动物微生物学实验3
实验动物学第三章 实验动物的微生物和寄生虫学控制
四、无菌动物的生产与维持
（一）无菌动物的获得 1.预产期判断 2.剖宫产术 3.人工哺乳/奶妈代乳 （二）无菌动物质量检测 1.无菌隔离器内环境检测 2.无菌隔离器内动物检测
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ห้องสมุดไป่ตู้
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第三节
实验动物的微生物学和寄 生虫学质量监测
一、进行微生物学监测的意义
所谓微生物监测是指用微生物学的方法对不同 等级的实验动物进行定期的抽样检查，以确认该 等级动物是否感染了某些病原体。因此，微生物 学监测是一个群体的、流行病学上的概念，它是 通过从一个群体中定期抽取少量样本进行检测， 从而判断整个群体中某一疾病流行情况的一种方 法。
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第二节
无菌级动物和悉生动物
一、无菌级动物和悉生动物的由来和发展 悉生动物：广义的悉生动物包括无菌动物和已知菌动物。 • 最初是研究微生物和动物（人）之间的依存关系而建立发 展起来的。 发展史： 1. 1895年-1910年：解决了动物可在无菌状态下生存的问题。 2. 1910年-1940年：因技术问题没有解决，悉生生物研究进 展缓慢。 3. 1940年- ：技术问题解决，悉生动物研究进展迅速。
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不同微生物级别动物用于实验的比较
项目 传染病 寄生虫 实验结果 应用动物数 GF/GN动物 无 无 准确 少 SPF动物 无 无 准确 少 CV动物 有或可能有 有或可能有 有疑问 多
统计学价值
长期实验 实验中死亡率
好
可能好 很低
可能好
可能好 低
不准确
困难 高
长期实验存活率
实验的正确设计 实验结果的统计价值
不同级别的动物必须饲养在相应的设施环境中，并有相应的饲养管理操作规程， 需要定期监测，保证其携带的微生物和寄生虫符合其等级标准。
实验动物微生物学和寄生虫学质量控制详解演示文稿
SPF级动物监测项目
类别
动物种类
病原菌
小鼠、 豚鼠、 犬、猴 大鼠 兔
小鼠、 大鼠
病毒
豚鼠、 犬、猴 兔
寄生虫
小鼠、 豚鼠、 犬、猴 大鼠 兔
项目
沙门 菌、 支原 体、 泰泽 病原 体等
沙门 志贺菌、 鼠痘病 兔瘟、 B病毒、
菌、 结核杆 毒、汉 仙台 逆转录
多杀 菌等
坦病毒、 病毒 病毒等
北美 0.02 0.00 0.00 0.01 0.02
0.04
1.57
血清学 血清学
44876 578464
32.64 1.65
血清学 血清学 血清学 血清学 血清学 血清学 血清学 血清学
594539 595903 447656 225868 428821 466572 462209 435772
情况。检测方法有:病毒分离与鉴定，病毒颗粒、抗原或核酸的检出，潜在病毒的 激活，抗体产生试验等。例如:采用免疫组化的方法在光镜下检查病变组织中的特 异性抗原；采用 HA方法检查患病动物排泄物或组织悬液中的血凝素抗原;采用电 镜技术或免疫电镜技术检查组织或排泄物中的病毒颗粒;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)检查病毒的蛋白质;采用
病原的动物。
形虫等。
清洁级动物
(Clean animal,CL)
无特定病原体动物
（Specific pathogen free animal,SPF)
无菌动物
（Germ free animal,GF)
是指除普通动物应排除的 病原外，还应不携带对动 物健康危害和对科学研究 干扰较大的病原的动物。
是指除清洁动物应排除的 病原外，还应不携带主要 潜在感染或条件致病和对 科学实验干扰大的病原的 动物。
临床医学检验技师-微生物学检验(三)
临床医学检验技士-微生物学检验(三)(总分：50.00，做题时间：90分钟)一、一(总题数：50，分数：50.00)1.链球菌分类的根据是( )∙A．在血液琼脂培养基中溶血的情况∙B．产生色素的颜色∙C．细菌的致病作用∙D．鞭毛抗原的特异性∙E．对营养的要求（分数：1.00）A. √B.C.D.E.解析：2.肺炎病人痰标本为砖红色胶胨样痰，应考虑下列何种细菌感染( )∙A．肺炎链球菌∙B．葡萄球菌∙C．肺炎克雷伯菌∙D．铜绿假单胞菌∙E．链球菌（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：3.下列微生物中何种属于人体口腔及咽部"正常菌群”( )∙A．流感嗜血杆菌∙B．金黄色葡萄球菌∙C．草绿色链球菌∙D．不动杆菌∙E．铜绿假单胞菌（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：4.下列何种试验可用于肺炎链球菌的快速诊断( )∙A．培养∙B．胆汁溶解试验∙C．糖发酵试验∙D．毒力试验∙E．荚膜肿胀试验（分数：1.00）A.B.C.D.E. √解析：5.将血清除菌最佳的方法( )∙A．巴氏消毒法∙B．高压灭菌法∙C．过滤除菌法∙D．煮沸法∙E．紫外线消毒法（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：6.下列哪一项不是大肠埃希菌耐热肠毒素的特性( )∙A．对热稳定，100℃加热20分钟仍不被破坏∙B．由STa和STb两个活性部分组成∙C．STb为主要毒性所在∙D．激活鸟苷环化酶∙E．激活腺苷环化酶（分数：1.00）A.B.C.D.E. √解析：7.下列微生物中，哪一种不易在人体口腔及咽部分离培养出( )∙A．肺炎链球菌∙B．金黄色葡萄球菌∙C．草绿色链球菌∙D．军团菌∙E．表皮葡萄球菌（分数：1.00）A.B.C.D. √E.解析：[解析] 军团菌一般由痰、气管分泌物、胸水和血液检出。
8.军团菌感染后，不易采集哪种标本进行微生物学检查( )∙A．痰∙B．肺泡盥洗液∙C．粪便∙D．活检肺组织∙E．血（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：9.紫外线杀菌的最佳波长为( )∙A．200nm∙B．260nm∙C．560nm∙D．300nm∙E．650nm（分数：1.00）A.B. √C.D.E.解析：10.细菌形态和生理活性比较典型的阶段是( )∙A．迟缓期∙B．对数增殖期∙C．稳定期∙D．衰亡期∙E．以上都不对（分数：1.00）A.B. √C.D.E.解析：11.大肠埃希菌能为人体合成( )∙A．维生素A∙B．维生素C∙C．维生素E∙D．维生素K∙E．必需氨基酸（分数：1.00）A.B.C.D. √E.解析：12.大肠埃希菌H抗原为( )∙A．耐热蛋白质∙B．不耐热蛋白质∙C．多糖磷脂∙D．B+C∙E．以上都不对（分数：1.00）A.B. √C.D.E.解析：13.一般认为细菌的运动器官是( )∙A．芽胞∙B．荚膜∙C．鞭毛∙D．菌毛∙E．纤毛（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：14.下列属于专性厌氧的细菌是( )∙A．微球菌∙B．破伤风梭菌∙C．肺炎球菌∙D．肠球菌∙E．脑膜炎球菌（分数：1.00）A.B. √C.D.E.解析：15.MIC是指( )∙A．最低抑菌浓度，∙B．最低杀菌浓度∙C．敏感∙D．抑菌圈直径∙E．最大抑菌浓度（分数：1.00）A. √B.C.D.E.解析：16.常用实验动物纯化上的要求是要选用( )∙A．清洁动物∙B．无菌动物∙C．纯品系动物∙D．无特殊病原体动物∙E．常规动物（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：17.哪种物质不是细菌产生的代谢产物( )∙A．细菌素∙B．抗生素∙C．内毒素∙D．抗毒素∙E．侵袭性酶（分数：1.00）A.B.C.D. √E.解析：18.葡萄球菌A蛋白存在于细菌的( )∙A．细胞壁∙B．细胞膜∙C．鞭毛∙D．菌毛∙E．脂多糖（分数：1.00）A. √B.C.D.E.解析：19.下列何种病原菌进行常规细菌涂片检查时，宜选用荧光显微镜( )∙A．肺炎链球菌∙B．流感嗜血杆菌∙C．军团菌∙D．放线菌∙E．隐球菌（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：20.19世纪末发现的主要病原体不包括( )∙A．大肠埃希菌∙B．肺炎杆菌∙C．艾滋病病毒∙D．脑膜炎球菌∙E．流感杆菌（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：21.细菌按其外形，主要有哪三大类( )∙A．葡萄球菌、链球菌和杆菌∙B．球菌、杆菌和螺形菌∙C．球菌、杆菌和弧菌∙D．球菌、杆菌和芽胞菌∙E．以上都不对（分数：1.00）A.B. √C.D.E.解析：22.可进行“冷增菌”的病原菌是( )∙A．炭疽芽胞杆菌∙B．红斑丹毒丝菌∙C．产单核细胞李斯特菌∙D．白喉棒状杆菌∙E．阴道加特纳菌（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：[解析] 产单核细胞李斯特菌因其在4℃能生长，故可进行“冷增菌”，在半固体培养基上可出现倒伞形生长。
实验动物微生物学与寄生虫学
无任何可以查到的细菌
注：● 必须检查，要求阴性；○ 必要时检查，要求阴性。
● ● ● ○ ○ ● ●
表 3-5 动物等级 无 无 特 菌 定 动 病 原 物 体 动 物 清 洁 动 物 普 通 级 动 物
豚鼠、地鼠、兔病原菌检测项目 动物种类 豚鼠 ● ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ● ○ ● ● 地鼠 ● ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ● ○ ○ ● ● ● ● ● ● ○ ○ ● 兔 ● ○ ○ ○ ○
表 3-2 动物等级 无 菌 动 物 无 特 定 病 原 体 动 物 清 洁 动 物 普 通 级 动 物 病
豚鼠、地鼠、兔病毒检测项目 动物种类 毒 豚鼠 ● 地鼠 ● 兔
淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 Lymphocytic choriomeningitis virus
兔出血症病毒 Rabbit hemorrhagic disease virus 仙台病毒 Sendai virus ● ） 兔出血症病毒 1 Rabbit hemorrhagic disease virus 仙台病毒 Sendai virus 小鼠肺炎病毒 Pneumonia virus of mice ● 呼肠弧病毒Ⅲ型 Reovirus type Ⅲ ● 轮状病毒 Rota virus 无任何可查到的病毒 ● 注：● 必检项目，要求阴性。 ▲必须检测项目，可以免疫。1）不能免疫，要求阴性。
▲ ● ● ● ● ● ● ● ●
表 3-3 动物等级 无 特 定 病 原 体 动 物 普 通 类 病 毒 犬 猴 狂犬病病毒 Rabies virus ▲ 犬细小病毒* Canine parvovirus ▲ 犬瘟热病毒* Canine distemper virus ▲ 传染性犬肝炎病毒 ▲ Infectious canine hepatitis virus 猕猴疱疹病毒 1 型（Ｂ病毒） B virus ●
第三章实验动物的微生物学分类
三、传染病的防疫原则及措施
• 传染病发生的条件： 传染源、传播途径和易感动物。
预防和控制措施 1. 预防措施 1）从有资质的实验动物供应商处采购动物 2）制定科学的饲养管理和操作规程,严格按操作 规程进行饲养管理和动物实验 3）定期进行微生物学监测 4）彻底消灭饲养室内外的野鼠 5）大动物接种疫苗 2. 控制措施 1）重要传染病感染要及时捕杀、消毒、隔离 2）大动物隔离治疗 3）不明死亡原因要剖检明确诊断
1. 病毒性疾病
3. 流行性出血热病毒感染（Epidemic hemorrhagic fever virus infection） • 病原学：流行性出血热病毒（Bunyaviridae, Hantavirus) • 流行病学： 传染源：带毒野鼠和实验大鼠 传播途径：咬伤接触传播，气溶胶吸入 易感动物：大鼠 • 临床症状：无症状，人感染后得流行性出血热 • 诊断：血清学检查，病毒分离 • 预防和控制： 预防：饲养区内外捕杀野鼠，不从无生产许可证单位购买动物。 控制：捕杀血清学检查阳性大鼠，消毒、隔离
不同微生物级别动物用于实验的比较
项目 传染病 寄生虫 GF/GN动物 无 无 SPF动物 无 无 CV动物 有或可能有 有或可能有
实验结果
应用动物数 统计学价值
准确
少 好
准确
少 可能好
有疑问
多 不准确
长期实验
实验中死亡率 长期实验存活率 实验的正确设计 实验结果的统计价值
可能好
很低 约100% 可能 很高
专门训练
高
较高
CL
CV
半屏障系 统
开放系统
亚高效过 滤
不处理
直接接触
直接接触
一般
一般
较低
实验动物遗传学和微生物分类3
特点：其个体间的差异很小，用于实 验的重复性高，对各种应激刺激反应均一， 实验结果精确，如同活的“分析天平”。
（一）亚系
育成的近交系在维持过程中可能由 于残余杂合基因的分离或基因突变而导 致部分遗传组成的改变，造成同一品系 内不同分支之间在遗传学上的差异，从 而形成亚系。
1．形成 ⑴起源：与CBA同一起源。
⑵亚系： C3H/Bi,C3H/He,C3H/HeJ,C3H/St,C3HeB/FeJ,C3 H/DiSn,C3H/Sf等。
⑶近交代数：138代（杰克逊实验室1973）。 2．毛色和H-2基因：AA、BB、CC（野生色）， H-2k。
⑴免疫学特性： 较易诱发免疫耐受性。对鼠伤寒 沙门氏菌补体5有抵抗力。
⑵亚系： BALB/c,BALB/ccd,BALB/cJ,BALB/cAnN等。
⑶近交代数：157代（美国N·I·H1973）。
2．毛色和H-2基因：AA、bb、cc（白色），H-2d。
⑴免疫学特性：易患慢性肺炎。多数个体于6月龄以 后出现免疫球蛋白过多症。主要是IgG1和IgA量的 增加。
⑵生理学特性：血压较高。 大部分雄鼠在20月龄前 出现脾脏淀粉样变性。对X线照射极为敏感。对鼠 伤寒沙门氏菌敏感，对麻疹病毒中度敏感。
因为易患肺炎，最好不要和其它近交系 小鼠同室饲养。不使其它近交系小鼠发病的 环境病原菌易使BALB/C患病。
1．形成：
⑴起源：1921年Little由Abby Lathrop得到动物后 开始近亲交配，育成数个近交系。以57号母鼠和52 号公鼠交配为起源者标为C57，C57中毛色固定为 巧克力色者称为C57BR，固定为黑色者称为C57BL。
实验动物学第三章 实验动物的微生物和寄生虫学控制
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5.抗辐射能力 GF 动物有较强的抗辐射能力。普通动物受辐射后 往往是由于细菌感染引起的并发症而造成动物死亡， GF动物就不存在这一问题，抗辐射的耐受量高。 6.生长发育 无菌状态下不同种属的生长发育有所不同。 GF 小鼠生长曲线在育成期与普通动物 (CV) 相似， 以后则逐渐减慢，最终GF动物的成年体重小于CV动 物。繁殖性能两者相似。 7.寿命 GF动物比CV动物要长得多。
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二、清洁级动物（clean（CL） animal） 定义：除普通级动物应排除的病原外，不携 带对动物危害大和对科学研究干扰大的病 原的实验动物。简称清洁动物。 来源：SPF动物扩群。 饲养条件：屏障系统大规模生产。 应用：各种科研、教学用大小鼠。
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三、无特定病原体级动物（specific pathogen free （SPF）animal) 定义：除清洁动物应排除的病原外，不携带主要潜 在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的 实验动物。简称无特定病原体动物或SPF动物。 来源：将无菌动物/悉生动物转移到屏障系统中 饲养繁殖。 饲养条件：屏障系统内大 规模生产/隔离器内保种。 应用：SPF大小鼠为国际 通行的科研用动物。
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第二节
无菌级动物和悉生动物
一、无菌级动物和悉生动物的由来和发展 悉生动物：广义的悉生动物包括无菌动物和已知菌动物。 • 最初是研究微生物和动物（人）之间的依存关系而建立发 展起来的。 发展史： 1. 1895年-1910年：解决了动物可在无菌状态下生存的问题。 2. 1910年-1940年：因技术问题没有解决，悉生生物研究进 展缓慢。 3. 1940年- ：技术问题解决，悉生动物研究进展迅速。
实验动物微生物学和寄生虫学质量控制
实验动物微生物学 质量控制
实验动物微生物学质量标准
微生物检测：包 括细菌、真菌、 病毒等
微生物控制：包 括消毒、灭菌、 隔离等
微生物监测：包 括环境监测、动 物监测等
微生物管理：包 括人员培训、设 备维护等
实验动物微生物学监测方法
微生物培 养：通过 培养基培 养微生物， 观察其生 长情况
微生物检 测：通过 微生物检 测试剂盒 检测微生 物的存在
施
设立专门的监 督机构，负责 监督实验动物 微生物学和寄 生虫学质量控 制的实施情况
制定详细的检 查标准和流程， 确保检查结果 的准确性和公
正性
建立反馈机制， 及时纠正存在 的问题，确保 实验动物微生 物学和寄生虫 学质量控制的
持续改进
实验动物微生物学 和寄生虫学质量控 制中的问题与对策
常见问题及原因分析
实验动物微生物学 和寄生虫学质量控 制的发展趋势与展
望
国际发展动态与趋势分析
国际标准：国际实验动物微生物学和寄生虫学质量控制标准不断更新和完善 技术进步：新技术、新方法在实验动物微生物学和寄生虫学质量控制中的应用 法规政策：各国政府对实验动物微生物学和寄生虫学质量控制的法规政策不断加强 合作交流：国际合作与交流在实验动物微生物学和寄生虫学质量控制中的重要性日益凸显
评估标准：寄生虫 种类、数量、感染 程度等
评估方法：显微镜 观察、血清学检测、 分子生物学检测等
改进措施：加强饲 养管理、改善环境 卫生、定期驱虫等
持续改进：定期评 估、及时调整改进 措施、确保实验动 物寄生虫学质量控 制达到预期效果
实验动物微生物学 和寄生虫学质量控
制实施
建立质量控制体系
制定质量控制标准： 明确微生物学和寄 生虫学的质量控制 标准
动物微生物学实验
三、注意事项
当镜头与标本片几乎接触时， 当镜头与标本片几乎接触时，不可再用粗 调节螺旋向上移动载物台或向下移动镜头。 调节螺旋向上移动载物台或向下移动镜头。 镜头与玻片只能用擦镜纸擦拭 香柏油的用量以1-2滴为宜 不可太多。 滴为宜， 香柏油的用量以 滴为宜，不可太多。 为了增强视野亮度，应将聚光器调至最高， 为了增强视野亮度，应将聚光器调至最高， 光圈调至最大。 光圈调至最大。
观察完毕，下降载物台， 4) 观察完毕，下降载物台，取下标本 先用擦镜纸擦去镜头上的油， 片。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然 后再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头 上残留油迹， 上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残 留的二甲苯。 留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜 以免损坏镜头。 头，以免损坏镜头。 将各部分还原， 5) 将各部分还原， 将接物镜转成八 字形，再向下旋，罩上镜套。 字形，再向下旋，罩上镜套。
四、实验报告内容
显微镜油镜的使用方法及注意事项。 绘制 细菌镜下图，注意细菌形态结构，两 端形态及颜色等。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
实验一 显微镜的使用、 显微镜的使用、细菌形态和结构的 观察
一、 目的
学会显微镜特别是油镜的使用方法 认识细菌形态、排列与特殊结构
二、实验材料：
显微镜、细菌标本片、二甲苯、香柏油、 擦镜纸
三、实验内容
（一）显微镜的构造和使用 （二）细菌形态与特殊结构的观察
光 学 显 微 镜
油镜观察
用粗调螺旋提起镜筒， 1) 用粗调螺旋提起镜筒，转动转换器将油镜转至镜筒正 下方。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。 下方。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。右手顺时针方向 慢慢转动粗调螺旋，上升载物台，并及时从侧面注视使油 慢慢转动粗调螺旋，上升载物台， 浸物镜浸入油中， 浸物镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止 ( 注意切 勿压到标本，以免压碎玻片， 勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头 ) 。 双眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋， 2) 双眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋，下 注意：此时只准下降载物台， 降载物台 ( 注意：此时只准下降载物台，不能向上调 当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋， 动 ) ，当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋， 并移动标本直至标本物象清晰为止。 并移动标本直至标本物象清晰为止。 3) 如果向上转动粗调螺旋已使镜头离开油滴又尚未发现 标本时，可重新按上述步骤操作直到看清物象为止。 标本时，可重新按上述步骤操作直到看清物象为止。
动物微生物实践报告
动物微生物实践报告一、实验目的本实验旨在通过实践操作，掌握动物微生物学的基本实验技能，了解动物体内微生态平衡的重要性，以及微生物对动物健康的影响。
二、实验原理动物微生物学是研究动物体内外正常菌群的一门科学，这些微生物在正常情况下对动物是无害的，甚至是有益的。
然而，当这些微生物的数量或种类发生变化时，可能会引发一系列健康问题。
本实验通过采集动物样本，进行微生物分离培养和鉴定，以了解动物体内微生物的分布与数量，评估其健康状况。
三、实验步骤1.实验材料准备：采集动物样本，包括粪便、皮肤、口腔等部位；培养基、显微镜、接种环、恒温培养箱等实验器材。
2.样本处理：将采集的动物样本进行处理，如稀释、搅拌、涂布等，以便于微生物的分离培养。
3.微生物分离培养：将处理后的样本接种于适宜的培养基上，在恒温培养箱中培养一段时间，使微生物生长繁殖。
4.微生物鉴定：观察培养出的微生物的形态、染色、生长情况等特征，结合显微镜观察结果，对微生物进行鉴定。
5.数据记录与分析：记录实验数据，包括微生物的种类、数量、生长情况等，分析微生物在动物体内的分布与数量变化，评估动物健康状况。
四、实验结果与分析经过实验操作，我们成功分离培养出了多种动物体内的微生物，并对其进行了鉴定。
以下是实验结果与分析：1.微生物种类与分布在粪便样本中，我们分离出了大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌等肠道微生物；在皮肤样本中，分离出了葡萄球菌、链球菌等皮肤微生物；在口腔样本中，分离出了口腔链球菌、乳杆菌等口腔微生物。
这些微生物在动物体内具有不同的生态位和生理功能，对维持动物微生态平衡具有重要作用。
2.微生物数量变化通过对不同部位样本中微生物数量的统计，我们发现肠道中的大肠杆菌和肠球菌数量较多，而双歧杆菌数量较少；皮肤上的葡萄球菌和链球菌数量变化较大；口腔中的口腔链球菌和乳杆菌数量相对稳定。
这些数据表明，不同部位的微生物数量存在差异，可能与动物的生理状态和环境因素有关。
微生物实验报告
动物微生物及免疫学实验报告一、实验目的（一）掌握一般培养基的制备原理及要求，掌握培养基酸碱度的测定，熟悉一般培养基的制备过程和各种器皿灭菌方法。
（二）掌握细菌分离培养的基本要领和方法，掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏染色法及油镜的使用方法，并认识革兰氏染色的反应特性。
（三）掌握学习用微生物学原理诊断疾病的一般方法及步骤。
二、实验用品（一）器材量筒、烧杯、电子天平、漏斗、三角烧瓶、空试剂瓶、玻璃棒、玻璃平皿、刻度吸管、pH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试剂瓶瓶塞、扎绳、放大镜、包装纸、洗耳球、酒精灯、载玻片、火柴、吸水纸、剪刀、记号笔、接种环、注射器、镊子、钳子、毫米尺、培养箱、水浴培养箱、高压蒸汽灭菌锅、油镜（二）试剂及材料肘胨、蛋白胨、猪胆盐、氯化钠、琼脂、乳糖、0.01%结晶紫水溶液、0.5%中性红水溶液、血清、胰化蛋白胨、酵母提取物、氢氧化钠、盐酸、牛血清、革兰氏染色液、蒸馏水、小白鼠、病猪内脏三、实验步骤（一）培养基的制备（所有用到的器皿都已121℃高压灭菌15~30min，倾注平板在无菌操作台内完成，并放在无菌操作台内）1、麦康凯培养基（1）组成：蛋白胨17g、肘胨3g、猪胆盐5g、氯化钠5g、琼脂17g、乳糖10g、0.01%结晶紫水溶液10ml、0.5%中性红水溶液5ml、蒸馏水1000ml（2）方法：将蛋白胨、肘胨、猪胆盐和氯化钠溶解于400ml蒸馏水中，调节pH至7.2。
将琼脂加入600ml蒸馏水中，并加入乳糖，加热熔化。
将两液混合，分装于烧瓶内，用纱布、扎绳等捆好后，121℃高压灭菌15~30min。
待冷却至50 ~ 55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。
注：结晶紫和中性红水溶液配好后需经高压灭菌。
2、血清平板（1）组成：营养琼脂、牛血清（2）方法：将灭菌的营养琼脂加热熔化，冷却至45~50℃时，加入牛血清，并混匀，倾注平板。
注：不得将牛血清一并加入后再灭菌。
3、LB培养基（1）组成：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g（2）方法：在950ml蒸馏水中加入胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂和氯化钠，调节pH 至7.4，加热熔化，分装于瓶中，用纱布、扎绳等捆好后，121℃高压灭菌15~30min。
(第三组)微生物实验设计
一、实验原理肠道杆菌的细菌为革兰氏阴性菌，大多数有鞭毛，能运动。
少数无鞭毛不能运动，不产生芽孢，需氧或兼性厌氧，在普通培养基上，一般都生长良好，均能发酵葡萄糖产酸或产气，触酶试验阳性，氧化酶试验阴性，还原硝酸盐。
这类细菌是人类和动物肠道中的细菌，有的引起腹泻、肠炎、肠热症和痢疾等。
有的为条件致病菌，有时也可引起身体各个部位的感染。
二、实验材料1.病鸡：怀疑被大肠杆菌或沙门氏菌感染2.培养基：半固体培养基麦康凯平板三糖铁高层斜面蛋白胨水葡萄糖蛋白胨水3.革兰式染色试剂：草酸铵结晶紫溶液、革兰氏碘溶液、95%酒精，沙黄水溶液4. 生化管：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、枸橼酸盐、H2S、尿素5. 生化试剂：吲哚试剂， MR 、VP 试剂7.药敏实验试剂：青霉素、复方新诺明、氯霉素三、实验内容及其安排（一）、制备培养基：麦康凯、半固体、三糖铁高层斜面、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水。
（二）、解剖实验动物，细菌分离培养：病料抹片，染色镜检。
划线接种麦康凯或S·S琼脂平板。
（三）、观察细菌培养性状，选择可疑菌落进行纯培养。
普通琼脂平板、伊红美兰琼脂平板、三糖铁琼脂斜面。
（四）、观察细菌纯培养结果，细菌抹片，革兰氏染色镜检，观察细菌抹片及纯培养情况，。
（五）做生化试验、药敏试验。
（六）观察实验结果，写实验报告。
第一天：制备培养基解剖实验动物、病料抹片、细菌分离培养1.S.S培养基：50g S·S培养基+800ml蒸馏水，煮沸溶化浇平板（15ml/块平板），无需高压2.麦康凯培养基3.三糖铁琼脂4.葡萄糖蛋白胨水：1.25g蛋白胨+1.25g葡萄糖+1.25g磷酸氢二钾+250ml水，加热溶解，调pH至7.6，分装40根短试管高压（3指半高，约5-8ml）5.蛋白胨水：1.25g蛋白胨+0.625gNaCl+125ml水，调pH至7.6，分装40根短试管，捆扎，高压，121℃15分钟（2指高，约2-4ml）6.半固体：分别称取蛋白胨5g、牛肉膏2.5g、氯化钠2.5g、磷酸氢二钾0.5g、蒸馏水500ml，加热溶解，调pH7.6，过滤称琼脂粉2g+肉汤500ml,煮沸，待琼脂粉完全溶化，分装短试管（2指高，约2-4ml）病鸡剖检的方法和步骤一、剖检要求：剖检鸡最好在死前或濒死期进行。
医学微生物实验3：细菌的分离与纯化
实验3 微生物的纯种分离培养微生物广泛地分布在自然界的土样、水体、空气、动植物体表及人体、动物体的排泄物中。
它们以单个的菌体、无性孢子和芽孢的形式存在。
由于单一的自然界环境并不能完全满足微生物对水、空气、营养物质、温度、pH的综合要求，它们往往以“散居”的状态出现，而不能形成人们肉眼可直接观察到菌落。
不同的自然环境中，微生物的种类和数量差异很大。
肥沃的土壤，富养化的水体，是许多微生物麇集、孳生的场所，在这里存活着能分解淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素、木质素、果胶、农药、含磷有机物（卵磷脂、肌醇、核酸等）、石油以及溶解铜矿的细菌、放线菌、真菌等多种类的微生物，如何根据微生物的生理要求，按照人类的需求，将它们从自然界中分离出来，获得纯种，发挥微生物的特长为人类的生产和生活服务，是微生物研究中最基础的实验技术。
一、实验目的：1．学会将混杂的各种微生物分离成纯种，统计分析样品中微生物的种类和数量的方法。
2．学会从菌落及培养特征区分细菌、酵母菌、放线菌和霉菌。
3．学会好氧微生物平板及斜面培养的方法。
二、实验原理：在自然界中，微生物的种类很多，数量很大，为了获得单个菌体，首先必须把要分离的材料进行适当的释放，按其生长所需要的条件，使其在平板上，由一个菌体繁殖成单个菌落，这样，就能从中挑选出所需要的纯种，由于细菌、放线菌和霉菌所要求的营养条件不同，利用不同的培养基制成平板进行分离，然后从菌落形态上的差异，可以把细菌、放线菌和霉菌三大类群区分并可计算出其数量，分别接种到试管斜面上，然后，在平板上反复进行分离培养，最后可获得纯种。
三、实验材料和用具：1．材料（1）土壤样品（2）培养基：①牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基（%）牛肉膏0.3-0.5g蛋白胨 1.0gNaCl 0.5g琼脂2.0g蒸馏水100mLpH 7.2-7.4，0.1Mpa 压力，灭菌20-30分钟。
配制液体培养基时不加琼脂；半固体培养基加0.3-0.5%琼脂。
中和试验(兽医微生物第三版)
中和试验根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学实验称为中和试验。
中和试验极为特异性和敏感，主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫性的评价、免疫血清的质量评价和测定动物血清抗体的检测等。
中和试验的基本过程是，先将抗血清与病毒混合，经适当时间作用。
然后接种于宿主系统检测混合液中的病毒感染力。
宿主系统可以是鸡胚、动物或细胞培养，根据病毒性质而定，目前大多采用细胞中和试验。
最后根据其产生的保护效果差异，可判断该病毒释放已被中和，并根据一定的方法计算出中和的程度（中和指数），即代表抗体的效价。
根据测定方法的不同，中和试验主要有两种。
一是测定能使动物或细胞死亡数目减少至50％（半数保护率，PD50）血清稀释度，即终点法中和实验。
二是测定是病毒在细胞上形成的空斑数目减少至50％时的血清稀释度，即空斑减少法中和试验。
毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒的中和试验基本相同。
终点法中和试验本法是滴定使病毒感染力减少至50％的血清中和效价或中和指数。
有固定病毒稀释血清及固定血清稀释病毒两种滴定方法。
固定病毒稀释血清法将抑制的病毒量固定，血清作倍比稀释，常用于测定抗血清的中和抗体效价。
病毒的毒价测定毒力或毒价单位过去多用最小致死量（MLD），即病毒接种实验动物后在一定时间内全部致死的最小病毒剂量。
此法比较简单，但由于剂量递增与死亡率递增的关系不是一条直线，而是呈S形曲线，在愈接近100%死亡时，对剂量的递增愈不敏感。
而死亡率愈接近50％时，剂量与死亡率呈直线关系，故现基本上采用半数致死量（LD50）表示毒价单位。
而且LD50的计算应用了统计学方法，减少了个体差异的影响，因此比较正确。
以感染发病作为指标的，可用半数感染量（ID50）；以体温反应作指标者，可用半数反应量（RD50）。
用鸡胚测定时，可用鸡胚的半数致死量（ELD50）或鸡胚半数感染量（EID50）；在细胞培养上测定时，则用组织培养半数感染量（TCID50）。
动物科学微生物实验指导
动物微生物学实验指导目录实验1 细菌的简单染色和革兰氏染色实验2 细菌的芽胞、荚膜、鞭毛染色及运动性观察实验3 微生物细胞形态及菌落特征观察实验4 培养基制作、灭菌消毒及无菌操作接种技术实验5 微生物的分离纯化与稀释平板菌落计数实验6 微生物细胞大小测定及显微镜直接计数附录1 常用培养基配方附录2 常用染色液的配制附录3 常用试剂和指示剂的配制参考书目实验1 细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的1、学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法；2、学习显微镜油镜观察的方法；二、实验内容1、细菌的简单染色；2、细菌的革兰氏染色；三、实验原理简单染色法是一种最基本的染色方法，是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。
因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，而碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红、孔雀绿或蕃红）等进行染色，当这类染料解离后，染料离子带正电荷，使菌体着色。
简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色反应。
通过革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。
这是因为两类菌的细胞壁结构和成分的不同，G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经过蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，即紫色。
四、实验材料1、活材料：培养12～16h的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），培养24h 的大肠杆菌（Escherichia coli）。
动物微生物学实验
(加入1.5%-1.8%琼脂即成固体培养基)
三 仪器材料
微波炉、高压灭菌器、玻璃器皿、PH试 纸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、氢 氧化钠。
四 操作步骤 一)、培养基的制备原则和要求 1.药品纯净 , 称量准确。 2.所用器皿须洁净 3.准确测定调节pH值. 4.过滤培养基 5.严格控制灭菌时间和温度. 二)、培养基制备过程及方法 称量--加热溶化--过滤--PH滴定--分装--灭菌
实验三 培养基的制备
一目的要求 1.掌握一般培养基制备的原则和要求。 2.熟悉一般培养基制备的过程。
二.原理
牛肉膏蛋白胨培养基是培养腐生性细菌的常规培 养基，也是微生物实验室中常备培养基，为天然 培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、其中 牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐，蛋白 胨主要提供氮源、NaCl提供无机盐。
PH的滴定: 1.酸度计法 2.PH比色计法:
五 注意事项
1.称量准确 2.加热搅拌 3.补足水分 4.容器适合 5.高压彻底 6.空白培养
六 作业与思考题
（1）为棉茬再用报纸包起来， 经高压蒸汽灭菌后才能使用?
1)肉浸液肉汤（普通肉汤）的制法 蛋白胨 10g，氯化钠 5g，磷酸氢二钾 2g。 牛肉粉或牛肉膏3g,水1000ml .PH7.4—7.6
121.3度15磅高压15钟. 2)营养琼脂培养基（普通琼脂）的制法 普通肉汤 1000ml 琼脂粉15g PH7.4—7.6 121.3度15磅高压15钟. 3)半固体培养基的制法 4）鲜血琼脂的制法
（2）配制培养基时为什么要调节pH?
实验动物微生物学分类
实验动物微生物学分类
1.普通级动物（CV，Conventional Animal）：
不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性传染病的病原。
2.清洁动物（CL，Clean Animal）：
除普通级动物应排除的病原体外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体。
饲养在屏障系统中。
空气要经过滤净化，饲养室要保持正压，进入室内的—切物品要经过消毒灭菌，工作人员进入要洗澡和穿灭菌工作服，动物饮水要经灭菌。
3.无特定病原体动物（SPF，Specific Pathogenfree Animal）：
除清洁动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病菌和对科研干扰大的病原。
饲育在屏障系统中，是通过无菌动物、悉生动物、SPF动物而获得的。
笼具、饲料饮水都要经过特殊处理，并有严格的检疫、消毒、隔离制度。
科研实验主要使用 SPF 动物。
4.无菌动物（GF，Germfree Animal）
无可检出的一切生命体。
此种动物自然界中并不存在，它是经人工剖腹产净化培育出来的。
在隔离器中剖腹产取出其仔体，用无菌母鼠代乳或人工哺乳。
5.悉生动物(GnorobioticAnimal)
动物体内所携带生命体(病毒、细菌、真菌、原虫和寄生虫)是已知的，也叫已知菌动物。
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一目的要求 1.掌握一般培养基制备的பைடு நூலகம்则和要求。 2.熟悉一般培养基制备的过程。
二.原理
牛肉膏蛋白胨培养基是培养腐生性细菌的常规培 养基，也是微生物实验室中常备培养基，为天然 培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、其中 牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐，蛋白 胨主要提供氮源、NaCl提供无机盐。 牛肉膏 5.0g 食盐 5.0g pH 7.2-7.4 蛋白胨 10.0g 自来水1000mL (加入1.5%-1.8%琼脂即成固体培养基)
PH的滴定: 1.酸度计法 2.PH比色计法:
五 注意事项
1.称量准确 2.加热搅拌 3.补足水分 4.容器适合 5.高压彻底 6.空白培养
六 作业与思考题 （1）为什么微生物实验室所用的移液管口或滴 管口的上端均需塞上一小段棉茬再用报纸包起来， 经高压蒸汽灭菌后才能使用? （2）配制培养基时为什么要调节pH? （3）制作平板培养基的注意事项是什么? （4）培养基配好后，为什么必须马上进行高压 蒸汽灭菌?如不能及时灭菌时，应将培养基暂时 放置何处?
1)肉浸液肉汤（普通肉汤）的制法 蛋白胨 10g，氯化钠 5g，磷酸氢二钾 2g。 牛肉粉或牛肉膏3g,水1000ml .PH7.4—7.6 121.3度15磅高压15钟. 2)营养琼脂培养基（普通琼脂）的制法 普通肉汤 1000ml 琼脂粉15g PH7.4—7.6 121.3度15磅高压15钟. 3)半固体培养基的制法 4）鲜血琼脂的制法
三 仪器材料 微波炉、高压灭菌器、玻璃器皿、PH试 纸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、氢 氧化钠。
四 操作步骤 一)、培养基的制备原则和要求 1.药品纯净 , 称量准确。 2.所用器皿须洁净 3.准确测定调节pH值. 4.过滤培养基 5.严格控制灭菌时间和温度. 二)、培养基制备过程及方法 称量--加热溶化--过滤--PH滴定--分装--灭菌