热稳定性过氧化氢酶工程菌株发酵条件的研究_王凡强

热稳定性过氧化氢酶工程菌株发酵条件的研究王凡强　王正祥　邵蔚蓝　刘吉泉　徐成勇　诸葛健(江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,无锡,214036)第一作者:博士研究生。

收稿时间:2001-06-07,改回时间:2001-09-24摘　要　重组大肠杆菌UM 2-1携带来自嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶的基因,在以I PT G 作为诱导物时,在IP TG 浓度为0.75mmol /L 、起始pH6.5、装液量50mL /250m L 三角瓶的条件下37℃诱导3h ,酶的表达水平最佳;在以乳糖作为诱导物时,在乳糖质量浓度为10g /L 、起始pH7.5、装液量50m L /250mL 三角瓶的条件下,37℃诱导5h ,酶的活力最高。

乙酸的存在能够抑制酶的表达。

工程菌在最适条件下酶活力可达30000～35000U /L 以上,约是原始菌株嗜热脂肪芽孢杆菌的10倍。

工程菌在无选择压力的条件下连续传代60代,基本保持稳定,连续传代100代,仍有80%左右的菌株携带重组质粒。

关键词　过氧化氢酶,工程菌,培养条件 过氧化氢酶(hy drogen peroxide :hy dro -gen peroxide oxidoreductase EC 1.11.1.6)催化H 2O 2分解为H 2O 和O 2的反应,几乎存在于所有好氧生活的生物体内,具有清除自由基,保护细胞免受O -2·损害等保护生物机体的功能。

过氧化氢酶自1950年就开始广泛应用于生物、医药、临床和食品中的某些分析测定;在食品和乳制品工业、纺织工业、制浆和造纸工业、医疗器械的消毒、葡萄糖酸的生产等方面也有越来越多的应用[1,2]。

从1986年开始,国内外都开始进行热稳定性的过氧化氢酶的筛选工作,发现了几种嗜热菌产生的过氧化氢酶[1～5]。

我们利用PC R (聚合酶链式反应)技术将嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001产过氧化氢酶的基因perA 与表达载体pKK223-3构建重组质粒,转化E .coli 过氧化氢酶双缺突变株UM 2,获得重组大肠杆菌UM 2-1。

为提高该工程菌的表达水平,我们对影响该工程菌表达过氧化氢酶的培养条件进行了研究。

1　材料与方法1.1　菌　种表达嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶的基因工程菌UM 2-1由本实验室构建。

1.2　培养基LB 培养基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl )。

1.3　试　剂酵母提取物、胰蛋白胨为OXOID 公司产品,异丙基硫代-β-D -半乳糖苷(IPTG )为华舜公司产品,其他试剂为国产分析纯。

1.4　菌体培养从-70℃超低温冰箱中取出冻干菌种,划线接种于含100μg /m L Am p (氨苄青霉素)的LB 平板上,37℃培养12h 。

从平板上挑取单菌落接种于20m L LB 培养基中,37℃200r /min 振荡培养10h ,以1%接种量转接到不同体积LB 培养基中,37℃200r /min 振荡培养3.5h ,加入不同量的IPTG 或乳糖诱导,诱导不同时间离心收集菌体(5000r /min ,10min )。

1.5　酶活力测定取45m L 培养液于8000×g 离心10min ,弃上清液,以0.02mol /L ,pH7.0的磷酸缓冲液洗涤、离心后得菌体,然后加入同样的磷酸缓冲液15m L 悬浮后超声波20kHz 破碎10min ,于20000×g 离心15min ,上清液11报告即为粗酶液。

在70℃按文献[6]通过分光光度法测定240nm 吸光度的减少来计算酶活,取ε240=43.6L /mol ·cm 。

酶活单位(U )定义为每min 催化分解1μmol H 2O 2所需的酶量。

1.6　工程菌质粒稳定性的研究从斜面上挑取1环菌接入不含Amp 的LB 培养基中,37℃培养12h 作种子,转种培养24h ,每隔24h 按1%的量重新接种培养,同时取样,以无菌水稀释至10-6,取0.1mL 涂布于不含Am p 的LB 平板上,用无菌牙签将单菌落分别挑至不含和含Amp 的LB 平板上,37℃培养12～16h ,统计形成的菌落数[7]。

2　实验结果2.1　工程菌的生长曲线UM2-1在LB 培养基中37℃以200r /min 振荡培养的生长曲线见图1。

LB 培养基较适合工程菌的生长,最大OD 600约为3.5。

在培养3h 以后进入对数生长期,9h 后进入稳定期。

培养3.5h ,OD 600值约在0.6左右,此时菌体处于对数前期,生长比较快,此时诱导有利于酶蛋白的表达。

图1　工程菌的生长曲线2.2　诱导剂浓度对酶活力的影响重组大肠杆菌UM2-1的重组质粒pKK -perA 带有tac 操纵子,我们将菌体培养3.5h ,考察加入不同浓度IPTG 和乳糖诱导3h 对酶活力的影响(见图2),结果发现IPTG 浓度为0.75mmol /L 时酶活力最高,乳糖质量浓度在10g /L 时有最佳的诱导效果。

以IPTG 和乳糖作为诱导剂同时诱导3h ,IPTG的诱导效果要好于乳糖。

图2　诱导剂不同浓度对酶活力的影响2.3　不同诱导时间对酶活力的影响将菌体培养3.5h ,分别加入0.75mmol /L 的IPTG 或10g /L 乳糖,诱导不同时间,结果见图3。

以IPTG 为诱导剂时诱导3h 达到最佳诱导效果,而用乳糖作为诱导剂时诱导5h 达到最佳效果。

乳糖诱导的效果比IPTG 作为诱导剂时稍差一点,其最大酶活力为IPTG 诱导的90%左右。

图3　诱导时间对工程菌产酶的影响2.4　起始pH 对工程菌产酶的影响将LB 培养基分别调pH 值为6.0～8.0,按常规方法培养,分别以IPTG 和乳糖作为诱导剂,其中IPTG 诱导3h ,乳糖诱导5h ,考察不同起始pH 对酶活力的影响,结果见图4。

结果表明,不同诱导剂所需最适的起始pH 值不同,以IPTG 作为诱导剂,起始pH 值为6.5时酶活力最高,而以乳糖作为诱导剂时,起始pH 为7.5时酶的表达水平最高。

12究报告图4　起始pH 对产酶的影响2.5　诱导温度对酶活力的影响按常规方法培养工程菌,分别以IPTG 和乳糖作为诱导剂,考察在26、30、33、37℃和40℃分别诱导3h 和5h 的酶活力,结果见图5。

图5　诱导温度对酶活力的影响结果表明,随着诱导温度的升高,酶的表达水平也随之提高,到37℃酶的活力最高,表明该工程菌UM2-1诱导产酶的最适温度与菌体生长的最适温度相同。

2.6　装液量对酶活力的影响图6　装液量对酶活力的影响在250mL 三角瓶中分别装入不同体积LB 培养基,按常规方法培养,分别以IPTG 和乳糖作为诱导剂,其中IPTG 诱导3h ,乳糖诱导5h ,结果如图6所示,结果表明摇瓶装液量在50m L 时酶活力最高。

2.7　诱导前乙酸质量浓度对酶活力的影响按常规方法培养工程菌,在加入诱导剂前分别加入75g /L 的乙酸钠溶液(调pH 7.0),使得发酵液中乙酸钠质量浓度达到2.5～12.5g /L (不考虑培养过程中菌体自身产生的乙酸),分别以IPTG 和乳糖作为诱导剂,其中IPTG 诱导3h ,乳糖诱导5h 。

结果表明乙酸的存在不利于重组过氧化氢酶的表达,随着乙酸质量浓度的提高,其酶活力逐渐下降,因此在工程菌的培养过程中应采取有效措施,降低代谢副产物乙酸的积累,以有利于重组过氧化氢酶的产生。

图7　乙酸对酶活力的影响2.8　工程菌质粒稳定性在工业生产过程中,一般不希望使用抗生素,因此,工程菌在无选择压力的情况下质粒的稳定性是工程菌能否工业化的关键。

我们对重组大肠杆菌UM2-1的质粒稳定性作了研究,结果见表1。

结果表明,工程菌在传代60次时质粒基本保持稳定,传代100次时有80%以上的菌株仍然携带重组质粒,说明工程菌的质粒稳定性较好。

表1　工程菌UM2-1连续转种后在Amp 平皿上的菌落数传代次数Amp (+)Amp (-)20100100409810060961008090100100831003　结　论研究表明,IPTG 在浓度0.75mmol /L ,诱导时间3h ,起始pH6.5的条件下诱导效13报告果最好;乳糖在质量浓度为10g /L ,诱导时间5h ,pH7.5的条件下诱导效果最佳。

无论采用何种诱导剂,都是在装液量50m L 、诱导温度37℃的条件下有最好的诱导效果;乙酸对于过氧化氢酶的表达有抑制作用。

研究结果还表明,IPTG 的诱导效果比乳糖稍好,而且乳糖诱导所需时间比IPTG 长2h 左右。

但由于IPTG 对于人体有潜在的毒性,而且价格比较昂贵,在大规模生产中会提高发酵产品的成本。

乳糖没有毒性,价格低廉,虽然诱导效果稍差,但在工业应用上有一定的优势。

本文的研究表明,乳糖可作为诱导剂应用于tac 操纵子调控的重组蛋白的表达。

在最佳诱导条件下,工程菌产生的过氧化氢酶活力可达(30～35)×103U /L ,是原始菌株Bacillus stearothermophilus IAM11001的8～10倍。

实验表明,工程菌UM2-1在无选择压力下连续培养60代以上,质粒基本保持稳定,培养代数大大超过实际生产所需的时间,说明该菌适合工业化生产的要求。

近年来随着二恶英事件的发生,在纺织和制浆造纸工业用H 2O 2替代含氯产品进行漂白已经成为趋势,因此其用量以8%～10%的速度逐年增加,世界范围内的用量从1987年的82万t 增长到1995年的195万t ,而美国从1991年的11.5万t 增长到1999年的22万t [2]。

这也意味着需要去除的H 2O 2随之增多,而利用过氧化氢酶不仅可以完全去除H 2O 2,节约用水和能源,缩短工艺时间,而且不会生成硫酸盐或氮盐等有害物质,酶本身又是生物可降解材料,有利于保护环境。

进一步研究工程菌UM2-1的高密度发酵条件,提高酶的发酵水平,降低酶的生产成本,可为实现酶的工业化生产奠定基础。

参考文献1　周　一,严自正,卢运玉等.微生物学报,1990,30(3):223～2272　P trick Dhaese .Chimica Oggi (Chemistry T oday ),1996,14(1):19～213　Suvit Lopraser t ,Seiji Negoro ,Hirosuke O kada .Journal of G eneral M icrobiology ,1988,134:1971～19764　Allgood G S ,Perry J J .J .Bacteriology ,1986,168(2):563～5665　M asayuki K ag aw a ,No riyuki M urakoshi ,YasushiNishikaw a et al .Archives of Bio chemistry and Bio -phy sics ,1999,362(2):346～3556　Bergmeyer H U (ed ).M etho ds of EnzymaticAnaly sis ,3rd,vol 3,“Enzymes 1:O xidoreduc -tases ,T ransferases ”.Weinheim :V erlag Chemie ,1983.273～2857　蒋　岚,杨永华,龚　毅等.生物工程学报,1999,15(1):64～67Study on Culture Conditions of Engineered Strainof Thermostable CatalaseWang Fanqiang Wang Zheng xiang Shao Weilan Liu JiquanXu Chengyong Zhuge Jian(Key Laboratory of I ndustrial Biotechnology ,M inistry o f Education ,School of Biotechnolog y ,Southern Yangtze U niversity ,Wuxi ,214036)ABSTRAC T The recombinant E .c oli carried catalase gene from Bacillus stearothermophilus .The conditions fo r expressions of recombinant catalase were repo rted in this paper .For ex pression of catalase using IPTG (isopropy l -β-D -thiogalactoside )as an inducer ,the best conditions w ere :IPTG concentration ,0.75mmol /L ;inducing time ,3hours ;inducing tem perature ,37℃;initial pH ,6.5,broth volume ,50m L /250mL flask .For ex pression of catalase using lactose as an in -ducer ,the best conditions were :lactose concentration ,10g /L ;inducing time ,5hours ;inducing tem perature ,37℃;initial pH 7.5,broth volume ,50mL /250mL flask .The recombinant plas -mid w as stable after cultivation in LB broth at 37℃for 60generations without antibiotic selection .Under optimal conditions ,the catalase activity reachs up to 30～35U /mL ,which is about tenfold that of Bacillus stearothermophilus .Key words catalase ,engineered strain ,culture conditions14究报告。