pAD-GAL4-2.1酵母表达载体
pPIC9k-His酵母表达载体说明
其他酵母表达载体：
p416GFD p53blue pACT2-AD pAD-GAL4-2.1 pADH2 pAUR123 pBridge pCL1 pDEST32 pDisplay pDR195 pESC-His pESC-Leu pESC-TRP pESC-URA pFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pFLD pFLD/CAT pFLDα pGADT7-T pGAG424 pGAPZA pGAPZB pGAPZαB pGAPZαC pGBKT7 pGBKT7-53 pGBKT7-Lam pHIC-PI pHIL-D2 pHIL-S1 pHis2 pHisSi-1 pPIC9 pPIC9K pPIC9k-His pPICZA pPICZB pPICZC pPICZαA pPICZαB pPICZαC pPICZαD pPICZαFC pPICZαGB pPink-HC pPink-LC pPinkα-HC pRS316 pRS403 pRS405 pRS406 pRS414 pRS415 pRS416 pRS41H pRS426 pRS426gal pSEP1 pSEP2 pSEP3 pSos pSos-MAFB pUG66 pYC2/CT pYC2/NTA
载体名称
pPIC9k-‐His
Invitrogen pPIC9k-‐His 酵母表达载体 -‐-‐ -‐-‐ 多克隆位点，限制性内切酶 -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ Ampicillin -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐
pMETA pMETB pMETC pMETαA pMETαB pMETαC pMyr pPIC3.5 pPIC3.5K pPIC6B pPIC6C pPIC6αA pPIC6αB pPIC6αC pYX212 SUMOprotease Ycp22lac-EGFP
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
pHISi使用说明
pHISi编号载体名称北京华越洋VECT76301pHISipHISi载体图谱:pHISi载体简介：pHISi is a yeast integration and reporter vector for use with the MATCHMAKER One-Hybrid System.pHISi contains the yeast HIS3gene downstream of the MCS and the minimal promoter of the HIS3locus(PminHIS).Cis-acting sequences of interest (i.e.,target elements)can be inserted into the MCS.Without activation by a target element,constitutive HIS3expression from PminHIS is very low in yeast,but allows enough growth to select for integration when constructing HIS3reporter strains. During library screening,the leaky expression of HIS3is controlled by adding3-AT to the medium.The yeast URA3and HIS3genes of pHISi can be used as selectable markers for integration into the nonfunctional ura3and his3loci,respectively,of the YM4271 host strain.Before integrating,the vector is linearized at the Xho I or Afl II sites(his3 locus)or at the Apa I site(ura3locus).The Kpn I site cannot be used for integration because it cuts within the coding region of the HIS3gene,and that region is deleted in YM4271.pHISi cannot replicate autonomously in yeast.The plasmid contains a bacterial Col E1origin(ori)and the ampicillin resistance gene(Ampr)for propagation and selection in E.coli.Unique restriction sites are in bold.。
酵母整合型表达载体整合原理和整合原件
酵母整合型表达载体整合原理和整合原件一、概述酵母整合型表达载体是一种用于基因工程研究中的重要工具，它能够整合外源基因并稳定地在酵母细胞中表达。
这一载体在生物技术领域具有广泛的应用，能够帮助科研人员进行基因表达调控、蛋白质功能研究等方面的工作。
本文将针对酵母整合型表达载体的整合原理和整合原件进行深入探讨，并结合个人观点对其进行分析。
二、整合原理酵母整合型表达载体的整合原理是指外源基因在酵母细胞染色体中的整合方式和机制。
一般来说，酵母整合型表达载体通过与酵母染色体的同源配对，使外源基因在染色体特定位点发生整合。
整合的过程需要依赖一系列的整合原件来进行调控和介导。
其中，整合原件主要包括酵母选择标记基因和整合酶等。
1. 酵母选择标记基因酵母选择标记基因是酵母整合型表达载体中的重要组成部分，它能够在酵母细胞中产生特定的表型，并在培养基中通过筛选来实现对整合事件的筛选。
常见的酵母选择标记基因包括TRP1、LEU2、HIS3等，它们分别对应酵母细胞的色氨酸、亮氨酸和组氨酸代谢通路，能够使突变体在对应的缺陷培养基上无法生长。
通过选择适当的酵母选择标记基因，可以在整合过程中实现对突变体的筛选，从而保证整合事件的稳定性和准确性。
2. 整合酶整合酶是酵母整合型表达载体中的另一个重要组成部分，它能够介导整合事件的进行，并在酵母细胞中调控外源基因的整合。
常见的整合酶包括酵母整合酶(INC)和整合介导蛋白(INP)等，它们能够与酵母染色体上的同源序列进行特异性结合，并介导外源基因的整合过程。
通过对整合酶的调控和改变，能够实现对整合事件的精准和高效地控制，从而满足不同研究需求的整合要求。
三、个人观点酵母整合型表达载体的整合原理和整合原件在基因工程研究中发挥着重要的作用，它们为科研人员提供了强大的工具和评台，能够帮助他们实现对外源基因的整合和驱动。
在未来的研究中，我认为可以进一步优化和改进整合原件的设计和构建，以提高整合事件的稳定性和效率，从而更好地满足不同研究领域对整合事件的需求。
pPICZ A酵母表达载体说明
pPICZ A编号 载体名称北京华越洋生物VECT2440 pPICZ ApPICZA载体基本信息出品公司: Invitrogen载体名称: pPICZA, p PICZ A质粒类型: 毕赤酵母蛋白表达载体表达水平: 高拷贝启动子: AOX1克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 3329 b p5' 测序引物及序列: 5´ A OX1:5´-‐GACTGGTTCCAATTGACAAGC-‐3´ 3' 测序引物及序列: 3´ A OX1:5´-‐GCAAATGGCATTCTGACATCC-‐3´ 载体标签: C-‐Myc, C-‐His载体抗性: Zeocin 博来霉素筛选标记: HIS4备注: 插入基因是必需包含起始密码子ATG。
产品目录号: -‐-‐稳定性: 稳定 Stable组成型: 组成型 Constitutive病毒/非病毒: 非病毒pPICZA载体质粒图谱和多克隆位点信息pPICZA多克隆位点pPICZA载体简介pPICZ A，B和C是3.3 k b的毕赤酵母蛋白载体。
表达的重组蛋白是融合蛋白，含有一个C-‐端多肽，多太重含c-‐myc和C-‐His标签。
载体能够在毕赤酵母中利用甲醇诱导的高水平的表达目的蛋白，并且可以用在任何毕赤酵母中，包括X33，GS115菌株，SMD1168H，KM71H。
pPICZ系列载体包含以下元素：•5'片段含有AOX1启动子的严格调控，利用甲醇诱导表达任何感兴趣的基因（Ellis等，1985; Koutz等人，1989;tschopp等人，1987A）。
•Zeocin抗性基因在大肠杆菌和毕赤酵母都能用于筛选（Baron等人,1992; D rocourt等人，1990）。
酵母转录因子GAL4结构特点GAL4包括两个彼此分离的但
用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分 开，并放在同一宿主细胞中表达。
将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质 Bait protein的基因构建在同一个表达 载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白 BD-Bait protei体上。
蛋白质X DNA-BD
GAL1 UAS
（上游激活序列） 启动子 Lac Z(报告基因)
GAL4的AD同蛋白质Y结合，形成的杂种蛋 白，未与UAS序列结合，不能启动报导基因 转录。
AD上游激活序列）
Lac Z(报告基因)
通过此两个杂种蛋白中的X与Y的相互作用， 在细胞内重建了GAL4的功能，启动报导基 因表达。
TFⅡD识别TATA TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合体 TFⅡB为桥梁并提供结合表面,促使
TFⅡF-RNA pol复合结构进入启动子核 心区TATA. TFⅡE的ATPase分解ATP,解开DNA双 螺旋. TFⅡH进入完成转录起始前复合物(PIC) 启动合成RNA第一个碱基.
二者均可在大肠杆菌和酿酒酵母中自主复 制。
两种融合蛋白可在酵母中高表达。在核定 位序列作用下，进入酵母细胞核内。
（ADH1:醇脱氢酶1）
实验程序
1 分别重组两种穿梭质粒载体。 2 分别导入E.coli培养。 3 分别提取两种质粒。 4 转化酵母菌 5 筛选阳性克隆
应用---蛋白质相互作用
上游更远处 增强子 统称顺式作用元件
转录因子
能直接或间接辨认和结合上游区段DNA 的蛋白质----反式作用因子.
其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的 称为转录因子(TF).
相应于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的转录因子为 TF Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ
真核生物的TFⅡ又分为TFⅡ A与TFⅡ B
酵母双杂交原理介绍
酵母双杂交技术酵母双杂交技术¾酵母双杂交系统( two-hybridsystem) 也叫相互作用陷阱( interaction trap)，是1989年由Song和Field基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统建立的。
¾酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法，在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取得了许多有价值的重要发现。
在此基础上又发展了反向双杂交，三杂交及核外双杂交等多项技术。
Stanley Field酵母双杂交技术的提出2.酵母双杂交原理介绍酵母中，半乳糖代谢所需的基因被两个调节蛋白所控制：GAL4，GAL80当存在半乳糖时，GAL4蛋白与UAS上游的基因中的GAL4效应元件结合，激活转录。
不存在半乳糖时，GAL80结合GAL4阻碍转录激活。
2.酵母双杂交原理介绍完整的酵母转录因子GAl4分为结构上可以分开的、功能上又相互独立的2个结构域。
一个是位于N端1-174位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain, DNA-BD）。
另一个是位于C端768～881位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain，AD）。
酵母双杂交技术原理很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
酵母双杂交系统组成酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)；(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)；(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和绿色荧光蛋白等2.酵母双杂交原理介绍一个酵母双杂交系统包括3个部分：带有1个或多个报告基因的宿主菌株；与GAL4-BD 融合表达蛋白，被表达的蛋白称为旅馆诱饵蛋白（bait）；GAL4-AD 融合表达载体，被表达的蛋自称为靶蛋白（prey）。
酵母单杂交的原理与应用实例
的结果 。
图 1 酵母单杂交原理示意图
转录因子与顺式元件结合 ,激活最基本启动子 Pmin ,使报道基因 表达 。构建 3 个顺式元件 ,可增强转录因子的识别和结合效率 。
Yamaguchi2Shinozaki 等从干旱处理的拟南芥中 克隆了 9 个受干旱胁迫诱导基因 , 定名为 RD ( re2 sponsive to dehydration) 基因群 。其中最引人注目的 一个是 rd29A 基因 ,它不仅受干旱的诱导 ,也受高盐 及低温的诱导 。通过启动子分析 ,鉴定出与干旱高 盐及低温胁迫下 rd29A 基因表达调控有关的顺式作 用元件 ,称为 DRE 顺式作用元件 (dehydration2respon2 sive element ) [5] , 序 列 为 TACCGACAT。Liu 等 利 用 DRE 顺式作用元件和酵母单杂交方法 , 克隆了与 DRE 元件特异性结合并在上述胁迫条件下调控报 道基因表达的 DREB 转录因子[6] 。本文以 DREB 转 录因子基因 (cDNA) 的克隆为例 ,介绍如何应用酵母 单杂交方法来获得编码特定转录因子的 cDNA ,并验 证它与特定的顺式作用元件植物进行适当处理 (如干旱或低温等) ,可诱导编码 目的转录因子 mRNA 的大量生成 ,使的因子的 mRNA 生成量提高 10～20 倍 ,筛选 60 万个酵母转化子 ,就有可能获得 10～20 个阳性克隆 。
毕赤酵母常用培养基与载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
酵母双杂基础知识总结
酵母双杂基础知识总结酵母双杂原理：酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。
主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。
上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。
例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。
因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。
常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。
〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
酵母表达载体是什么？
酵母表达载体是什么？
结构组成及表达元件
来⾃pBR322基本⾻架含有该质粒复制起始位点(ori)，lacZ基因、bla或ampr、tetr等基因。
含有URA3、HIS3、LEU2、TRPl、LYS2与特定的宿主营养缺陷突变体互补筛选或利⽤zeocin、basticidin（杀稻瘟菌素）的抗性基因筛选。
启动⼦有GAP、AOXl、AUGl和GAL1等。
特点或优点
GAP是组成型启动⼦。
其余是诱导型启动⼦。
酵母表达载体多为穿梭载体：既可以在⼤肠杆菌中繁殖，获得⾜够的载体DNA进⾏体外操作，⼜可以在酵母中复制、表达和选择。
融合蛋⽩表达载体：于外源基因插⼊位点的C端或N端插⼊了1个6×His标签，或在5’端插⼊了α-因⼦作为分泌信号
备注
由于原核⽣物和真核⽣物存在糖基化、酰基化等翻译后修饰反应机制的差异，真核基因的原核表达难以获得有活性的蛋⽩。
酵母成为真核表达的⾸选系统。
酵母杂交实验常见问题——单杂知识及自激活检测篇
酵母杂交实验常见问题——单杂知识及自激活检测篇下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!题目:酵母杂交实验常见问题——单杂知识及自激活检测篇酵母杂交是一种广泛应用于蛋白质功能研究的实验方法,但在实际操作中仍会遇到一些常见问题。
酵母转录因子GAL4结构特点GAL4包括两个彼此分离的但
GAL1 UAS
启动子
（上游激活序列）
Lac Z(报告基因)
缺陷型宿主菌株
常见的有SF562和HF7c. 特点：
无表达GAL4转录激活因子的能力
载体------穿梭质粒
pGBT9, 又称DNA-BD质粒载体。靶基 因插入可与GAL4-BD形成融合蛋白Ⅰ。
pGAD424，又称AD质粒载体。靶基因 插入可与GAL4-AD形成融合蛋白Ⅱ。
上游更远处 区段DNA 的蛋白质----反式作用因子.
其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的 称为转录因子(TF).
相应于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的转录因子为 TF Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ
真核生物的TFⅡ又分为TFⅡ A与TFⅡ B
真核生物转录起始前复合物
基本原理
DNA结合域（DNA-BD）：N端1-147 氨基酸
转录激活域（AD）：C端786-881氨基 酸
DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的 激活序列（UAS） ，并与之结合
AD：通过同转录机制(transcription machinery)的其它成分之间的结合以启 动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。
TFⅡD识别TATA TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合体 TFⅡB为桥梁并提供结合表面,促使
TFⅡF-RNA pol复合结构进入启动子核 心区TATA. TFⅡE的ATPase分解ATP,解开DNA双 螺旋. TFⅡH进入完成转录起始前复合物(PIC) 启动合成RNA第一个碱基.
筛选单抗 蛋白质-蛋白质相互作用 筛选酶抑制剂 …
产生的GAL4 DNA-BD和AD多肽
不直接发生相互作用，不能激活相关的效 应基因进行转录
同时用上述两种载体转化改造后的酵 母，这种改造后的酵母细胞的基因组 中不能产生GAL4。
酵母表达系统
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子
AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
2、甲醇酵母表达系统的优缺点
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL80 GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控
B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录 C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差
1）AOX1位点插入
宿主株:GS115、KM71 可插入位点：
5’AOX1 3’AOX1 TT
转化子： GS115:His+Mut+
KM71:His+Muts
2）His4位点插入
宿主株:GS115、KM71 可插入位点：
5’His4 3’His4
转化子： GS115:His+Mut+
KM71:His+Muts
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶
A、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%以上
B、名称和拷贝数不同
毕赤酵母/假丝酵母
汉森酵母
醇氧化酶
甲醇氧化酶
alcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOX
AOX1、AOX2
MOX
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
酵母单杂交 实验步骤总结
1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。
大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。
首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。
（1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。
（2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。
（3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。
（4）95 ︒C保温30 s，去除二级结构。
（5）72 ︒C保温2 min，37 ︒C保温2 min，25 ︒C保温2min。
注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。
（6）冰上放置。
退火后的产物可贮存在-20 ︒C冰箱备用。
（7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。
注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。
（8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。
（9）在连接反应管中加入如下成分：pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μLannealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μLBSA（10 mg/mL）0.5 μLNuclease-free H2O 10.5 μLT4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL总体积15 μL注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。
（10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。
研究蛋白互作，这三个经典实验你都知道吗？
研究蛋白互作，这三个经典实验你都知道吗？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，因为在十几年前，大家对非编码RNA的研究还没有现在这么热，因为研究的分子是蛋白，找的靶分子也是蛋白，研究的文章发在JBC杂志上的也非常多。
小张有时在想，JBC作为老牌名刊，尽管杂志不能只看影响因子，不过近几年影响因子怎么一直在降呢？都快跌破4分了。
当然，JBC不是今天的主题，我们主要说蛋白和蛋白作用。
研究蛋白作用的方法有很多，今天我们介绍三个：酵母双杂交，CoIP和GST-pulldown。
酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid System,Y2H)酵母双杂交技术是验证蛋白间相互作用的经典方法之一。
原理是在真核细胞调控转录过程中的转录激活因子GAL4的两个结构域：DNA结合域BD与转录激活域AD在分离的时候不具有转录激活功能，而当两者结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
因此，我们将所要研究的目的基因（蛋白A和蛋白B）分别装载到这两个质粒载体中，两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。
当转入相应酵母菌株后，若在酵母内表达的不同蛋白发生互作，则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合，再进一步与上游激活序列结合，激活相应报告基因的表达。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）免疫共沉淀是另一种研究蛋白相互作用的经典方法。
原理是如果蛋白A与蛋白B（直接或间接）结合，那么当我们用抗体去结合蛋白A的时候，蛋白B也能被拉下来；当然，反之亦然。
因此，首先提取蛋白，然后在提取的蛋白中加入蛋白X的抗体，孵育后再加入Protein A 或G(于Agarose 或magnetic beads等介质上)，然后变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过Western Blot检测蛋白B，当然，也可以直接将沉淀下来的蛋白通过质谱分析其它蛋白。
GST-pulldownGST pulldown 是另一项验证蛋白相互作用的经典实验，其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过WB或者质谱进行检测和鉴定。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
pAD-GAL4-2.1编号 载体名称北京华越洋生物VECT2300 pAD-‐GAL4-‐2.1载体基本信息出品公司: Stratagene（Agilent）载体名称: pAD-‐GAL4-‐2.1质粒类型: 酵母双杂交载体；酵母噬粒载体 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶启动子: ADH1载体大小: 7653 b p5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: 无载体抗性: 氨苄青霉素Ampicillin真核筛选标记: LEU2克隆菌株: XL1-‐Blue M RF'表达菌株: YRG-‐2备注: 含a b eta-‐gal报告基因。
配套载体为pBD-‐GAL4-‐Cam。
产品目录号: #838401-‐13组成型/诱导型: 组成型载体质粒图谱和多克隆位点信息载体简介酵母双杂交系统Protein–protein interactions occur in many biological processes including replication, transcription, secretion, signal transduction, and metabolism. A fundamental question in the study of any protein is to identify proteins that interact with a given protein in vivo. Intense research e fforts a re f ocused o n t he i dentification o f t hese p roteins.The G AL4 t wo-‐hybrid p hagemid v ector s ystem, a e ukaryoticsystem to detect protein–protein interactions in vivo, provides a method for the rapid identification of genes encoding proteins that interact with a given protein (i.e., a bait protein).1,2 The system is based on the ability to separate eukaryotic transcriptional activators into two separate domains, the DNAbinding domain (BD) and the transcriptional activation domain (AD).In t he G AL4 t wo-‐hybrid p hagemid v ector s ystem, p roteins t hat i nteract w ith t he b ait p rotein a re identified by generating hybrids of the yeast GAL4 BD and the bait protein (X) and the GAL4 ADand a l ibrary o f p roteins (Y). N either h ybrid p rotein i s c apable o f i nitiating s pecific t ranscription of r eporter g enes i n y east i n t he a bsence o f a s pecific i nteraction w ith t he o ther h ybrid p rotein. When t he h ybrid p rotein X i s e xpressed i n y east, t he G AL4 B D b inds X t o s pecific D NA s equences in the yeast chromosome defined by the GAL1 or GAL4 upstream activating sequences (UASGAL1 o r U ASGAL4, r espectively), w hich r egulate t he e xpression o f a r eporter g ene. B inding of X t o t he U AS i s n ot s ufficient t o i nitiate t ranscription o f t he r eporter g ene. W hen Y i s e xpressed in yeast, the AD interacts with other components of the transcription machinery required to initiate t ranscription o f t he r eporter g ene. H owever, Y a lone i s n ot l ocalized t o t he r eporter g ene UAS and therefore does not activate transcription of the reporter gene. When a specific interaction between X and Y localizes both the GAL4 BD and GAL4 AD to the reporter gene UAS, transcriptional activation of the reporter gene occurs (Figure 2B). The reporter genes in the GAL4 t wohybrid p hagemid v ector s ystem a re β-‐galactosidase (lacZ) a nd h istidine (HIS3).双杂交载体pAD-‐GAL4-‐2.1和pBD-‐GAL4-‐CamThe pAD-‐GAL4-‐2.1 phagemid vector contains a multiple cloning site (MCS) with BamH I, Nhe I, EcoR I, Xho I, Sal I, Xba I, Pst I, and Bgl II restriction sites. The pBD-‐GAL4-‐Cam phagemid vector contains a n M CS w ith E coR I, S rf I, S ma I, X ho I, S al I, X ba I, a nd P st I r estriction s ites. T he u nique EcoR I and Xho I cloning sites in the pAD-‐GAL4-‐2.1 vector make this vector compatible with the Agilent c DNA S ynthesis K it f or t he p reparation o f u nidirectional c DNA l ibraries.The unique EcoR I and Sal I cloning sites are used for the preparation of cDNA libraries in the pBD-‐GAL4 Cam phagemid vector because the Xho I site in the MCS is not unique. The unique BamH I, Nhe I, and EcoR I sites at the 5´ end and the Xho I, Sal I, Xba I, and Bgl II sites at the 3´ end of the DNA insert facilitate the transfer of DNA encoding the target protein into commonly used protein expression/purification vectors. Genomic DNA digested with Mbo I, BamH I, or Sau3A I and partially filled-‐in can be inserted into a partially filled-‐in Xho I site in the pAD-‐GAL4-‐2.1 phagemid vector. The Xba I site in the pAD-‐GAL4-‐2.1 and pBD-‐GAL4-‐Cam phagemid vectors is not unique and contains the UAG amber suppressor in the same translational r eading f rame a s t he G AL4 d omain. D NA s hould t herefore b e i nserted s uch t hat t he Xba I s ite i s n ot b etween t he G AL4 d omain a nd t he D NA i nsert.The pAD-‐GAL4-‐2.1 and pBD-‐GAL4 Cam phagemid vectors contain the pUC origin for replication and an f1 origin for production of single-‐stranded DNA (ssDNA) in E. coli. Single-‐stranded DNA can be used for DNA sequencing or site-‐directed mutagenesis. The pAD-‐GAL4-‐2.1 and pBDGAL4-‐Cam phagemid vectors contain ampicillin-‐resistance gene [β-‐lactamase (bla)] and chloramphenicol acetyltransferase genes, respectively, for selection with ampicillin and chloramphenicol in E. coli. The pADGAL4-‐2.1 and pBD-‐GAL4 Cam phagemid vectors contain the 2μ origin for replication. For selection in yeast, the pAD-‐GAL4-‐2.1 phagemid vector contains the LEU2 g ene a nd t he p BD-‐GAL4 C am p hagemid v ector c ontains t he T RP1 g ene. T he h ybrid p rotein is expressed by the alcohol dehydrogenase 1 (ADH1) promoter (P ADH1) and is terminated by the A DH1 t erminator (T A DH1).载体序列pAD-‐GAL4-‐2.1, 7653 b p version 122001NOTE: The following sequence has been verified for accuracy at the junctions. The remainder of the s equence h as b een o btained f rom e xisting d ata.1 GCTTGCATGC AACTTCTTTT CTTTTTTTTT CTTTTCTCTC TCCCCCGTTG51 TTGTCTCACC ATATCCGCAA TGACAAAAAA AATGATGGAA GACACTAAAG101 GAAAAAATTA ACGACAAAGA CAGCACCAAC AGATGTCGTT GTTCCAGAGC151 TGATGAGGGG TATCTTCGAA CACACGAAAC TTTTTCCTTC CTTCATTCAC201 GCACACTACT CTCTAATGAG CAACGGTATA CGGCCTTCCT TCCAGTTACT251 TGAATTTGAA ATAAAAAAAG TTTGCCGCTT TGCTATCAAG TATAAATAGA301 CCTGCAATTA TTAATCTTTT GTTTCCTCGT CATTGTTCTC GTTCCCTTTC351 TTCCTTGTTT CTTTTTCTGC ACAATATTTC AAGCTATACC AAGCATACAA401 TCAACTCCAA GCTTTGCAAA GATGGATAAA GCGGAATTAA TTCCCGAGCC451 TCCAAAAAAG AAGAGAAAGG TCGAATTGGG TACCGCCGCC AATTTTAATC501 AAAGTGGGAA TATTGCTGAT AGCTCATTGT CCTTCACTTT CACTAACAGT551 AGCAACGGTC CGAACCTCAT AACAACTCAA ACAAATTCTC AAGCGCTTTC601 ACAACCAATT GCCTCCTCTA ACGTTCATGA TAACTTCATG AATAATGAAA651 TCACGGCTAG TAAAATTGAT GATGGTAATA ATTCAAAACC ACTGTCACCT701 GGTTGGACGG ACCAAACTGC GTATAACGCG TTTGGAATCA CTACAGGGAT751 GTTTAATACC ACTACAATGG ATGATGTATA TAACTATCTA TTCGATGATG801 AAGATACCCC ACCAAACCCA AAAAAAGAGA TCGAATTAGG ATCCTCTGCT851 AGCAGAGAAT TCAATTCTCT AATGCTTCTC GAGAGTATTA GTCGACTCTA901 GAGCCCTATA GTGAGTCGTA TTACTGCAGA GATCTATGAA TCGTAGATAC951 TGAAAAACCC CGCAAGTTCA CTTCAACTGT GCATCGTGCA CCATCTCAAT1001 TTCTTTCATT TATACATCGT TTTGCCTTCT TTTATGTAAC TATACTCCTC1051 TAAGTTTCAA TCTTGGCCAT GTAACCTCTG ATCTATAGAA TTTTTTAAAT1101 GACTAGAATT AATGCCCATC TTTTTTTTGG ACCTAAATTC TTCATGAAAA1151 TATATTACGA GGGCTTATTC AGAAGCTTTG GACTTCTTCG CCAGAGGTTT1201 GGTCAAGTCT CCAATCAAGG TTGTCGGCTT GTCTACCTTG CCAGAAATTT1251 ACGAAAAGAT GGAAAAGGGT CAAATCGTTG GTAGATACGT TGTTGACACT1301 TCTAAATAAG CGAATTTCTT ATGATTTATG ATTTTTATTA TTAAATAAGT1351 TATAAAAAAA ATAAGTGTAT ACAAATTTTA AAGTGACTCT TAGGTTTTAA1401 AACGAAAATT CTTGTTCTTG AGTAACTCTT TCCTGTAGGT CAGGTTGCTT1451 TCTCAGGTAT AGCATGAGGT CGCTCTTATT GACCACACCT CTACCGGCAT1501 GCCCGAAATT CCCCTACCCT ATGAACATAT TCCATTTTGT AATTTCGTGT1551 CGTTTCTATT ATGAATTTCA TTTATAAAGT TTATGTACAA ATATCATAAA1601 AAAAGAGAAT CTTTTTAAGC AAGGATTTTC TTAACTTCTT CGGCGACAGC1651 ATCACCGACT TCGGTGGTAC TGTTGGAACC ACCTAAATCA CCAGTTCTGA1701 TACCTGCATC CAAAACCTTT TTAACTGCAT CTTCAATGGC CTTACCTTCT1751 TCAGGCAAGT TCAATGACAA TTTCAACATC ATTGCAGCAG ACAAGATAGT1801 GGCGATAGGG TCAACCTTAT TCTTTGGCAA ATCTGGAGCA GAACCGTGGC1851 ATGGTTCGTA CAAACCAAAT GCGGTGTTCT TGTCTGGCAA AGAGGCCAAG1901 GACGCAGATG GCAACAAACC CAAGGAACCT GGGATAACGG AGGCTTCATC1951 GGAGATGATA TCACCAAACA TGTTGCTGGT GATTATAATA CCATTTAGGT 2001 GGGTTGGGTT CTTAACTAGG ATCATGGCGG CAGAATCAAT CAATTGATGT 2051 TGAACCTTCA ATGTAGGAAA TTCGTTCTTG ATGGTTTCCT CCACAGTTTT 2101 TCTCCATAAT CTTGAAGAGG CCAAAACATT AGCTTTATCC AAGGACCAAA 2151 TAGGCAATGG TGGCTCATGT TGTAGGGCCA TGAAAGCGGC CATTCTTGTG 2201 ATTCTTTGCA CTTCTGGAAC GGTGTATTGT TCACTATCCC AAGCGACACC 2251 ATCACCATCG TCTTCCTTTC TCTTACCAAA GTAAATACCT CCCACTAATT 2301 CTCTGACAAC AACGAAGTCA GTACCTTTAG CAAATTGTGG CTTGATTGGA 2351 GATAAGTCTA AAAGAGAGTC GGATGCAAAG TTACATGGTC TTAAGTTGGC 2401 GTACAATTGA AGTTCTTTAC GGATTTTTAG TAAACCTTGT TCAGGTCTAA 2451 CACTACCTGT ACCCCATTTA GGACCACCCA CAGCACCTAA CAAAACGGCA 2501 TCAACCTTCT TGGAGGCTTC CAGCGCCTCA TCTGGAAGTG GGACACCTGT 2551 AGCATCGATA GCAGCACCAC CAATTAAATG ATTTTCGAAA TCGAACTTGA 2601 CATTGGAACG AACATCAGAA ATAGCTTTAA GAACCTTAAT GGCTTCGGCT 2651 GTGATTTCTT GACCAACGTG GTCACCTGGC AAAACGACGA TCTTCTTAGG 2701 GGCAGACATT AGAATGGTAT ATCCTTGAAA TATATATATA TATTGCTGAA 2751 ATGTAAAAGG TAAGAAAAGT TAGAAAGTAA GACGATTGCT AACCACCTAT 2801 TGGAAAAAAC AATAGGTCCT TAAATAATAT TGTCAACTTC AAGTATTGTG 2851 ATGCAAGCAT TTAGTCATGA ACGCTTCTCT ATTCTATATG AAAAGCCGGT 2901 TCCGGCCTCT CACCTTTCCT TTTTCTCCCA ATTTTTCAGT TGAAAAAGGT 2951 ATATGCGTCA GGCGACCTCT GAAATTAACA AAAAATTTCC AGTCATCGAA 3001 TTTGATTCTG TGCGATAGCG CCCCTGTGTG TTCTCGTTAT GTTGAGGAAA 3051 AAAATAATGG TTGCTAAGAG ATTCGAACTC TTGCATCTTA CGATACCTGA 3101 GTATTCCCAC AGTTGGGGAT CTCGACTCTA GCTAGAGGAT CAATTCGTAA 3151 TCATGGTCAT AGCTGTTTCC TGTGTGAAAT TGTTATCCGC TCACAATTCC 3201 ACACAACATA CGAGCCGGAA GCATAAAGTG TAAAGCCTGG GGTGCCTAAT 3251 GAGTGAGGTA ACTCACATTA ATTGCGTTGC GCTCACTGCC CGCTTTCCAG 3301 TCGGGAAACC TGTCGTGCCA GTTATATGCG GCCGCATAAT TTAGGCGCGT 3351 AAATTGTAAG CGTTAATATT TTGTTAAAAT TCGCGTTAAA TTTTTGTTAA 3401 ATCAGCTCAT TTTTTAACCA ATAGGCCGAA ATCGGCAAAA TCCCTTATAA 3451 ATCAAAAGAA TAGACCGAGA TAGGGTTGAG TGTTGTTCCA GTTTGGAACA 3501 AGAGTCCACT ATTAAAGAAC GTGGACTCCA ACGTCAAAGG GCGAAAAACC 3551 GTCTATCAGG GCGATGGCCC ACTACGTGAA CCATCACCCT AATCAAGTTT 3601 TTTGGGGTCG AGGTGCCGTA AAGCACTAAA TCGGAACCCT AAAGGGAGCC 3651 CCCGATTTAG AGCTTGACGG GGAAAGCCGG CGAACGTGGC GAGAAAGGAA 3701 GGGAAGAAAG CGAAAGGAGC GGGCGCTAGG GCGCTGGCAA GTGTAGCGGT 3751 CACGCTGCGC GTAACCACCA CACCCGCCGC GCTTAATGCG CCGCTACAGG 3801 GCGCGTCAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC CCCTATTTGT 3851 TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA GACAATAACC 3901 CTGATAAATG CTTCAATAAT ATTGAAAAAG GAAGAGTCCT GAGGCGGAAA 3951 GAACCAGCTG TGGAATGTGT GTCAGTTAGG GTGTGGAAAG TCCCCAGGCT 4001 CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA GTCAGCAACC 4051 AGGTGTGGAA AGTCCCCAGG CTCCCCAGCA GGCAGAAGTA TGCAAAGCAT 4101 GCATCTCAAT TAGTCAGCAA CCATAGTCCC GCCCCTAACT CCGCCCATCC4151 CGCCCCTAAC TCCGCCCAGT TCCGCCCATT CTCCGCCCCA TGGCTGACTA 4201 ATTTTTTTTA TTTATGCAGA GGCCGAGGCC GCCTCGGCCA TTACAGCTGG 4251 ATTAATGAAT CGGCCAACGC GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC 4301 TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG 4351 GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA TCCACAGAAT 4401 CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC 4451 AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC 4501 CCCTGACGAG CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC 4551 CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG 4601 CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC GGATACCTGT CCGCCTTTCT 4651 CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCATAG CTCACGCTGT AGGTATCTCA 4701 GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC 4751 GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA 4801 CCCGGTAAGA CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA 4851 TTAGCAGAGC GAGGTATGTA GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG 4901 CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA TTTGGTATCT GCGCTCTGCT 4951 GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC 5001 AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG 5051 CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC 5101 TGACGCTCAG TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT 5151 TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT 5201 AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT TGGTCTGACA GTTACCAATG 5251 CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA 5301 TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA 5351 CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC 5401 TCCAGATTTA TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA 5451 GTGGTCCTGC AACTTTATCC GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG 5501 GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC 5551 CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT 5601 TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG 5651 TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA 5701 GTTGGCCGCA GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC 5751 TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA 5801 ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG CGACCGAGTT GCTCTTGCCC 5851 GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC 5901 TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG 5951 CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC 6001 AGCATCTTTT ACTTTCACCA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC 6051 AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC 6101 ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG GTTATTGTCT 6151 CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG 6201 TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC CTGACGTCTA AGAAACCATT 6251 ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG CGTATCACGA GGCCCTTTCG 6301 TCTCGCGCGT TTCGGTGATG ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC6351 CGGAGACGGT CACAGCTTGT CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC 6401 CGTCAGGGCG CGTCAGCGGG TGTTGGCGGG TGTCGGGGCT GGCTTAACTA 6451 TGCGGCATCA GAGCAGATTG TACTGAGAGT GCACCATAAC GCATTTAAGC 6501 ATAAACACGC ACTATGCCGT TCTTCTCATG TATATATATA TACAGGCAAC 6551 ACGCAGATAT AGGTGCGACG TGAACAGTGA GCTGTATGTG CGCAGCTCGC 6601 GTTGCATTTT CGGAAGCGCT CGTTTTCGGA AACGCTTTGA AGTTCCTATT 6651 CCGAAGTTCC TATTCTCTAG CTAGAAAGTA TAGGAACTTC AGAGCGCTTT 6701 TGAAAACCAA AAGCGCTCTG AAGACGCACT TTCAAAAAAC CAAAAACGCA 6751 CCGGACTGTA ACGAGCTACT AAAATATTGC GAATACCGCT TCCACAAACA 6801 TTGCTCAAAA GTATCTCTTT GCTATATATC TCTGTGCTAT ATCCCTATAT 6851 AACCTACCCA TCCACCTTTC GCTCCTTGAA CTTGCATCTA AACTCGACCT 6901 CTACATTTTT TATGTTTATC TCTAGTATTA CTCTTTAGAC AAAAAAATTG 6951 TAGTAAGAAC TATTCATAGA GTGAATCGAA AACAATACGA AAATGTAAAC 7001 ATTTCCTATA CGTAGTATAT AGAGACAAAA TAGAAGAAAC CGTTCATAAT 7051 TTTCTGACCA ATGAAGAATC ATCAACGCTA TCACTTTCTG TTCACAAAGT 7101 ATGCGCAATC CACATCGGTA TAGAATATAA TCGGGGATGC CTTTATCTTG 7151 AAAAAATGCA CCCGCAGCTT CGCTAGTAAT CAGTAAACGC GGGAAGTGGA 7201 GTCAGGCTTT TTTTATGGAA GAGAAAATAG ACACCAAAGT AGCCTTCTTC 7251 TAACCTTAAC GGACCTACAG TGCAAAAAGT TATCAAGAGA CTGCATTATA 7301 GAGCGCACAA AGGAGAAAAA AAGTAATCTA AGATGCTTTG TTAGAAAAAT 7351 AGCGCTCTCG GGATGCATTT TTGTAGAACA AAAAAGAAGT ATAGATTCTT 7401 TGTTGGTAAA ATAGCGCTCT CGCGTTGCAT TTCTGTTCTG TAAAAATGCA 7451 GCTCAGATTC TTTGTTTGAA AAATTAGCGC TCTCGCGTTG CATTTTTGTT 7501 TTACAAAAAT GAAGCACAGA TTCTTCGTTG GTAAAATAGC GCTTTCGCGT 7551 TGCATTTCTG TTCTGTAAAA ATGCAGCTCA GATTCTTTGT TTGAAAAATT 7601 AGCGCTCTCG CGTTGCATTT TTGTTCTACA AAATGAAGCA CAGATGCTTC 7651 GTT其他酵母表达载体：p416GFD pPIC9p53blue pPIC9KpACT2-AD pPIC9k-HispAD-GAL4-2.1 pPICZApADH2 pPICZBpAUR123 pPICZCpBridge pPICZαApCL1 pPICZαBpDEST32 pPICZαCpDisplay pPICZαDpDR195 pPICZαFCpESC-His pPICZαGBpESC-Leu pPink-HCpESC-TRP pPink-LCpESC-URA pPinkα-HC pFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pRS316 pFLD pRS403 pFLD/CAT pRS405 pFLDαpRS406 pGADT7-T pRS414 pGAG424 pRS415 pGAPZA pRS416 pGAPZB pRS41H pGAPZαB pRS426 pGAPZαC pRS426gal pGBKT7 pSEP1 pGBKT7-53 pSEP2 pGBKT7-Lam pSEP3pHIC-PI pSospHIL-D2 pSos-MAFB pHIL-S1 pUG66pHis2 pYC2/CT pHisSi-1 pYC2/NTA pMETA pYC2/NTB pMETB pYCP211 pMETC pYEPlac112 pMETαA pYEPlac195 pMETαB pYES2pMETαC pYES2-EGFP pMyr pYES2-kan pPIC3.5 pYES2-NTA pPIC3.5K pYES2-NTB pPIC6B pYES2-NTC pPIC6C pYES3/CT pPIC6αA pYES6/CT pPIC6αB pYES-DEST52 pPIC6αC pYIP211 pYX212 pYIP5 SUMOprotease pYRP7Ycp22lac-EGFP Ycplac33。