微生物学实验.

二、基本原理
1 、革兰氏染色原理
通过结晶紫液初染和碘液媒染后，在细菌的细胞膜内可 形成不溶于水的结晶紫液和碘液的复合物，G+细菌由于 其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联致密，因此遇脱 色剂乙醇处理时，因失水而使网孔缩小，再加上它不含 类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与 碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。
染色结果（革兰氏染色）
枯草芽孢杆菌（革兰氏染色）
大肠杆菌（革兰氏染色）
染色结果（革兰氏染色）
金黄色葡萄球菌（革兰氏染色）
染色结果（芽孢染色）
枯草芽孢杆菌（芽孢染色）
注意事项
1、革兰氏染色关键是脱色时间，如脱色时间过长，会 造成假阴性。如脱色时间过短，会造成假阳性。 2、革兰氏染色的菌种，选用培养18-24h菌龄的细菌为 宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶使革兰氏阳性 菌转呈阴性反应。 3、芽孢染色的菌种的菌龄，应使大部分芽孢仍保留在 菌体内为宜。芽孢杆菌一般在37℃下培养12-14h效果 最佳。 4、在孔雀绿加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂 片干涸。
实验报告
1、绘枯草芽孢杆菌芽孢染色图
2、将革氏染色结果填于下表
菌种 大肠埃希氏菌 枯草芽孢杆菌
菌体颜色
菌体形态（图示）
G+或G-
实验三 放线菌和真菌的形态 特征观察
折射率(n) 空气 1.00 水 1.33 香柏油 1.52 玻璃 1.55
2 、增加显微镜的分辨率
分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离的能力。 D值愈小则表明分辨力愈强。
D=0.61λ/NA NA=n·sinα/2
λ：光波波长 NA：物镜的数值孔径值
n：介质折射率 α：镜口角（总是小于180°）
3 、器具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、镊子、 木夹、香柏油、酒精乙醚液、擦镜纸等。
四、实验步骤
1 、革兰氏染色
涂片： 用接种环挑取少许菌苔于水滴中混匀后，再挑取2-3 环菌悬液至另一载片上涂开
干燥： 室温自然干燥或电吹风吹干
固定： 涂片朝上，通过火焰2-3次
初染：滴加草酸铵结晶紫覆盖涂片区域染色2min，水洗
棒状杆菌
螺旋菌
注意事项
1 、油镜工作距离短，故操作时要特别谨慎，切 忌用眼 睛对着目镜边观察边下降镜筒，而应从 侧面注视。
2 、调焦时，应特别注意，切勿将粗调节器向反 方向(由高向低)转动而损失镜头和玻片。
实验报告 1、绘细菌三种基本形态图
2、简述油镜的工作原理
实验二 细菌的芽孢染色和 革兰氏染色法
三、实验器材
1 、标本：细菌三型玻片。 2 、试剂：香柏油、镜头清洗液（V乙醚:V酒精＝7:3）。 3 、器具：显微镜（有油镜）、擦镜纸、玻璃棒等。
四、实验步骤
1 、放置标本:将染色的细菌三型玻片置于镜台上。 2 、找合适的视野: 先用低倍镜和高倍镜寻找合适的视野并将
欲观察的部位其移到视野中央。 3 、加香柏油。 4 、转换油镜：将油镜转到工作位置，使油镜镜头浸入香柏油
三、实验器材
1 、菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 或巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。
2 、试剂：革兰氏染液:草酸铵结晶紫染液、卢戈氏典液、 95%乙醇、番红复染液； 芽孢染液:5%孔雀绿染色液、 0.5%番红水溶 液。
一、实验目的
1 、学习并掌握革兰氏染色和芽孢染色的 原理和方法。
2 、了解革兰氏染色和芽孢染色在细菌分 类鉴定中的重要性。
二、基本原理
1 、革兰氏染色原理
革兰氏染色法是Gram发明的一种细菌鉴别染色法， 通过这种染色方法，可将细菌分为两大类： 一类被染成紫色，称为革兰氏阳性细菌； 一类被染成红色，称为革兰氏阴性细菌。 其染色原理主要根据两类细菌的细胞壁化学组成和 结构不同。
染色结果：阴性细菌（G-）： 染成红色
2 、芽孢染色原理
细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着 色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。 芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后 又难以脱色这一特点，用着色力强的染色剂孔雀绿 或石炭酸，在加热条件下，延长染色时间，使染料 不仅进入菌体也进入芽孢内，进入菌体的染料经水 洗后被脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱，当 用对比度大的复染剂番红复染后，芽孢仍保留初染 剂的绿色，而菌体则被染成复染剂的红色。
中。注意油镜镜头千万不要压在玻片标本上。 5 、调节聚光器与油镜数值孔径一致 ： 将聚光器上升到最高
位置，可变光阑开到最大。 6 、调焦： 转动细调焦螺旋，再缓慢地提升油镜调焦至物像
清晰。注意下降或上升镜筒或载物台绝不可用力过猛。 7 、观察: 仔细观察细菌的三种基本形态 8 、显微镜用毕后的处理: 上升镜筒，取下玻片，清洁油镜
实验一 显微镜（油镜）的使用和细菌 的三种基本形态观察
一、实验目的
1、学习并掌握油镜的基本原理和使用方法。
2、观察和识别细菌的三种基本形态。
二、基本原理
1 、增加照明强度
在油镜与载玻片之间加入与玻片的折射率相仿的 镜油，使进入物镜的光线不会由折射或反射造成损失， 基本上全进入镜头，结果提高了照明强度，使图像更 加清晰。
反之， G-细菌的细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖 层薄，交联度差，遇脱色剂乙醇后，以类脂为主的外膜 迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与 碘复合物的溶出，因此细胞褪成无色。再经番红、沙黄 等红色染料复染, 就使G-细菌呈现红色, 而G+细菌则保 留紫色。染色结果：阳性细菌（G+）： 染成紫色
染 媒染：滴加卢戈氏碘液，染色1min，水洗 色 脱色：用滴管加95%乙醇冲洗脱色约30秒，立即水洗
复染：滴加番红液复染约2min，水洗
镜检 清洁显微镜
2、芽孢染色
制片 染色 滴加孔雀绿染液于涂片源自文库，用木夹夹住载玻片在微
火上加热至染液冒蒸汽时开始计时5min 加热过程中要及时添加染色液，切勿让标本干涸 水洗 待玻片冷却后，用缓流水冲洗至流出的水无 色为 止 复染 用番红染色液复染2min 水洗 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出的水无色 镜检 干后用油镜观察