、转移和治疗反应等各个方面，因此它们在肿瘤中的表达和功能对于肿瘤的发展至关重要。

例如，在一些乳腺癌中，HER2基因的扩增是非常普遍的。

Anti-CD19Fab-_（CP）3_新型二聚化抗体的构建及靶向性观察

山东医药2023 年第 63 卷第 28 期Anti -CD19Fab - （CP ）3新型二聚化抗体的构建及靶向性观察雷晓敏1，2，范冬梅1，2，袁向飞3，卢杨1，2，张砚君1，2，王建祥1，2，熊冬生1，21 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）北京协和医学院天津市血液病细胞治疗研究重点实验室实验血液学国家重点实验室国家血液系统疾病临床研究中心细胞生态海河实验室，天津300020；2 天津医学健康研究院；3 天津市急腹症器官损伤与中西医修复重点实验室摘要：目的　构建并表达Anti -CD19Fab -（CP ）3二聚化抗体，鉴定其蛋白分子量及相对含量并观察其靶向性。

方法　通过基因克隆技术构建原核表达载体PAYZ -Anti -CD19Fab - （CP ）3及阳性对照质粒PAYZ -Anti -CD19Fab -（CPP ）3，将质粒转化至大肠杆菌16C9中进行表达。

表达产物经过透析及Protein G 亲和层析柱纯化，采用SDS -PAGE 电泳法及液相串联质谱法（LC -MS ）鉴定Anti -CD19Fab - （CP ）3二聚化抗体分子量及相对含量；采用流式细胞术检测二聚化抗体与CD19+B 系淋巴瘤Raji 细胞的结合能力以及二聚化抗体对CD19鼠源亲本全抗的竞争能力。

结果　成功构建并表达Anti -CD19Fab -（CP ）3，所得产物纯化后经SDS -PAGE 及LC -MS 法鉴定其主要成分为二聚化抗体，含量为76.2%；Anti -CD19Fab -（CP ）3二聚化比例高于对照Anti -CD19Fab - （CPP ）3，差异有统计学意义（P <0.05）。

同浓度下，与Anti -CD19Fab - （CPP ）3及Anti -CD19Fab 相比，Anti -CD19Fab - （CP ）3对Raji 细胞的结合能力更强，亲和力更好，差异有统计学意义（P 均<0.05）。

简述单细胞抗体基因扩增技术

简述单细胞抗体基因扩增技术
单细胞抗体基因扩增技术是一种将单个B细胞的抗体基因扩增和分析的方法，可以用来研究单个B细胞的抗体多样性和功能。

该技术主要包括以下步骤：
1. 单细胞分离：将单个B细胞分离到单个孔中，可以通过细胞分选技术（如流式细胞术）或微流控芯片实现。

2. 抗体基因扩增：通过PCR扩增单个B细胞的抗体基因，通常包括抗体轻链和重链的变异区域。

3. 序列分析：对扩增得到的抗体基因序列进行测序，可以使用常规的测序方法或高通量测序技术。

4. 序列分析：对序列进行分析，包括序列比对、序列注释和序列特征分析等。

通过单细胞抗体基因扩增技术，可以获得单个B细胞的抗体基因序列信息。

这些序列可以用于研究抗体的多样性、亲和力和功能特性等，也可以用于克隆重组抗体或设计人工抗体。

此外，单细胞抗体基因扩增技术还可以用于研究免疫应答过程中单个B细胞的演化轨迹和克隆分布等。

抗体fab2段

抗体fab2段以下是有关抗体fab2段的内容：常规抗体常规的抗体或者是完整大小的抗体是被称为免疫球蛋白的糖蛋白，是浆细胞对外来分子或者抗原反应后产生的。

抗体最基础的功能是结合特异性抗原并激发免疫反应，从而保护机体免于感染。

抗体包括好几种亚型，这里主要是介绍IgG和IgM亚型的抗体。

IgG和IgM亚型的抗体被广泛应用于科研、诊断和治疗等方面。

1.常规抗体的结构一个完整的抗体的基础单元结构有四条肽链组成，包括两条重链和两条轻链，并通过二硫键结合在一起。

抗体的形状像一个Y字母，Y结构的铰链区具有弹性。

每条肽链就有一个恒定区（在所有的抗体中都非常的保守）和一条可变区（在一个种抗体中都是特异性的）。

轻链可变区的标示符号是VL，而轻链恒定区的标示符号是CL（图一左）。

类似的，重链的可变区和恒定区分别被标示为（VH）和（CH）。

碳水化合物通常和重链的CH2区域结合。

Fc 段只包括重链的恒定区（CH）, 但是和抗原结合的Fab段（Fab）包括一个恒定区和重链的可变区以及轻链的可变区（VH and VL）。

Fv区域（variable fragment）只包含两个可变区一个完整的常规抗体（左）和通常的抗体片段（右）的基本结构2.常规抗体的应用常规抗体在科研中用于通过蛋白质印迹、免疫组织化学以及酶联免疫吸附法等方法检测目的蛋白已经有几十年了。

完整大小的抗体还被应用于临床的检测，比如妊娠试验以及用ELISA检测血液中HIV病毒。

另外，常规的完整的抗体还被应用于疾病的治疗。

例如，英利昔单抗是一个可以识别肿瘤坏死因子的抗体，被用于治疗肠道疾病和类风湿性关节炎。

曲妥珠单抗或者赫赛汀是一种可以结合上皮生长因子二的抗体，被用于治疗转移的乳腺癌。

另外，还有好多抗体，包括Muromomab，被用于器官移植后的基础治疗来防止发生移植物排斥反应。

用常规抗体的优点包括Fc区域能够激活机体的免疫反应并结合到目标分子上使之被破坏。

用完整抗体的缺点包括由于其分子太大不能被渗入到某些组织中。

抗体的fc段和fab段

抗体的fc段和fab段
抗体的fc段和fab段是免疫学中非常重要的概念。

在这里，我们将简要介绍这两个概念的定义、结构和功能。

一、fc段(Fcregion)
fc段是指抗体分子上的一种结构域，它通常位于抗原结合部位的N端。

fc段的主要功能是与受体细胞表面的FcγR结合，从而介导抗体与宿主细胞之间的相互作用。

在某些情况下，fc段还可以作为药物的靶点，因为它们可以与特定的配体结合，从而实现药物的靶向输送和治疗。

二、fab段(Fabregion)
fab段是指抗体分子上的另一种结构域，它通常位于fc段的C 端。

fab段的主要功能是与抗原结合，从而诱导宿主细胞产生免疫应答。

由于fab段的结构和性质不同于fc段，因此它们可以与不同种类的抗原发生特异性结合反应。

此外，fab段还可以参与到抗体介导的细胞信号传导过程中，从而影响宿主细胞的功能和命运。

三、总结
抗体作为一种重要的生物制剂，具有高度的特异性和亲和力。

fc 段和fab段是抗体分子上两个关键的结构域，它们分别承担着不同的生物学功能。

通过深入研究这些区域的结构和特性，我们可以更好地理解抗体的作用机制，并开发出更加高效和精准的药物和治疗方法。

Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建_筛选与初步鉴定

#论著#文章编号:1007-8738(2009)02-0150-05Daudi 细胞系特异性Fab 噬菌体抗体库的构建、筛选与初步鉴定申咏梅1,2*,杨晓春3,董宁征4,白霞4(苏州大学附属第二医院:1放免中心,2检验教研室,3磁共振室,江苏苏州215004;4江苏省血液研究所,苏州大学附属第一医院,江苏苏州215006)收稿日期:2008-06-30; 接受日期:2008-09-08基金项目:国家自然科学基金资助项目(30400111);江苏省自然科学基金资助项目(BK2004041)作者简介:申咏梅(1969-),女,重庆人,副教授,医学博士Te:l 0512-********;E-m ai:l szs y m@yahoo .co *Corres pond i ng authorG enerati on ,screeni ng and prelim i naryi dentification of specific Fab phage an -ti body li brary agai nst D audi cell strai nSHE N Yong-m ei 1,2*,YANG X iao -chun 3,DONG N ing-zheng 4,BAI X ia41R adi o i m munoassay Cente r ,2D epart m ent of C linical L abo rato ry ,3D epart m ent o f M agnetic R esonance ,Second A ffiliated H osp ita,lSoocho w U niversity ,Suzhou 215004;4Ji ang su Institutie o fH em a -to l ogy ,F irst A ffiliated H ospita ,lSoochow U n i ve rsity ,Suzhou215006,Ch i na[Abstract] A I M:To gene ra t e and screen the specificFab p hage an ti b ody library aga inst human Daud i ce ll stra in in B-ly mphoma and i d en tify t he positive c l o nes .M ETH-OD S :BA LB /c m ice we re m i mun ized w it h Daud i ce lls ,and an tisera we re titra ted by EL I SA .Fo llo w ing t he demonstra -tion o f su fficien t an tibody tit e r ,to t a l RNA was extract ed from sp l e n ic ly mphocytes o f the m i m unized m i c e and RT -PCR w as used to am p lify J ligh t cha in and Fd fragmen ts o f heavy chain .A ft e r re strictive d igestion w ith S a c I/Xba I and X ho I/S pe ,I the J ligh t cha in and the Fd fragm ents were succes -sive ly inse rt ed in t o the p hagem id vector pComb 3H -SS and then e l e ctropo ra t ed in t o E.co li XL 1-B l u e .The spe cific Fab phage antibody li b ra ry aga inst Daud i ce ll stra i n in hu man B-l y m pho m a was constructed by in f ec tion o f he l p e r phage VC -SM 13.Fo llo w ing six rounds of b iopanning w ith Daud i ce lls ,the antigen b inding acti v ities o f rando m clone s we re t ested by EL I S A to se lect the positive c l o nes ,wh ich we re further DNA sequenced ,expre ssed i n E.co li X L 1-B lue and i d en t -i fi e d byW estern b lo.t RE SULTS :The Fab phage an tibody l -i b ra ry w it h 3.13@107size was construct ed and f our positive c lones wh ich spec ifica lly recogn ized Daudi ce ll stra in w ere -i so l a t ed .In am i n o ac i d seq uences ,the var i a b le heavy do -m ains (V H )we re found to be 80%-94%and va riab l e ligh tdom a i n s (V L )88%-95%homo logous w ith respective m u -r i n e ge r m line genes in GenBank .Fu rthe r mo re ,so lub l e Fab antibod ies o f t he po sitive clone s we re successfu ll y ex -p ressed in E.c o l i XL 1-B l u e and t he reactivity w ith t he memb rane p ro t e ins o f Daud i ce lls wa s demonstra t ed by W estern b l o .t CONCLUSI ON :Fab phage an ti b ody library is succe ssfu lly constructed and specific an tibod ies aga instmemb rane antigens in Daud i ce lls are ob ta ined ,wh ich pro -vides an expe rm i en t a l f ounda tion for the further i n ve stiga tion o f B -ly m phoma m i munotherapy .[K ey w ords]B-ly mphoma ;Fab ;Phage anti b ody li b ra ry ;Daud i ce ll stra i n ;pComb 3H -SS vector[摘要] 目的:构建针对B 细胞淋巴瘤D aud i 细胞系噬菌体抗体库,从中筛选特异性抗体,并对所筛选出的阳性克隆进行鉴定。

抗HBsAg人源抗体Fab片段原核表达的优化

抗HBsAg人源抗体Fab片段原核表达的优化作者：焦永军, 曾晓燕, 史智扬, 汪华, 崔仑标, 龚希萍, 薛蓉, 周镇先【摘要】目的: 优化抗HBsAg人源抗体片段hFabHB1在大肠杆菌中功能性表达的条件。

方法: 通过测定宿主菌培养物A600值观察10 g/L的葡萄糖对宿主菌生长的影响; 比较诱导前是否更换培养液的2种不同条件hFabHB1的表达产量; 比较在37℃和25℃ 2种诱导温度下功能性hFabHB1分子的表达量以及Fd和轻链表达的平衡性。

大量表达的功能性hFabHB1分子经亲和层析纯化后, 用ELISA鉴定其生物活性。

结果: 在培养液中加入10 g/L的葡萄糖可有效抑制重组蛋白的本底表达, 增加宿主菌的生长速度; 在加入IPTG诱导前更换培养液可明显提高hFabHB1的表达产量; 25℃的诱导温度比37℃能表达更多的功能性Fab分子, 并且Fd和轻链表达量也更趋于平衡。

经亲和层析纯化的hFabHB1分子可与HBsAg特异性结合。

结论: 实验结果为在原核系统中大量表达该抗体片段提供了技术储备。

【关键词】抗HBsAg人源抗体 hFabHB1 原核表达优化乙型病毒性肝炎（简称乙肝）是一类严重危害人体健康的感染性疾病, 全球约有3.5亿人感染乙肝病毒（HBV）, 其中近10%的患者可因持续感染导致肝硬化或肝细胞癌[1]。

针对HBsAg的中和抗体可阻断乙肝病毒对肝细胞的吸附, 从而避免了病毒攻击。

目前HBsAg 的中和抗体作为免疫治疗剂已在临床上广泛使用, 如对HBsAg 阳性产妇生产的新生儿进行抗体的被动免疫, 以阻断母婴垂直传播[2]; 对肝移植的乙肝患者进行抗体的紧急接种来保护移植肝组织免受病毒感染等[3]。

但目前使用的抗体均来自人血清, 价格贵, 来源有限, 且存在其他病原体感染的潜在威胁[2]。

hFabHB1是通过基因工程技术, 从HBV免疫型噬菌体抗体文库中筛选的全人源Fab型抗体片段分子, 其靶分子是HBV HBsAg, 实验证实hFabHB1可有效阻止HBV与人原代肝细胞的结合, 是一个具有潜在临床应用价值的候选分子。

基因工程抗体PPT课件

Ricin A:蓖麻毒素A,对肿瘤细胞具有毒性作用
32
scFv IL-2
IL-2
免疫细胞因子(Immunocytokine)
33
五、细胞内抗体
细胞内抗体主要是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体，亦称内抗体（intrabody）。
目前的研究主要集中在单链抗体上，在 ScFv的C端或N端插入其它靶向信号（targeting signals），如分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号和内质网滞留信号等，从而进行检测、识别、发挥特定功能。
特点：减少了鼠源性抗体的免疫
原性，同时保留了亲本抗体特异性结
9
人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略
启动子
Pr 鼠VH 人 CH
免疫球蛋白基因载体的构建
Pr 鼠VL 人 CL
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
共转染细胞
10
抗体分泌细胞
鼠VH
鼠V L
人CL 人CH
人-鼠嵌合基因工程抗体
11
第二代的抗体人源化——改型抗体
基因工程抗体
Genetic engineering antibody
根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体等。
1
单克隆抗体用于治疗存在的问题
1、单克隆抗体的特异性由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严
因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或 VL一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个 Ig分子的1／12，故也称之为小抗体。

免疫球蛋白中抗体分子结合抗原的部位fab段位点

免疫球蛋白中抗体分子结合抗原的部位fab段位点
Fab片段：可与抗原特异性结合，是决定抗体特异性的部位。

Fc片段：与抗体的生物学活性有密切的关系。

抗体是具有4条多肽链的对称结构,其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链。

链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。

整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。

在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。

人源Fab段噬菌体抗体库的构建及抗IL-4抗体的初步筛选

人源Fab段噬菌体抗体库的构建及抗IL-4抗体的初步筛选胡占东;公倩;朱铁虹;畅继武【摘要】目的:构建大容量人源Fab段噬菌体抗体库,从中筛选抗白细胞介素(IL)-4的抗体元件,为人源抗体的制备建立平台.方法:采集18例健康成人外周血,分离淋巴细胞,从中提取总RNA,用逆转录聚合酶链反应(HT-FCR)法扩增Fab段抗体基因,插入噬菌粒pComb3XSS载体内,构建噬菌体抗体元件库,用内切酶鉴定基因片段的插入.以抗原IL-4对抗体库进行富集筛选.筛选后,随机抽取菌株通过噬菌体-酶联免疫吸附法(Phage-ELISA)进行检测,并且对阳性克隆DNA的序列进行测定.结果:构建的人源Fab段噬菌体抗体库库容为2.4×108,酶切鉴定插入基因片段大小正确,从中筛选到与IL-4有结合活性的克隆.ELISA特异鉴定阳性,测序结果证实为人免疫球蛋白可变区基因片段.结论:成功构建了大容量人源化噬菌体抗体元件库,并初步获得人源性抗IL-4-Fab抗体,为大规模制备人源IL-4抗体和检测血中IL-4水平奠定了基础.%Objective: To construct a large-capacity human Fab phage antibody lihrary and screen interleukin (IL-4)antibody components to build a platform for preparation of human antibody. Methods: The peripheral blood was collected from 18 healthy adults, and lymphocytes were separated. The total RNA was extracted and Fab genes were amplified by RT-PCR. In order to construct phage antibody component library, the genes were ligated into the vector phagemid pComb3XSS. The insertion of genes was identified by restriction enzymes. In the end, the antibody library was screened using IL-4 as an antigen. After panning, strains were identified by Phage- ELISA, and DNA segments of positive clone were sequenced. Results: The storage capacity of human Fab segment phageantibody library was 2.4×lO8. The size of inserted gene fragment was proved correct hy digestion. Binding activity clone was screened with IL-4 from phage antibody library. ELISA specific identification showed positive. The sequencing results confirmed that the gene was human immunoglobulin variable region gene. Conclusion : The large-capacity human phage antihody component library was successfully constructed. The anti-IL-4 human Fab antibody was obtained. which can be used in large scale production of human IL-4 and detection of blood levels of IL-4.【期刊名称】《天津医药》【年(卷),期】2011(039)006【总页数】4页(P493-495,后插2)【关键词】淋巴细胞;细菌噬菌体;遗传工程;免疫球蛋白Fab片段;白细胞介素4;逆转录聚合酶链反应【作者】胡占东;公倩;朱铁虹;畅继武【作者单位】300211,天津医科大学第二医院泌尿外科研究所;天津医科大学总医院;天津医科大学总医院;300211,天津医科大学第二医院泌尿外科研究所【正文语种】中文白细胞介素（IL）-4是具有多种生物学功能的细胞因子。

免疫球蛋白的fab段的功能是( )

免疫球蛋白的fab段的功能是什么
免疫球蛋白（抗体）的Fab段（Fragment antigen-binding）是抗体分子的一个重要部分，具有以下主要功能：
1. 抗原结合：Fab段包含抗体的抗原结合位点，它们能够与抗体的目标抗原结合，这是抗体特异性的基础。

Fab段的结构与抗原的特定区域相互配合，使抗体能够高度选择性地结合到特定的抗原。

2. 中和抗原：通过与抗原结合，Fab段可以中和或破坏抗原的活性。

这对于中和细菌毒素、中和病毒、清除有毒物质或过敏原等具有重要作用。

3. 激活免疫系统：抗体的Fab段可以与其他免疫细胞（如巨噬细胞和NK细胞）协同工作，促进免疫反应的启动和调节。

这有助于诱导其他免疫细胞的参与，以加强抗原的清除和免疫反应。

4. 信号转导：有时，Fab段可以通过与抗体受体结合，触发信号传导通路，从而在免疫反应中引发细胞的特定响应，如细胞毒性或溶解性效应。

总之，Fab段是免疫球蛋白中的一个重要结构，负责与抗原结合，中和抗原，协调免疫反应，并触发相关的信号传导过程，从而在免疫系统的抗原识别和消除中发挥关键作用。