荧光定量PCR
荧光定量 pcr 的基本原理和步骤
荧光定量PCR的基本原理和步骤
荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测和定量DNA或RNA分子。
其基本原理是在PCR过程中加入荧光探针，通过监测荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
下面是荧光定量PCR的基本步骤：
1. 样品处理：首先需要从待检测样品中提取DNA或RNA，并进行适当的处理，例如反转录、扩增等。
2. 设计引物：根据待检测的目标序列设计特异性引物。
3. PCR反应体系的制备：将引物、荧光探针、dNTPs、PCR缓冲液等混合，制备PCR反应体系。
4. PCR反应：将样品DNA或RNA与PCR反应体系混合，进行PCR反应。
5. 荧光定量：在PCR反应过程中，荧光探针会结合到目标序列上，并通过荧光信号的产生来检测PCR产物的数量。
在荧光定量PCR中，通常采用SYBR Green或TaqMan探针来检测PCR产物的数量。
6. 数据分析：通过对荧光信号的强度进行分析，计算出样品中目标序列的数量，并进行比较和分析。
需要注意的是，在荧光定量PCR中，需要选择合适的荧光探针和荧光信号检测系统，以确保准确和可靠的结果。
此
外，为了避免PCR过程中的污染和误差，需要严格控制PCR 反应条件和操作流程。
荧光定量PCR技术
03
结果重复性差
可能原因包括实验操作不规范、仪器 故障等。解决方案包括规范实验操作 、定期维护和校准仪器等。
05
荧光定量PCR技术在生物医学 研究中的应用
基因表达水平检测
绝对定量
通过标准曲线对未知模板进行定量分析，确 定基因的表达量。
相对定量
比较不同样本间基因表达的差异，常用于研究基因 在不同组织、不同发育阶段或不同处理条件下的表 达模式。
光信号的特性，实现对PCR产物的实时监测。
02
第二代荧光定量PCR技术
引入了特异性更高的荧光探针（如TaqMan探针），提高了检测的准确
性和特异性。
03
第三代荧光定量PCR技术
在第二代技术的基础上，进一步改进了荧光探针的设计，引入了多种荧
光基团和猝灭基团，实现了多重荧光定量PCR检测。
应用领域及意义
研究微生物与环境因素的相互作用
荧光定量PCR技术可用于研究微生物与环境因素（如温度、pH值、营养物质等）的相互 作用，揭示微生物在环境中的适应机制和生态功能。
食品安全领域应用
检测食品中的病原微生物
荧光定量PCR技术可用于快速、灵敏地检测食品中的病原微生物，如沙门氏菌、大肠杆菌等，保 障食品安全。
评估食品中的转基因成分
重复性原则
设计合理的实验重复和对照，以验证结果的 稳定性和可靠性。
定量准确性原则
选择合适的荧光定量方法和标准曲线，确保 目标序列的准确定量。
样品准备与DNA提取方法
样品准备
收集待测样品，如组织、细 胞、血液等，并进行适当的 处理，如研磨、裂解等，以
释放DNA。
DNA提取方法
根据样品类型和实验需求选 择合适的DNA提取方法，如 酚氯仿抽提法、试剂盒法等 ，以获得高质量的DNA模板
荧光定量PCR原理及操作步骤.课件
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荧光定量PCR的原理
• 在PCR反应过程中，随着DNA的扩增，荧光染料或荧光探针会 与新合成的DNA结合，产生荧光信号。荧光信号的积累与DNA 的扩增数量呈线性关系，通过荧光信号的实时监测，可以精确 地计算出起始模板的浓度。
荧光定量PCR的应用
• 荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体 检测和基因分型等领域。通过实时监测PCR反应进程，可以 精确定量目标基因的表达水平，检测基因突变，以及鉴定病 原体种类和基因型等。
实验结果解读注意事项
数据解读与处理
荧光定量PCR实验产生的数据需要进行解读和处理。实验人员应熟悉数据分析方 法，正确解读实验结果，避免因数据处理不当导致误判。
结果报告与交流
荧光定量PCR实验结果应按照相关规定进行报告和交流。实验人员应确保结果的 准确性和可靠性，避免因结果报告不准确导致误导或决策失误。同时，实验人员 还应与其他相关人员进行有效沟通，共同探讨实验结果和问题解决方案。
案例二：突变检测
总结词
荧光定量PCR是突变检测的有效手段，能够快速准确地检测DNA序列中的点突变、插入或缺失。
详细描述
针对目标基因的特定区域，设计包含突变信息的引物或探针，通过荧光定量PCR扩增后，利用熔解曲 线或高分辨率溶解分析等技术，判断是否存在突变。这种方法在遗传性疾病诊断、癌症研究等方面具 有重要应用。
解决方案3
对于引物二聚体问题，可以通过优化引物设计、 降低引物浓度等方法来解决。
建议3
在实验前对引物进行充分的评估和验证，避免使 用易形成二聚体的引物。
问题解决方案及建议
解决方案4
对于假阳性结果问题，可以通过 增加重复实验次数、设置阴性对 照等方法来避免。
荧光定量pcr技术
荧光定量pcr技术
荧光定量PCR技术是一种可以快速准确定量分析基因表达水平的高灵敏度技术，是分子生物学实验中最常用的定量技术。
荧光定量PCR技术结合了荧光技术和PCR技术，通过定量PCR技术可以获得特定基因在某一样本中的表达水平，广泛应用于基因表达谱的分析、基因芯片的芯片定量、基因功能的研究、抗性蛋白的检测、表观遗传学的分析等。
荧光定量PCR技术的原理是利用特定的核酸引物对目标基因进行扩增，在扩增过程中，会加入能够发出荧光信号的探针，探针会与基因片段结合，在特定条件下会发出荧光，用荧光检测仪检测荧光信号，根据荧光强度来推测基因表达水平。
荧光定量PCR技术具有检测灵敏度高、结果可靠、操作简便、快速、成本低等优势，在生物学研究中有着重要的作用。
荧光定量PCR技术的实施，需要准备特定的核酸引物及荧光探针，确定PCR 探针的配对关系，以及设置正确的反应参数，实施反应，将PCR反应产物分析荧光检测仪，结果准确可靠。
总之，荧光定量PCR技术是一种快速准确定量分析基因表达水平的高灵敏度技术，在生物学研究中起着重要的作用，具有很好的应用前景。
荧光定量PCR
实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型
• 利用已知起始拷贝 数的外部标准品可 做出标准曲线，在 现有实时荧光PCR 中，大部分以纵坐 标为Ct值，横坐标 为起始拷贝数，少 部分以纵坐标为起 始拷贝数，横坐标 为Ct值。
实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型
• 只要获得未知标 本的Ct值，即可 从标准曲线上计 算贝数，这是采 用出该标本的起 始拷外标进行实 时荧光PCR绝对 定量的基本原理。
基本概念
• 绝对定量（Absolute quantitation） 绝对定量是使用一系列稀释 的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定，根据系列浓度标 准品的Ct值与起始模板（RNA或cDNA）量之间的线性比例关系， 绘制标准曲线。待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值，从标准 曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。这种方法是假定所有 的标准品和临床标本有相近的扩增效率。系列稀释标准品的浓度 应包含临床标本的浓度范围，并且在实时PCR仪及检测试剂方法 的准确度和线性范围内。 系列稀释的标准品最好是RNA，也可以是双链DNA片段、单链 DNA或载有靶序列的质粒。标准品必须是纯的，与RNA标准品相 比，DNA有相对较好的稳定性、重复性和敏感性，但其与逆转录 没有关系，不能反映逆转录效率。
• 指数期初期 （The beginning of exponential phase） 为 PCR扩增的四个主要阶段之 一（图）。进入扩增指数期 初期，荧光强度达到一个阈 值，该阈值通常为基线荧光 信号均值标准差的10倍。扩 增达到阈值时的循环数可称 为CT（ABI Prism有关文献） 或CP（LightCycler有关文 献）。CT或CP与原始扩增模 板数量正负相关，可通其与 原始模板的函数关系，来计 算原始模板的数量。
荧光定量pcr
荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
原理PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
荧光定量PCR 实验步骤：样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
荧光定量pcr技术
荧光定量pcr技术1荧光定量PCR技术荧光定量PCR技术是一项临床检测技术，可以用于电子细胞学、遗传学分析和生物学研究的诊断和治疗，是现代分子生物学研究的重要技术和工具。
它可以用来快速准确测定微量的基因突变物，是一种重要的分子生物学技术。
2基本原理荧光定量PCR的基本原理是利用特定的核酸引物与靶序列结合能够将二碱基添加物体（TAMRA)附着到反应碱基处，当DNA聚合酶催化DNA模板反应完成后，产生大量逐渐增多（cumulative）的双链DNA分子，每一个Tama DNA分子会发出特定波长的荧光，可以以气运及成像仪检测曲线。
由此可以研究基因表达量或检测基因突变。
3结构图荧光定量PCR是由PCR反应体系、荧光检测系统和生物计算机软件三部分组成的。
PCR反应体系主要由PCR反应管，DNA聚合酶，引物，核酸模板，dNTP，反应矿物液等构成，而荧光检测系统由荧光检测仪、光学模块、滤波器和细节探查器等组成，生物计算机软件则含有数据处理和分析工具等。
4操作步骤（1）准备试剂=将相应的引物、模板酶、模板、等试剂准备完毕（2）反应杯=将试剂放入反应杯中（3）添加活性=加入活性DNA复制酶并完成反应（4）添加TAMRA探针=添加探针的复制物（5）样品吸附=将样品放入荧光PCR仪，待样品被荧光PCR仪件计数（6）数据处理=将获取的数据处理为连续变化线，并进行准确定量5应用荧光定量PCR技术最早用于病毒感染或突变的检测，后来也被广泛用于人类基因组学研究和生物分子临床检测。
荧光定量PCR技术可用于检测癌症的基因突变，诊断免疫过敏症状，检测病毒杂交异体，以及测定各种人体疾病的基因感染活性等多方面应用。
此外，还可用于分离基因扩增及基因电泳，核酸转录检测，组织学，血清学等技术领域。
6优势荧光定量PCR是一种灵敏而稳定的数据测定方法，能快速、准确地检测极微量的样品，具有视觉化简易性、灵活多变，还可同时检测多个基因样品。
此外，选用的引物和探针也极为可靠，重复性强，可以有效控制背景噪声，为分子诊断技术的发展做出巨大贡献。
荧光定量pcr名词解释
荧光定量pcr名词解释
荧光定量PCR（quantitativepolymerasechainreaction）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和测量DNA、RNA的数量。
以下是一些相关的名词解释：
1. PCR：聚合酶链式反应，是一种体外扩增DNA序列的技术。
2. 荧光探针：一种用于检测PCR反应产物的荧光标记物，通常包括一个特异性引物和一个荧光探针。
3. CT值：cycle threshold值，是指PCR反应中，荧光信号达到设定阈值（通常为背景噪声的2-3倍）所需的循环次数。
CT值越低，说明起始模板的数量越多。
4. 标准曲线：荧光定量PCR中用于测量目标序列的相对数量的方法之一。
通过制备一系列已知浓度的标准样品并进行荧光PCR，得到一条标准曲线后，可以利用未知样品的CT值和标准曲线进行定量分析。
5. 绝对定量：通过荧光定量PCR和标准曲线的方法来测量目标序列的绝对数量（如基因拷贝数）。
6. 相对定量：利用荧光定量PCR测量目标序列与参考序列（如内参基因）的相对表达量，通常使用2-ΔΔCT法计算。
- 1 -。
定量PCR基本原理及方法
✓ Ct值与起始模板的关系
logN=log N0 +nlogE n=Ct 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数 的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。
Y轴—Ct值
6
X—起始拷贝数的对数
✓ 绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较
Excitation
R
3’
11
3’
3’
5’
QQQ
Q
5’
分子信标（Molecular Beacon Probe）
R ExcitatEiomnission Q
Excitation
12
荧光共振能量传递（FRET Probe）
Oligo 1: Fluorescein Excitation
Transfer
野生型 突变型 杂合型
21
利用熔解曲线检测基因突变 FRET探针进行熔解曲线分析确定基因型
FRET探针与模板结合时，因共振能量的传递而信号增强，而当在Tm 值时， FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱。通过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程 中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线。因为发生基因突变的PCR产物有特定 的Tm 值，通过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度Tm值，就能确定样品的基因型。
8
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
5’
3’
SG
Emission
SG
SG
3’
SG
5’
SG
9
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
SG
5’
3’
整理)荧光定量PCR
荧光定量PCR（qPCR）一、所需试剂1、模版DNA（一般为RTPCR产物）2、引物：详见引物设计（需要内参和目的基因的引物）3、（RR820A试剂盒，4℃避光6个月保存，-80℃长期）①SYBR® Premix Ex Taq II（TliRNaseH Plus）（2×Conc.）：含有以下成分（1）Ex Taq HS：一种耐热性DNA聚合酶，具有3′→5′核酸外切酶活性（校正活性）；PCR 产物3′端附有一个“A”碱基。
（2）dNTP Mixture：扩增的原材料（3）Mg2+：影响聚合酶的活性，增加扩增效率；影响引物复性和解链温度；浓度太高却会降低特异性（4）TliRNaseH：抑制cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用（5）SYBR® Green I：与双链DNA结合后发出荧光。
检测PCR产物扩增量的目的②ROX Reference Dye（50×Conc.）使用仪器：Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System、StepOnePlusTM③ROX Reference Dye II（50×Conc.）：浓度比②低使用仪器：Applied Biosystems7500 Real-Time PCR System和 7500 Fast Real-Time PCR System、ABI QuantStadio DX用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，无需使用②/③的仪器：Thermal Cycler Dice Real Time System II、LightCycler®/ LightCycler®480 System(Roche Diagnostics) 或CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)二、操作步骤（冰上进行）1、反应体系构建（）(除DNA模版外，同一基因的其他试剂配成总管*1通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。
荧光定量PCRPPT课件
仪器设备
确保PCR仪、荧光检测器 等设备正常运行，并按照 实验要求进行参数设置。
实验设计
根据研究目的和样本特性， 设计合理的荧光定量PCR 实验方案。
样本处理
样本收集
采集具有代表性的样本， 并妥善保存以备后续实验。
样本处理
将样本进行适当的处理， 如细胞分离、DNA/RNA 提取等，以获得足够的核 酸模板。
荧光信号检测
在PCR循环过程中，实时监测荧光 信号的变化，收集数据以供后续分 析。
结果分析
数据处理
结果应用
对荧光定量PCR实验数据进行处理， 如阈值设定、循环阈值（Ct值）计算 等。
将荧光定量PCR实验结果应用于后续 的研究或实际应用中，如基因表达分 析、病原体检测等。
结果解读
根据实验目的和预期结果，对荧光定 量PCR实验结果进行解读，并评估其 可靠性。
02
该技术利用荧光染料或荧光探针 标记特异性检测目标，通过荧光 信号的累积和检测，实现对目标 序列的实时定量分析。
荧光定量PCR技术的原理
在PCR反应过程中，随着DNA 的合成，荧光染料或荧光探针与
DNA结合，产生荧光信号。
随着DNA的扩增，荧光信号也 相应增强，通过实时监测荧光信 号的变化，可以计算出目标序列
基因突变检测
总结词
荧光定量PCR技术可用于检测基因突变，通过对基因序列的变异进行分析，有助于遗传性疾病的诊断、药物疗效 评估和个性化治疗。
详细描述
荧光定量PCR能够高特异性地检测基因序列的变异，包括点突变、插入和缺失等。通过比较正常组织和病变组织 的基因突变差异，有助于了解疾病的发生和发展机制，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。同时，基因突变检 测还可用于药物疗效评估和个性化治疗方案的制定。
荧光定量PCR技术及临床应用
03
疗效评估与预后判 断
荧光定量PCR技术可以实时监测 肿瘤治疗效果，评估患者预后病检测
01
荧光定量PCR技术可以对单基因遗传病进行检测，如地中海贫
血、血友病等。
染色体异常检测
02
通过荧光定量PCR技术，可以检测染色体数目和结构异常，如
唐氏综合征、威廉姆斯综合征等。
自动化程度高
现代荧光定量PCR仪具有高度的自动化特点，能够快速、准确地完成 大量样本的检测和分析，提高工作效率。
局限性
成本较高
荧光定量PCR技术所需的仪 器、试剂和耗材成本较高， 限制了其在资源有限地区的 广泛应用。
操作复杂
样本处理要求高
荧光定量PCR技术操作较为 复杂，需要专业人员操作和 解读结果，增加了技术门槛。
技术改进与创新
提高检测灵敏度和特异性
通过改进PCR反应体系和荧光检测方法，提高荧光定量PCR技术 的灵敏度和特异性，降低检测下限。
自动化与智能化
通过自动化和智能化的技术手段，简化荧光定量PCR的操作流程， 提高检测效率，降低人为误差。
标准化与质量控制
建立荧光定量PCR技术的标准化操作和质量控制体系，确保检测结 果的准确性和可靠性，促进技术的广泛应用和推广。
病原体检测
荧光定量PCR技术在病原体检测 方面具有高灵敏度和特异性，可 应用于各种感染性疾病的诊断和
监测。
肿瘤诊断与治疗
荧光定量PCR技术可应用于肿瘤相 关基因的突变检测、肿瘤细胞耐药 性分析等方面，为肿瘤的诊断和治 疗提供有力支持。
遗传性疾病诊断
荧光定量PCR技术可应用于基因突 变检测、单基因遗传病和染色体异 常疾病的诊断，有助于遗传性疾病 的早期发现和干预。
万字长文讲清荧光定量pcr
万字长文讲清荧光定量pcr荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种基于PCR技术的定量分析方法，它可以对DNA或RNA样品中的目标序列进行定量测定。
与传统PCR方法相比，荧光定量PCR具有更高的灵敏度和准确性。
在荧光定量PCR中，首先需要设计一对引物，它们能够特异性地结合到目标序列的两个相邻区域上。
引物的设计需要考虑多个因素，如引物长度、GC含量、Tm值等。
引物的合成通常由专业实验室完成，确保其质量和纯度。
在PCR反应中，首先将DNA或RNA样品与引物、荧光探针和酶进行混合。
然后，在一台PCR仪中，通过一系列的温度变化，使DNA 或RNA样品经历一系列的变性、退火和延伸过程，从而得到目标序列的扩增产物。
在PCR反应过程中，荧光探针发挥着重要的作用。
荧光探针通常由一个引物序列和一个荧光染料序列组成。
当荧光探针结合到目标序列上时，荧光染料与引物序列之间的约束被打破，导致荧光信号的释放。
荧光信号的强度与目标序列的数量成正比，可以通过荧光定量PCR仪进行检测和定量分析。
荧光定量PCR仪是一种专门用于测量荧光信号的仪器。
它可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号强度，并根据荧光信号的变化来确定目标序列的初始浓度。
荧光定量PCR仪通常配备有相应的软件，可以自动分析和处理荧光信号数据，生成定量分析结果。
荧光定量PCR在许多领域都得到了广泛应用。
例如，在生物医学研究中，荧光定量PCR可以用于检测病原体的存在和数量，帮助诊断和治疗疾病。
在农业科学中，荧光定量PCR可以用于检测转基因作物的存在和数量，以及检测植物病原体的感染情况。
在环境科学中，荧光定量PCR可以用于监测水体和土壤中的微生物污染情况。
荧光定量PCR的发展和应用为科学研究和实验室诊断提供了重要的工具。
它不仅提高了DNA或RNA分析的灵敏度和准确性，还大大加快了实验的进行速度。
随着技术的不断改进和创新，相信荧光定量PCR将在更多的领域发挥重要作用，为人类的健康和环境保护做出更大的贡献。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
万字长文讲清荧光定量pcr
万字长文讲清荧光定量pcr荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究的分子生物学技术。
它通过测量PCR反应体系中的荧光信号强度，来定量检测DNA或RNA的存在量。
qPCR是传统PCR的改进版，它能够在PCR反应进行的同时，实时监测荧光信号的强度。
这种实时监测的能力使得qPCR具有高灵敏度、高特异性和高精确性。
与传统PCR相比，qPCR可以快速、准确地确定目标分子的存在量，而无需进行后续的凝胶电泳分析。
在qPCR中，荧光信号来自于引物与模板DNA或RNA的结合。
在PCR反应的早期阶段，引物与目标分子结合，产生一个新的DNA或RNA双链。
这个双链结构中的荧光探针会发出荧光信号。
随着PCR 反应的进行，荧光信号的强度会随着目标分子的扩增而增加。
为了准确测量荧光信号的强度，qPCR系统通常会使用一个叫做“荧光阀值”的指标。
荧光阀值是一个设定的阈值，当荧光信号的强度超过这个阈值时，系统会自动记录荧光信号，这个时刻被称为“Ct值”（Cycle threshold value）。
Ct值越小，表示目标分子的起始数量越多。
为了提高qPCR的准确性，研究者通常会设计一个合适的引物和荧光探针。
引物是用来扩增目标分子的片段，而荧光探针则是用来检测目标分子的存在。
荧光探针通常含有一个荧光染料和一个荧光淬灭剂。
当荧光探针与目标分子结合时，荧光染料会发出荧光信号；而在分子扩增的过程中，荧光淬灭剂会与荧光染料结合，从而使荧光信号减弱。
除了引物和荧光探针的设计，qPCR还需要进行一系列的质控步骤来确保结果的准确性。
例如，研究者通常会设计一个阴性对照来排除假阳性的可能性。
阴性对照是一个不含目标分子的样品，如果阴性对照的Ct值超过了荧光阀值，那么可以判定实验结果是可靠的。
总的来说，荧光定量PCR是一种非常重要的分子生物学技术，它在基因表达分析、病原体检测、基因突变鉴定等领域都得到了广泛的应用。
通过实时监测荧光信号，qPCR可以准确、快速地定量检测目标分子的存在量，为生物学研究提供了强有力的工具。
荧光定量PCR
荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。
其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。
荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。
2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。
因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。
TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。
在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。
只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。
荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。
cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。
2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。
3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。
4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。
荧光定量pcr技术
荧光定量pcr技术
荧光定量PCR（Polymerase Chn Reaction）技术是一种
基于PCR原理的分子生物学技术，通过在PCR反应体系中加入荧光探针，利用荧光信号的量化来测定靶标DNA的数量。
荧光定量PCR技术相比传统的定量PCR技术具有更高的灵敏度和准确性。
它可以实现对低浓度目标DNA的定量检测，并且可以同时检测多个靶标DNA。
荧光定量PCR技术的基本原理是，将待测样品中的DNA
模板与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，然后通
过PCR反应，在每一个PCR循环中，荧光探针与靶标DNA结合并发生剪切反应，荧光信号释放出来并被检测仪器检测到。
荧光定量PCR技术常用的荧光探针有TaqMan探针、Molecular Beacon探针和Scorpion探针等。
这些探针一般由专门设计的两个引物和一个含有荧光染料和荧光抑制
剂的short oligo组成。
通过检测荧光信号的增强程度，荧光定量PCR技术可定量反映靶标DNA的初始量。
通常采用标准曲线法或计算相对表达法来进行定量结果的分析。
荧光定量PCR技术在医学诊断、基础生物学研究和遗传学分析等领域得到了广泛应用，有助于快速、准确地检测和定量目标DNA。
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Forward Primer 110
1
定量方法的选择
•绝对定量？动力学范围？ •相对定量？参考基因？扩增效率？
扩增片段
• 扩增片段的大小 • 探针的区域 • 序列的特异性
荧光标记
• • • • 490nm：FAM/ SYBR 530nm：HEX/ TET/ VIC/ CY3 575nm：TexasRed/ROX 635nm：CY5/ LC640
引物设计原则
• • • • • • •
长度：20-27nt G+C含量：45-55% 碱基的随机分布：3’端不应超过3个连续的G或C 引物自身：不应存在互补序列 引物之间：不应有互补性，尤应避免3’端的互补重叠 引物的3’端:3’也不能有形成任何二级结构的可能 引物的特异性
探针设计原则
• • • • 序列保守 G+C含量比较高 Tm值：高10℃ 5’端不能是G
Ct值和起始模板量的对应关系
Low Ct, high amount 23.8 23.7 23.6
35.6
Cycle
High Ct low amount
35.3 35.2
Template abundance in 6 samples.
Correlation Coefficient, Slope and PCR Efficiency (cont.)
荧光定量PCR原理和方法介绍
提
纲
• 荧光定量PCR的原理和应用 • 荧光定量PCR实验的设计和优化 • 引物和探针的设计 • 仪器软件的操作和仪器的维护 • 常见问题及解决方案
荧光定量 PCR的原理
PCR 反应过程
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs
Taq 酶
反应组分
变
性
3’
5’
Taq
3’
1. 链取代 2. 水
R Q
5’
Taq
R
5’
3’
解
Taq
5’
5’ 3’
3. 聚
合
l Taq
5’
R
5’ 3’
4. 检测荧光
产生很强的荧光信号 容易设计和合成 可以做多重检测 能够进行SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 检测
比插入染料贵
绝对定量
构建标准曲线： A、按照扩增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸。 B、利用纯化的扩增产物制备 C、克隆有扩增产物的质粒
突变检测
熔点曲线分析功能 • SYBR Green • FRET 探针 • 分子信标探针 等位基因功能 • MGB 探针 • Taqman 探针？
熔点曲线分析
SNP 检测-FRET
插入染料能够和引物二聚体和非特异性扩增产物结合
杂交探针方法
• TaqMan 探针 • 分子信标探针（Molecular Beacons） • FRET探针
TaqMan探针
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs Taq酶
R
反应体系
Q
Probe
Taq
l
R
Q
变
性
Q
5’
R
3’
退 火
R
Q
5’
反向引物的中间用Cy5 标记 和wild type 杂交的探针用FAM标记
不对称PCR，提高反向引物浓度
混合型
野生型
突变型
等位基因功能
MGB探针
实验设计和优化
影响PCR的因素
• 扩增效率——非特异性扩增、引物二聚 体、扩增产物的长度和二级结构 • 重复性 • 敏感性 • 动力学范围
Real Life
Cycle #
Relative Fluorescence
终点检测
同一样品重复96次的实验结果
终点法和实时法的结果比较
Lockey etal. (1998) Biotechniques 24:744-6
实时PCR（real time PCR） 能 够在扩增的同时对扩增产物的量 测量或定量。
Taqman 探针设计
Tm值比引物高10℃ 长度不超过30bp 5’端不能是G
分子信标(Molecular Beacons)
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs Taq酶
Molecular Beacon
反应组分
R
Q
Taq
R Q
变
性
l
Q R
5’
3’
退 火
Q
R
Taq
5’ Molecular Beacon 3’
标准 曲线的斜率和扩增效率相关
Efficiency () = [10(-1/slope) ] - 1 相关系数
荧光PCR的原理
• 插入染料法 • 杂交探针法
插入染料方法的原理
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs Taq酶
插入染料
反应组分
Taq
l
ID
变
性
3’
5’
5’
3’
退
火
3’
ID Taq
15
15
10 2 3 4 5 6 7 8
10 2 3 4 5 6 7 8
Concentration (10n)
Concentration (10n)
ΔCt 比较
1.4 1.2 1
Δ Ct
y = 0.0827x + 0.5885 R 2 = 0.2314
0.8 0.6 0.4 0.2 0 2 3 4 5 6 7 8
D
5’
R
5’ 3’
1-5 bases
退
火
D
5’
R
Taq
5’ 3’
链替换,荧光熄灭
Taq
5’ 5’
3’
• • • •
特异性好 SNP 检测 难设计 费用昂贵
常用的荧光基团
FAM TET, VIC HEX JOE CY3 TAMRA CY3.5, Redmond Red Texas Red, ROX CY5 LC640 CY5.5, LC705
5’
3’
退
火
3’
Taq
Taq
3’
5’
延 重
伸 复
3’
3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’
5’
循环2 4个拷贝
3’
3’
3’ 3’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ 3’
5’
循环3
3’
5’ 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’
3’ 3’
8个拷贝
3’
PCR反应模式
Theoretical
Log Target DNA
PCR反应
• 分开扩增？ • 同时扩增（二重PCR）？
实验条件的优化
• • • • • Taq酶，Mg2+ d NTPs 引物浓度 探针浓度 退火温度
CT值越小，表明反应效率越高
多重PCR的优化
• 标准品的动力学范围 • 反应条件的优化：降低高丰度基因的引 物浓度，提高低丰度基因的引物浓度
相对定量的扩增效率
好坏数据比较
= 101% Good r = 0.997
= 131% Bad r = 0.982
引物二聚体对结果的影响
特异性产物
Tm = 89°C
10,000 copies
2,000 copies
引物二聚体 Tm = 78°C
400 copies
No template control
82 º 采集荧光信号 C
避免二级结构
Forward Primer 110 1
Reverse primer A
Reverse Primer A
= 66.3 %
Avoid Secondary Structure (cont.)
Optimizing Primer location
Reverse Primer B
Reverse primer B = 95.8 %
引物和探针的设计
• Primer Express • Beacon Designer
谢谢!
1. 链替换
Taq
R Q 5’ 5’ 3’
2. 聚合完成
SNP 检测，较Taqman探针有更大的温 度选择性 多重PCR
难设计和合成 产生的荧光信号较低 价格昂贵
FRET 探针
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs Taq酶
反应组分
Taq
R Q
变
性
FRET 探针
l
ID ID
Taq ID ID
5’
延
3’
伸
5’
l
3’
l ID ID ID l l
l ID
Taq 5’
3’
检测激发的荧光
Taq
ID
相对杂交探针方法，插入染料法相对较便宜 不需要特别设计探针 SYBR Green I, 最常用的插入染料 SYBR Green 染料插入双链DNA，检测灵敏度 提高1000倍。 和杂交探针方法相比，插入染料法特异性低 。 不能做多重PCR。
2 1.6 1.2 0.8 0.4 0 0 10 20 21 30 40
Threshold Baseline Sample
CT
Ct值的设定
扩增产物的相对荧光强度达到设定的阈值时所经过的循 环数。 1) 设定基线 2) 设定阈值 3) CT 值就是扩增曲线和阈值的交点所指示的循环数。