酵母表达体系

毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。

毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。

翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。

菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts）

分泌型载体:

pPICZα A,B,and C

(5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签)

胞内表达型载体：

pPICZ A,B,and C，

一：分子克隆

1.设计引物

分泌型载体图谱：

见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C）

2.PCR扩增基因

PCR反应体系（50μl）

模板DNA 1μl

Forward Primer（10μM）1μl

Reverse Primer（10μM）1μl

dNTP Mixture(各2mM): 4μl

5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl

PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl

ddH

O up to 50μl

2

PCR 反应流程

预变性98℃ 2min

变性98℃ 10sec

退火56℃ 10sec 30个循环

延伸72℃ 30sec

完全延伸72℃ 10min

保存4℃

3.双酶切及其回收

双酶切反应体系（40μl）

DNA(空载体或目的基因) 30μl

BamHⅠ 1.5μl

XholⅠ 1.5μl

10×Buffer K 4.0μl

4.酶连接

首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。

转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml

Zeocin，双酶切法鉴定重组质粒后，送测序。

双酶切鉴定体系（10μl）

DNA(空载体或目的基因) 6μl

BamHⅠ0.5μl

XholⅠ0.5μl

10×Buffer K 1.0μl

二：线性化重组质粒

1.提取重组质粒

20ml低盐LB培养基(25 μg/ml Zeocin)，提取150ul重组质粒

2.重组质粒线性化体系：

重组质粒线性化体系（80μl）

重组质粒70μl

Sac1/PmeⅠ2μl

Buffer 8μl

37℃水浴酶切过夜（约12-24小时）,取0.5-1ul酶切后质粒，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，可冻存在-20℃。

3. 线性化产物的浓缩

（若回收的线性化质粒浓度大于100ng/ul,则不需要浓缩，50ml酵母培养液得到200ul感受态细胞，使用10ul线性化质粒+100ul感受态进行电转）

(1)65℃，20min灭活限制性内切酶

(2)加入等体积（酚：氯仿：异戊醇=25:24:1），振荡均匀，RT，12000rpm，离心1min, 取上清。

(3)加入等体积氯仿，振荡均匀，RT，12000rpm，离心1min, 取上清。(4)加入0.1倍体积醋酸钠（pH=5.2，3M）,2倍体积预冷无水乙醇，振荡均匀，-80℃，放置30min后，4℃，12000rpm,离心40min.

(5)将沉淀用70%乙醇500ul，洗两次，14000rpm,4℃，离心10min,晾干后，加入10ulddH2O溶解即可，-20℃保存。

三：酵母电转化感受态细胞的制备

1 活化酵母菌：取出存于-20℃冰箱的GS115无抗YPD平板，挑取单克隆，划线于新的无抗YPD平板上，30℃烘箱培养16h

2 挑取酵母单菌落，接种到50ml无抗YPD液体培养基，250rpm，30℃培养15h

3 取50μl菌液接种于100ml培养基中，250rpm，培养至OD值在1.2~1.5之间。

4 分装菌液至灭菌的50ml离心管，4℃，3700rpm，离心10min

5 弃上清，加50ml预冷至4℃的无菌水，重悬细胞，剧烈震荡200次，4℃，

3700rpm，离心1min，重复用无菌水洗一次。

6 弃上清，用2ml 1M山梨醇（1M）清洗沉淀后，加入400ul 1M 山梨醇重悬

四：电转化至酵母感受态细胞中

1取5µl线性化回收产物，加入至100µl新鲜制备的电转化感受态细胞中，混匀移入干净的1.5ml EP管中（避免气泡出现）。

2取预冷于-20℃的电极杯，放在冰上。

设置电转化参数：电压1200V，时间5ms。

3将重组质粒与感受态细胞混均匀后，加入到电极杯中，等待1-2min(使细胞DNA体系与电极杯能充分接触，利于电转的成功)

4立即向电转杯中加入1ml山梨醇，用移液枪充分混匀。从电转杯中吸出液体，加入到灭菌1.5ml EP管中。30℃烘箱1h(1-2)复苏

5 取出复苏的菌液，4000rpm，离心5分钟, 弃掉800µl上清。将剩余的300µl 细胞重悬，涂含有25µg/ml Zeocin抗性的YPDS平板上，30℃培养箱避光，倒置培养3天。

五：(可省略直接进行小试)菌落PCR鉴定

待YPDS 的Zeocin TM平板上长出单克隆后，挑取单克隆，接种于YPD液体培养基中，加25µg/mlZeocin TM抗生素。避光培养，转速250rpm，30℃培养16小时。

酵母菌落PCR鉴定体系如下：

PCR鉴定反应体系（50μl）

菌液0.5μl

Forward Primer（10μM）1μl

Reverse Primer（10μM）1μl