酵母表达系统
酵母表达系统
C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
性结合因子：MF-α
酸性磷酸酯酶：PHO5
蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
酿酒酵母信号肽特点
*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用
*信号肽结构：
Met 信号肽剪切位点
正电荷区 疏水区
极性区
目的蛋白
MF-α信号肽
*分泌效率高
*在酵母统具有通用性
*88个残基组成
Met KEX2 DAP DAP
AOX1与AOX2 *毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因 AOX1、AOX2 *AOX1与AOX2基因97%同源 *AOX1 占主导地位，负责AOX 99%以上活性
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
8）表达产物稳定性
分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素
降低培养基pH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低
培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制
采用蛋白酶缺陷宿主株：如P.pastoris SMD1168
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
酵母表达(1)
酵母表达引言酵母是一类单细胞真核生物，被广泛应用于生物学研究中。
酵母表达系统是指利用酵母细胞表达外源基因的技术，被广泛应用于蛋白质的高效表达和产量大规模生产。
本文将介绍酵母表达系统的原理、优势和应用。
原理酵母表达系统的核心原理是将外源基因导入酵母细胞，并通过酵母细胞的转录、翻译和修饰机制，使外源基因在酵母细胞中得到表达和功能发挥。
通常情况下，酵母表达系统主要采用酵母菌属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主细胞。
1.酵母转录机制：酵母细胞的基因表达主要通过RNA聚合酶Ⅱ进行转录，产生mRNA分子。
2.酵母翻译机制：酵母细胞通过核糖体进行翻译，将mRNA翻译成蛋白质。
3.酵母修饰机制：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等。
优势相比其他常用的表达系统，酵母表达系统具有一系列的优势：1.高效表达能力：酵母表达系统能够实现高水平的外源基因表达，产量可达到克级。
2.翻译后修饰：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，使蛋白质得到正确的糖基化等修饰。
3.生长条件简单：酵母菌生长条件相对简单，可以在常规培养基中进行培养，对培养条件的要求相对较低。
4.可溶性蛋白质表达：酵母细胞具有较强的蛋白质折叠和修饰能力，能够高效地表达可溶性蛋白质。
应用酵母表达系统广泛应用于以下领域：1.蛋白质研究：酵母表达系统可用于大规模蛋白质表达和纯化，为蛋白质的结构、功能和相互作用研究提供了高效的工具。
2.药物筛选：酵母表达系统可用于药物靶点鉴定和药物分子筛选，加速药物研发过程。
3.疫苗研究：酵母表达系统可用于疫苗候选抗原的高效表达和产量大规模生产。
4.代谢工程：酵母表达系统可用于代谢工程领域，利用酵母细胞对外源代谢产物的高效合成能力，实现产生复杂化合物的目标。
5.生物制药：酵母表达系统已经被广泛应用于生物制药领域，用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。
酵母菌的遗传工程和表达系统
酵母菌的遗传工程和表达系统酵母菌是一种常见的单细胞真菌，广泛存在于自然界中。
由于其易于培养、生长速度快、基因组较小、剪接机制类似于哺乳动物细胞等优点，酵母菌成为了功能基因组学、代谢工程学、蛋白质工程学等领域中的重要模型生物。
而酵母菌的遗传工程和表达系统则为这些研究提供了基础和保障。
酵母菌的遗传工程主要包括基因克隆、拷贝数调控、基因敲除、基因组编辑、基因表达调控、代谢通路调控等方面。
其中，基因克隆是构建目的基因载体的重要步骤，一般通过 PCR 扩增或基于荧光报告基因的克隆方法来实现。
而拷贝数调控则指通过操纵载体的拷贝数，达到目的蛋白在酵母细胞中表达量的控制。
酵母菌具有高度重组能力以及泛素降解酶机制，因此基因敲除和基因组编辑等操作在酵母菌中较为容易实现。
基因表达调控则是酵母细胞酿酒业中的重要应用，通过调节转录、翻译后修饰等环节来实现产品的调控。
代谢通路调控则是通过调节酵母菌内一系列代谢酶的表达量或活性来增加特定产物的产量。
酵母菌的表达系统则包括基于质粒的表达和基于基因组的表达两种方式。
质粒表达是将目的基因克隆至质粒中，然后将质粒转化至酵母细胞中，通过调控拷贝数和选择适当的启动子及终止子等措施实现表达。
而基因组表达则是将基因克隆至某一位点上，在酵母菌表达生命周期较长的时期内带来更稳定的表达效果，尤其适用于连续表达大规模生物分子的场合。
同时，可以采用多个方面的策略来处理表达过程中可能出现的问题，从而进一步优化表达效率和表达质量。
例如在 translational initiation 上加入特定元件、利用内质网信号肽将蛋白定向到内质网，从而利用内质网发生的翻译后修饰增加表达质量等等。
总之，酵母菌的遗传工程和表达系统为现代生物技术研究和产业化提供了重要的平台，无论从理论研究还是实践应用的角度来看，都具有广泛的前景和应用价值。
我们期待，基于酵母菌的遗传工程和表达系统将吸引更多的生物学家、遗传学家、代谢工程师、蛋白质化学家等多个领域的专家和研究人员的关注，一起推进这一新兴领域的发展和进步。
酵母表达系统在药物研发中的应用研究
酵母表达系统在药物研发中的应用研究酵母表达系统是一种利用酵母菌将外源基因表达的技术。
它广泛应用于药物研发中，是一种重要的基础研究方法。
下面就来探讨一下酵母表达系统在药物研发中的应用研究。
一、酵母表达系统的基本原理酵母表达系统是利用酿酒酵母菌，将外来基因导入到酵母菌中，使其表达外源蛋白质。
外源基因通常以质粒的形式封装进入酵母细胞中，而通常采用的质粒是pYES2、pESC、pGADT等。
这些质粒都具备不同的特定序列，这些序列可以使酵母表达系统实现不同的功能。
在酵母菌表达外源蛋白的过程中，其主要遵循四个步骤:转录、翻译、修饰和定位。
其中，转录和翻译过程非常类似于真核细胞的情况，最终将形成蛋白质。
但是，由于酿酒酵母是一种真核细胞，因此它的蛋白质修饰和定位过程与真核细胞的过程也非常接近。
二、酵母表达系统在药物研发中的应用1. 基因筛选酵母表达系统是基因筛选的一种常用方法。
基因筛选是通过对外源基因随机插入到酵母细胞中，然后判断是否会导致生长缺陷或特定表型的改变。
这种方法常用于寻找与信号转导、代谢途径和基因调控等过程相关的基因。
2. 蛋白结构研究人类的某些蛋白在体内的折叠会受到转录后修饰的影响，出现拓扑结构的变化会对其功能产生很大影响。
利用酵母表达系统就能够在短时间内对蛋白质结构进行研究。
通过酵母菌表达外源蛋白的方法，可以使加入原蛋白质的一段序列在折叠时进行彻底的探究，便于寻找相应的结构域。
3. 药物筛选在药物研发中，酵母表达系统也常被用于药物筛选。
通过酵母表达外源蛋白的方法，可以筛选出一种或多种能够调控目标蛋白的物质，从而对药物进行优化。
例如，先在酵母菌中表达目标蛋白，在检测其功能后，针对它的活性位点进行筛选最优化的化合物。
这就是所谓的基于蛋白的药物发现。
三、酵母表达系统的优势和局限酵母表达系统在药物研发中有着广泛的应用，这是因为它具有许多优点。
首先，酵母表达系统简单、成本低。
其次，酵母表达系统样品预备时间短，能够快速得到高度纯净的蛋白质。
酵母表达系统与方法
1
酵母表达系统的产生
基因工程技术的发展为用微生物合成和生产外源蛋 白展示出广阔的前景。长期以来，人们用大肠杆菌作为 宿主表达了多种蛋白。这是因为大肠杆菌具有若干优点， 如：遗传背景和生化特性清楚、容易操作、生长迅速、 营养需求简单等。
但大肠杆菌表达系统存在若干缺陷：A：缺少真核 生物的蛋白翻译后修饰和加工，杂的复性才能恢复构象和活性；C：背景杂蛋白 很多、纯化起来麻烦；D：表达量一般不是很高。
◆裂殖酵母表达系统
Schizo saccharomyces pombe （粟酒裂殖糖酵母） 5
不同酵母表达系统的特点
◆ 酿酒酵母表达系统
表达载体：自主复制型和整合型 筛选标记: LEU2、URA3 启动子： PGK1、 PHO5、CUP1
6
7
成功表达的外源蛋白实例：
人重组干扰素
酿酒酵母表达系统的主要不足：
9
成功表达的外源蛋白实例：
人血清蛋白和白细胞介素1β
乳酸克鲁维亚酵母表达系统的独特优点：
可以高密度发酵； 不需要甲醇防爆装置； 工业化生产时不降低生产率及酵母菌的再繁殖能力。
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◆甲醇营养型酵母表达系统
甲醇作为唯一的能源和炭源
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表达载体：整合体型载体
（Invitrogene公司已开发出多种巴氏毕赤酵母表达载体 如：pPIC9, pHIL-D2, pHIL-S1,pPICZA, pPICZB, pPICZC系列和 pPICZaA, pPICZaB, pPICZa系列适 合于胞内和分泌的表达载体）
产生量（g/L） 2.3 0.8 2.5 1.0 1.7 12.0 3.0 1.3 10.0 4.0
文献 [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13]
酵母表达体系构建
酵母表达体系构建酵母表达体系是一种常用的基因表达系统，可以用于生产重组蛋白质、疫苗、抗体等生物制品。
构建酵母表达体系需要选择合适的酵母菌种、载体、目的基因以及必要的宿主细胞，并通过基因克隆、转化、筛选等一系列步骤实现。
本文将详细介绍酵母表达体系的构建过程。
一、选择酵母菌种和载体1．酵母菌种选择：根据需要表达的蛋白质的种类和性质，选择适合的酵母菌种。
常用的酵母菌种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）、Pichia pastoris（毕赤酵母）等。
2．载体选择：载体是携带目的基因进入宿主细胞的必要元件，常用的载体包括质粒、整合型载体和噬菌体载体等。
在构建酵母表达体系时，应根据目的基因的性质和表达量要求选择合适的载体。
二、目的基因的克隆和鉴定1．基因克隆：将目的基因插入到载体中，形成重组DNA分子。
可以通过PCR、基因文库等方法获取目的基因，也可以从基因组或cDNA文库中筛选出目的基因。
2．转化宿主细胞：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，常用的方法包括电穿孔法、转化法等。
3．阳性克隆筛选：通过菌落PCR或 southern 杂交等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
4．序列分析：对阳性克隆进行序列分析，确保目的基因正确插入载体中，并且没有发生任何突变。
三、构建酵母表达体系1．质粒制备：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行纯化和鉴定。
2．转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，常用的方法包括电穿孔法、热激法等。
3．筛选阳性克隆：通过 southern 杂交等方法筛选出含有重组质粒的阳性克隆。
4．鉴定表达产物：对阳性克隆进行蛋白质表达水平检测，常用的方法包括 western 杂交、ELISA等。
同时对表达产物进行生物活性检测，以评估表达产物的质量和功能。
5．优化表达条件：通过对培养条件（如温度、pH值、营养物质浓度等）进行优化，提高目的基因的表达水平和产量。
6．生产与纯化：在优化条件下进行大规模培养和表达，并对表达产物进行纯化和加工，以满足实际应用需求。
酵母表达系统在蛋白质工程中的应用
酵母表达系统在蛋白质工程中的应用在现代生物技术领域中，蛋白质工程无疑是一个越来越重要的领域。
蛋白质工程的目的就是为了通过合成、改造、再造蛋白质，让它们发挥更好的作用。
但要想顺利实现这个目标，首先需要一个强大的工具——酵母表达系统。
本文将着重讨论酵母表达系统在蛋白质工程中的应用。
一、酵母表达系统的概述酵母表达系统指的是用酵母作为外源基因表达的宿主系统。
通常我们所使用的酵母表达系统分为两大类：酵母菌株（氨基酸合成型酵母、酵母菌、诺霉菌等）和酵母质粒。
酵母表达系统具有诸多优点：（1）表达效率高，含量可达30%以上；（2）修饰完备，可形成天然蛋白质的完整结构；（3）简单方便，培养条件简单，易于大规模生产。
二、酵母表达系统在蛋白质工程中的应用1. 蛋白质的可合成性: 酵母表达系统不仅适用于表达人类基因，而且还可以表达来自其他生物体的蛋白质基因。
例如，酵母表达系统可以用来合成的大肠杆菌中无法表达的大分子蛋白质，如人源性因子VIII和因子IX。
2. 蛋白质的结构保护: 酵母表达系统在表达可溶性蛋白质时，可以避免因过量表达而引起的蛋白质不正确折叠、表达时段不对，以及蛋白质酶解等问题。
此外，酵母表达系统还可以进行多肽连接和修饰，从而提高蛋白质稳定性和活性。
3. 蛋白质结构改造: 酵母表达系统不仅适用于合成蛋白质，还可以将已知结构的蛋白质进行改造，如改变蛋白质的区域，添加、改变或缩短结构域等，使其得到改进。
例如，可以通过酵母表达系统制备出抗体、酶及酶替代剂等以及多个域之间衔接的蛋白质，这些蛋白质具有与天然蛋白质相同的生物活性，且更加稳定。
4. 蛋白质的特定细胞定位: 酵母表达系统的另一个重要优点在于可以针对性地调控蛋白的表达定位。
例如，可以将表达在酵母中的蛋白转运到特定的亚细胞区域中，从而实现细胞定位和功能分化。
此外，通过改变酵母中的蛋白质结构、质量和量，可以增加细胞发酵性能、生物转化过程和蛋白质反应的有效性。
三、酵母表达系统面临的挑战与以上的优点相对应，酵母表达系统也存在着一些挑战：（1）构建表达载体；（2）寻找适宜的宿主菌株；（3）了解基因调控和宿主代谢途径；（4）选择适合的培养条件等。
酵母表达系统
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子
AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
2、甲醇酵母表达系统的优缺点
甲醇酵母系统的整合事件
YRp型载体：汉森系统 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择
压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。 YIp型载体： A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组 B、有“插入”和“取代”二类整合模式 C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要特点
项目 最适温度 最适pH值 甘油阻遏 糖基化 高密度发酵
毕赤酵母 30℃ 4.5 是 部分过度 100g/L
汉森酵母 37℃ 4.5 否 较正常 100g/L
甲醇酵母系统宿主
A、表达水平高（最高水平的系统） B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化 C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150
个甘露糖） D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统） E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。 F、实验室和工业操作简单 G、不能满足结构要求严格的糖基化
1、转录起始位点； 2、TATA盒：富含AT； 3、UAS：上游激活序列;
4、URS：上游阻遏序列 5、DAS：下游激活序列
酿酒酵母表达系统常用启动子
1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH 磷酸甘油激酶基因PKG 乙醇脱氢酶基因ADH
酵母表达系统
酵母表达系统基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。
其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。
1、酵母表达系统的特点酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。
酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。
某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。
应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。
解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3.0~8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。
另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。
因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。
2、常用酵母表达系统(宿主-载体系统)（1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。
因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。
酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。
酵母表达系统-PPT课件
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。
体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达
高拷贝整合元件： A、高度重复序列：rDNA 提供多个整合位点 B、缺陷型标记基因：Leu2d
提高选择压力
C、抗性标记；neo 提高选择压力
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
表达载体类型
单位点
甲醇酵母系统胞内表达载体
需要带入ATG
多位点
表达载体类型
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：PHO1
甲醇酵母系统分泌表达载体
KM71:His+Muts
3’His4
3） 多基因插入事件（串联整合）
宿主株:GS115、KM71
可插入位点： 5’AOX1
3’AOX1
TT
转化子： GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts
4） 基因取代（GS115，AOX1+）
转化子：His4+Muts
汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体
信号肽：MFα
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：MFα 标记：Kan
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量
整合位点
甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化： 选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
酵母外源基因分泌表达系统
服务简介酵母具有与其他真核生物类似的蛋白质分泌途径，外源基因的分泌表达, 不仅方便了表达产物的分离纯化, 同时也和表达产物的翻译后加工有关, 很有意义。
酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具，酵母外源基因分泌表达系统（简称酵母外泌表达系统）采用的宿主是巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris），该表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。
服务原理甲醇酵母系统分泌表达载体巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）编码基因AOX1和AOX2，两种序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。
当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
服务优势1. 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达。
2. 培养成本低，产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基成本合理，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。
3. 外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能得到高表达菌株。
4. 作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。
酵母外泌表达系统的优势1. 具备完备的毕赤酵母表达平台，可以根据蛋白特性或客户的需求设计不同的实验方案；2. 具有高通量的筛选平台，可以快速有效的得到最佳表达条件；3. 具有大规模发酵生产能力服务内容科研人员建立了成熟的酵母表达纯化服务平台，提供优质的重组蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化服务。
酵母外泌表达系统服务项目:1.重组酵母表达质粒构建；2.重组质粒电转化；3.重组表达子筛选；4.小规模蛋白表达和纯化（2L培养基培养产物）；南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。
酵母表达系统
•巴斯德毕赤酵母 它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基 因的高效表达，如乙醇氧化酶基因（AOX1）的表达产物可 在细胞中高水平积累。 AOX1的启动子是一种可诱导的强启
动子。以AOX1为启动子，选择AOX1基因缺失的突变株作为
受体细胞，可高效表达外源基因。 在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面 抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、链激酶等几十种。 毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了 解还比较少，且发酵周期也比较长。
Selecting a Pichia Expression Vector
pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点
Selecting a Pichia Expression Vector
Pichia Cloning
表达载体与毕赤酵母基因 组发生重组的方式：
1. 载体的3‘ AOX1区与基因组的
expression and can even lead to cell death. Other important facts: • Doubling time of log phase Mut+ or MutS Pichia in YPD is ~2 hours • Mut+and MutS strains do not differ in growth rates unless grown on methanol • Doubling time of log phase Mut+Pichia in methanol medium (MM) is 4-6 hours
AOX1基因的末端发生同源重组
2. 载体的HIS4区与基因组的HIS4 基因的末端发生同源重组
Gene Replacement at AOX1 in GS115
酵母表达手册
酵母表达手册
酵母表达系统是一种常用于生产重组蛋白质的方法，其利用酵母细胞作为宿主来表达外源基因。
以下是酵母表达系统的基本步骤：
1. 基因克隆和转化：将目的基因克隆到酵母表达载体中，常用的载体有质粒和整合型载体。
转化方法包括电转化和化学转化。
2. 重组蛋白表达：将转化后的酵母细胞接种到发酵罐中进行培养，在适宜的温度、pH和营养条件下，目的基因在酵母细胞中表达出重组蛋白。
3. 蛋白质纯化：通过一系列的纯化技术，如离心、过滤、沉淀、亲和层析等，将重组蛋白从酵母细胞中分离出来并进行纯化。
4. 蛋白质后处理：根据需要，对纯化的重组蛋白进行进一步的后处理，如去盐、脱色、除菌等。
5. 蛋白质检测：通过SDS-PAGE、Western blot等方法检测重组蛋白的表达水平和纯度。
6. 蛋白质功能研究：对纯化的重组蛋白进行生物活性检测和功能研究，如酶活测定、免疫分析等。
在实际应用中，需要根据不同的需求选择不同的酵母表达系统，如酿酒酵母表达系统、毕赤酵母表达系统等。
同时，还需要对重组蛋白进行质量分析和稳定性研究，以确保其用于后续的实验或生产中具有可靠性和有效性。
生物酵母高效表达系统的研究及优化
生物酵母高效表达系统的研究及优化绪论生物酵母高效表达系统在生物技术领域中扮演着重要的角色。
酵母是一种简单而又易于培养的真核生物，具有许多优点，比如高表达水平，易于扩大生产以及可调控的代谢途径。
然而，在使用酵母进行表达时，有一些因素需要考虑，以确保高效表达和最大化产量。
本文将探讨生物酵母高效表达系统的研究和优化。
一、研究生物酵母高效表达系统的原因1.1 酵母的生物学特性酵母是一种单细胞真核生物，其基因组具有高度保守性。
酵母细胞有类似于人类细胞的机制，这使得酵母可用作人类蛋白质的表达系统。
此外，酵母细胞的代谢通路与人类细胞有许多共同之处，因此可以通过酵母细胞进行药物筛选和代谢途径的研究。
1.2 酵母高效表达系统的优势相对于其他表达系统，酵母高效表达系统有以下优势：a) 高表达水平：酵母细胞拥有高度活跃的转录和转译机制，使其能够实现高水平的蛋白表达。
b) 易于扩大生产：酵母细胞的培养工艺相对简单，同时可以进行批量培养和连续培养。
c) 可调控的代谢途径：酵母细胞常用来研究特定代谢途径，并通过基因工程进行调控。
二、生物酵母高效表达系统的优化2.1 基因工程基因工程是生物酵母高效表达系统优化的关键。
通过选择适当的启动子、增强子和终止子以及优化启动子-转录因子相互作用，可以实现蛋白质表达水平的提高。
此外，通过插入调节元件，在表达过程中控制蛋白质的稳态水平，从而实现高产量表达。
2.2 优化培养条件培养条件对于酵母高效表达系统的优化至关重要。
适当的培养温度、pH值、培养基成分和添加剂选择可以提高酵母细胞的生存率和表达效率。
还可以通过调节培养基的营养物质浓度和培养过程中的氧气供应，进一步提高表达效果。
2.3 蛋白质稳定性的提高蛋白质在酵母细胞中的稳定性是影响高效表达的因素之一。
通过添加相关蛋白质降解途径的抑制剂，可以延长目标蛋白质的半衰期，从而提高其表达水平。
此外，在目标蛋白质的N-端或C-端添加稳定性标签，也能有效提高蛋白质的稳定性。
酵母表达系统
比较基因组学
通过比较不同物种之间的基因组 和转录组，分析生物进化的特征 和规律。
05 酵母表达系统的未来发展
提高表达产物的产量与质量
基因编辑技术
利用基因编辑技术，如CRISPR-Cas9，对酵母基因进行精确修饰， 以提高目标蛋白的表达量和纯度。
沉默子
沉默子是能够抑制基因表达的DNA序列，通过与转录因子结合来抑制基因的表达，在基因表达调控中具有重要作 用。
转录因子与基因表达调控
转录因子
转录因子是能够识别并结合DNA序列的蛋白质，通过与特定DNA序列的结合来调控基因的表达。
转录因子与基因表达调控
转录因子在基因表达调控中发挥关键作用，通过与启动子、增强子或沉默子等DNA序列的相互作用来 调节基因的表达。
蛋白质相互作用
通过酵母双杂交等技术研究蛋白质之间的相互作用，揭示基因调控 的分子机制。
基因突变分析
通过构建突变体分析基因突变对酵母生长、代谢等的影响，研究基因 的功能。
生物进化研究
物种进化
利用酵母表达系统研究物种之间 的进化关系，通过比较不同物种 之间基因表达的差异，揭示物种 进化的规律。
适应性进化
利用酵母表达系统生产食品添 加剂、酶制剂等，提高食品质 量和安全性。
农业领域
通过酵母表达系统改良农作物 ，提高抗逆性、产量和品质等
。
酵母表达系统的优缺点
优点
操作简便、周期短、成本低、可大规 模生产、安全性高。
缺点
表达水平相对较低、分泌蛋白的加工 和修饰能力有限、易受宿主菌遗传背 景的影响。
02 酵母表达系统的基本组成
对启动子、终止子等表达元件进行优化，提高其转 录和翻译效率，促进目标蛋白的表达。
第十章 酵母基因工程-08级
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原 核生物表达系统， 核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核 生物表达系统。 生物表达系统。
2、酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚， ① 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚， 遗传操作简便； 遗传操作简便； ② 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工 系统； 系统； 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、 ③ 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、 成本低廉； 成本低廉； 能将外源基因表达产物分泌至培养基中； ④ 能将外源基因表达产物分泌至培养基中； 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA FDA认 ⑤ 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认 定为安全的基因工程受体系统（ 定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）； ）； 酵母菌是最简单的真核模式生物。 ⑥ 酵母菌是最简单的真核模式生物。
选择标记
对应于营养缺陷型受体的野生型基因：HIS4 (组氨醇脱 对应于营养缺陷型受体的野生型基因： 氢酶基因) 精氨酸合成酶基因)； 氢酶基因)；ARG4(精氨酸合成酶基因 ；TRP1(色氨酸 精氨酸合成酶基因 色氨酸 合成酶基因)； 尿嘧啶合成酶基因) 合成酶基因 ；URA3 (尿嘧啶合成酶基因)。 抗性选择标记：抗生素G418抗性基因和Zeocin G418抗性基因和Zeocin抗性基因 抗性选择标记：抗生素G418抗性基因和Zeocin抗性基因
2、酿酒酵母的附加型载体
pUC质粒的复制起点和amp pUC质粒的复制起点和ampr抗性基因 质粒的复制起点和 酵母菌的2μm质粒的复制区 酵母菌的2μm质粒的复制区 酵母转化的选择元件： 酵母转化的选择元件：LEU2(亮氨酸合成酶基因)； (亮氨酸合成酶基因)
酵母表达系统在蛋白质表达中的应用研究
酵母表达系统在蛋白质表达中的应用研究蛋白质是生命体的基本组成部分，具有许多重要的生物学功能。
因此，在研究生物学、医学等领域时，蛋白质表达成为了重要的课题之一。
而酵母表达系统因其高表达量、简便操作和低成本等优点，在蛋白质表达研究中应用越来越广泛。
酵母是一种单细胞真核生物，它能够在体内高效地表达异源蛋白质。
其中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的表达系统被广泛应用。
在该系统中，通过将目的基因插入到酵母表达载体中，将其转化到酵母细胞中，使其在表达过程中被转录和翻译出来。
从酵母表达系统的应用角度来看，它有许多优点。
首先，酵母表达系统不仅易操作，而且表达的蛋白质质量高。
其次，酵母表达系统适用于大多数细胞，并且易于高通量筛选。
此外，酵母表达系统还具有很高的遗传和细胞学研究价值。
特别是在功能基因组学和精准医学方面，酵母表达系统也有广泛的应用。
例如，有研究人员使用酵母表达系统开展了对人类代谢物酶的初步研究，其中包括肝酮基转移酶、肝脏亚硝基还原酶和丙酮酸脱羧酶等代谢酶。
同时，酵母表达系统也是评价潜在药物靶点的有力工具。
研究人员通过表达转运体、酶和受体等蛋白质来解析与药物相关的关键酶、信号通路和分子机制。
在生物物理学和生物技术方面，酵母表达系统也有广泛的应用。
例如，有研究人员利用酵母表达系统进行了蛋白质纯化和蛋白质结构研究等方面的研究。
另外，利用酵母表达系统还可以生产抗原、抗体和疫苗等生物制品。
总之，酵母表达系统作为一种重要的蛋白质表达工具，在生物学、医学、生物技术等领域都有着广泛的应用。
随着科学技术的发展，酵母表达系统将会在未来扮演更为重要的角色，促进相关领域的发展和进步。
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4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量 整合位点 甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化：
选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。 体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达 毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点 的低
2）分泌表达产物过糖基化
（二） 甲醇酵母表达系统
甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的优缺点 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 甲醇酵母表达系统的应用
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母（Pichia pastoris) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha) 假丝酵母（Candia boidinii)
组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活 性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成
O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸 基团
4、酿酒酵母表达系统的缺陷
1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵
A、表达水平高（最高水平的系统） B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化 C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150
个甘露糖） D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统） E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。 F、实验室和工业操作简单 G、不能满足结构要求严格的糖基化
TATA
起始 DAS 位点 编码序列
mRNA 40-120bp
20-40bp
100-1400bp
1、转录起始位点； 2、TATA盒：富含AT； 3、UAS：上游激活序列;
4、URS：上游阻遏序列 5、DAS：下游激活序列
酿酒酵母表达系统常用启动子
1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH 磷酸甘油激酶基因PKG 乙醇脱氢酶基因ADH
1）AOX1位点插入
宿主株:GS115、KM71 可插入位点：
5’AOX1 3’AOX1 TT
转化子： GS115:His+Mut+
KM71:His+Muts
2）His4位点插入
宿主株:GS115、KM71 可插入位点：
5’His4 3’His4
转化子： GS115:His+Mut+
KM71:His+Muts
低温诱导、磷酸盐抑制
A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录
B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子
C、pho4TS 温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭
D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达
2、酿酒酵母分泌系统
酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子：MF-α 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
真菌基因工程
一、真菌表达系统的优缺点 二、酵母转化系统 三、酵母表达系统 四、丝状真菌表达系统
三 酵母表达系统
酿酒酵母表达系统 甲醇酵母表达系统 其它酵母表达系统
（一） 酿酒酵母表达系统
酿酒酵母系统启动子 酿酒酵母分泌系统 酿酒酵母糖基化系统 酿酒酵母表达系统存在的问题
1、酿酒酵母启动子
UAS URS
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL80 GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控
B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录 C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差
二大宿主系统主要选择标记
宿主 毕赤酵母 汉森酵母
选择标记 his4、G418、 Zeocin、Cu++ leu2、 his3 、ura3、 G418
甲醇酵母系统宿主
毕赤酵母系统主要宿主株
宿主株
Y11430 GS115 KM71 SΒιβλιοθήκη D1168 MC1003特点
野生型、Mut+ his4- 、Mut+ his4-、 aox1::ARG4 (AOX1-)、Muts his4- 、胞外蛋白酶缺陷，高分泌 his4-、AOX1-、AOX2-，甲醇不生长
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶
A、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%以上
B、名称和拷贝数不同
毕赤酵母/假丝酵母
汉森酵母
醇氧化酶
甲醇氧化酶
alcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOX
AOX1、AOX2
MOX
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
AOX1与AOX2 *毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80 GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
4）甲醇利用表型
在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达
5）mRNA5’端
mRNA5’端非翻译区（UTR）的组成与长度 应尽量与AOX1/MOX的一致 应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构
6）基因序列的AT含量
AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构
7）分泌信号
分泌表达效率与所用分泌信号高度相关
提供多个整合位点 B、缺陷型标记基因：Leu2d
提高选择压力 C、抗性标记；neo
提高选择压力
甲醇酵母系统胞内表达载体
表 需要达带载入体A类TG型
单位点
甲醇酵母系统胞内表达载体
表 需要达带载入体A类TG型
多位点
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：PHO1
甲醇酵母系统分泌表达载体
信号肽：MFα
甲醇酵母系统分泌表达载体
AOX1、AOX2 *AOX1与AOX2基因97%同源 *AOX1 占主导地位，负责AOX 99%以上活性
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子
AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
2、甲醇酵母表达系统的优缺点
目的蛋白
3、酿酒酵母糖基化系统
糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸） N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖 基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。 O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化
酿酒酵母糖基化特点
* 过糖基化（超糖基化修饰）： N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要特点
项目 最适温度 最适pH值 甘油阻遏 糖基化 高密度发酵
毕赤酵母 30℃ 4.5 是 部分过度 100g/L
汉森酵母 37℃ 4.5 否 较正常 100g/L
甲醇酵母系统宿主
3） 多基因插入事件（串联整合）
宿主株:GS115、KM71 可插入位点：
5’AOX1 3’AOX1 TT
转化子： GS115:His+Mut+
KM71:His+Muts
4） 基因取代（GS115，AOX1+）
转化子：His4+Muts
汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体
高拷贝整合元件： A、高度重复序列：rDNA
酿酒酵母信号肽特点
*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用
*信号肽结构：
Met
信号肽剪切位点
正电荷区 疏水区 极性区 目的蛋白
MF-α信号肽
*分泌效率高
*在酵母系统具有通用性
*88个残基组成
Met
KEX2 DAP DAP
-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-
DAP：STE13编码的二肽酶
可采用酿酒酵母来源的MFα、PHO或SUC等的信号 肽，或野生型信号肽，但适用性要比较分析。
8）表达产物稳定性 分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素
降低培养基pH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低 培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制 采用蛋白酶缺陷宿主株：如P.pastoris SMD1168
甲醇酵母系统的整合事件
YRp型载体：汉森系统 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择
压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。 YIp型载体： A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组 B、有“插入”和“取代”二类整合模式 C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合