生物技术制药-课件第四章

▪ 二、生产用动物细胞的获得
▪ 用于生产的动物细胞主要有：原代细胞、 二倍体细胞系、可无限传代的异倍体转化 细胞系（Continuous Cell Line）、以及用 这些细胞进行融合和重组的工程细胞系 （genetially-engineered cell line）
▪ 1、原代细胞
▪ 是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、 消化而获得的细胞悬浮液。
▪ 它是一门应用科学和技术，是当今高新技 术—生物工程研究领域的重要组成部分。
▪ 2、细胞工程学的研究内容 ▪ ①真核生物的基因重组、导入、扩增和表达
的理论和技术； ▪ ②细胞融合的理论和技术； ▪ ③细胞器移植的理论的技术； ▪ ④染色体改造的理论和技术； ▪ ⑤转基因动、植物特性研究的理论和技术； ▪ ⑥细胞大规模培养的理论和技术； ▪ ⑦目的产物提取纯化的理论和技术
▪ 2、离体培养常需贴附于基质，并有接触抑 制（contact inhibition）现象
▪ （1）贴附生长：除少数悬浮培养的细胞外， 大多数正常二倍体（diploid）细胞的生长 都需在一定的基质（玻璃、塑料等）上贴 附，伸展后才能生长增殖。在无血清培养 基内由于不能合成贴附因子，不能实现贴 附生长。
▪源自文库获取上述所需细胞，除原代细胞需靠自己 临时用动物组织制备外，一般都可从各国 的细胞库或有关细胞研究机构的细胞保存 中心获取。
第四节 动物细胞的培养特性和 培养条件
▪ 一、动物细胞的培养特性 动物细胞培养过程中具有以下特性：
▪ 1、生长缓慢，易受杂菌污染，培养时需加 抗生素。
▪ 2、较微生物细胞大得多，无细胞壁，机械 强度低，适应环境能力差。
▪ （二）动物细胞的形态
▪ 动物细胞不是靠一个细胞包办一切生理活动， 各种细胞有明确的分工，相应有不同的形态。 这种随功能不同所产生的形态变化称分化。
▪ ①肌肉细胞成纺缍形，起收缩伸展的作用。
▪ ②神经细胞细长并有很长的分支和纤维，便 于接受和传递刺激。
▪ ③红细胞呈圆盘状，使与外界的接触面相 对增大，有利于与周围环境交换气体和在 血管内流动。
▪ ④组织培养和细胞培养：20世纪20年代 ~70年代，利用细胞培养生产疫苗，利用血 清和血浆体外培养动物细胞，使用培养基 体外无菌条件下培养细胞。
▪ ⑤细胞工程学：20世纪80年代至今。
▪ 二、组织培养或细胞培养
▪ 将组织或细胞从机体取出，在体外模拟机 体体内的生理条件进行培养，使之生存和 生长，以获得生物体株系或从中制备目的 产物。
▪ 贴壁培养时，细胞呈扁平的不规则的多角 形，生长时彼此紧密连接成单层细胞片。
▪ 上述形态不是绝对的，会随着培养条件的 变化而有所变化。
▪ 2、悬浮细胞（非贴壁依赖型）anchorage independent
▪ 生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈 悬浮状态生长，常呈圆形。如血液内的淋 巴细胞和产生干扰素的Namalwa细胞等。
▪ ②细胞学说的建立：19世纪中期，1838和 1839年，德国科学家Schleiden和Schwann 建立了细胞学说，是19世纪自然科学三大 发现之一。
▪ ③细胞的早期体外培养实验：19世纪末至 20世纪初，1885年~1907年，用生理盐水 培养鸡胚组织，用血清和血浆培养血液中 和结缔组织中的细胞，用淋巴液培养蛙神 经组织中的细胞。
▪ 3、兼性贴壁细胞
▪ 有些细胞并不严格地依赖支持物，即可以 贴附于支持物表面生长，还可以在培养基 中呈悬浮状态良好地生长，这类细胞称兼 性贴壁细胞。
▪ 在贴壁生长时呈上皮样或纤维样细胞的形 态，而悬浮生长时呈圆形。如：中国地鼠 卵巢细胞、小鼠L929细胞等。
▪ 二、动物细胞的生理特点
▪ 动物细胞的培养与微生物和植物细胞的培 养有很大不同，这是由动物细胞的生理和 生长特点决定的。
▪ 3、培养过程需氧量相对较少，不耐受强力 通风搅拌。
▪ 6、蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不 同
▪ 其蛋白质的合成除了在游离的核糖体上进 行外（用于细胞质基质内），还在与糙面 内质网上结合的核糖体上进行（分泌性的 和膜中的整合蛋白）。
▪ 蛋白质的糖基化在高尔基体内加接的是O链寡糖，在内质网中加接的是N-链寡糖。
▪ 原核生物由于缺少糙面内质网结构，无法 对蛋白质进行糖基化和其他一系列翻译后 修饰。
▪ ④上皮细胞相互挤压成不规则的立方形、 锤形等。
▪ 但这些分化的形态，当细胞离体培养时经 常会发生变化。
▪ （三）离体培养细胞的形态
▪ 1、贴壁细胞（贴壁依赖型）anchorage dependent:
▪ 这类细胞生长必须有给以贴附的支持物表 面，细胞依靠自身分泌的或培养基提供的 贴附因子才能在该表面上生长繁殖。
第四章 动物细胞制药
第一节 概述 ▪ 细胞是一切动、植物体的基本组成结构单
位。 ▪ 一、细胞培养的发展 ▪ 先后经历了细胞的发现、细胞学说的建立、
细胞的早期体外培养实验、组织培养和细 胞培养以及细胞工程学的建立等阶段。
▪ ①细胞的发现：1665年人类首先发现了细 胞。英国物理学家Hooke和荷兰科学家 Leeuwenhoek用自制显微镜首先发现了细 胞。
▪ 四、动物细胞在生物制药领域中的应用
▪ 细胞虽小，但组成结构精密、复杂，有着 巨大的生产效率，可生产许多维持机体生 命所需的产物。
▪ 许多基因产物不能在原核细胞内表达，需 要经真核细胞所特有的翻译后修饰，以及 正确的切割、折叠后，才能形成与自然分 子一样的功能和抗原性。
▪ 因此，动物细胞成为基因工程重要的宿主细胞， 以生产多种非常重要的生物制品。
▪ 当细胞在该表面生长后，一般形成两种形 态。
▪ ①纤维样细胞型
▪ 主要来源于中胚层组织的细胞（成纤维细 胞、心肌细胞、平滑肌细胞或成骨细胞 等）。
▪ 离体培养时，细胞呈梭形或不规则的三角 形，细胞群常连接成网，生长时呈放射状、 漩涡状或火焰状。
▪ ②上皮样细胞型
▪ 主要来源于外胚层和内胚层组织的细胞， 如皮肤、肠管和肺泡上皮细胞等。
▪ 自20世纪80年代以来，一大批用异倍体传 代细胞生产的产品被批准上市。
▪ 如：用Namalwa细胞生产的干扰素；用杂 交瘤细胞生产的单克隆抗体OKT3；用猴肾 异倍体传代细胞生产的狂犬疫苗等。
▪ 因基因重组的大量试验证明，DNA体外重 组率极低（10–9 ），体内由于存在大量胞 外核酸酶，外来的核酸更难被整合。
▪ （1）利用动物细胞培养病毒来生产疫苗：包括 乙肝疫苗、乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、狂犬 疫苗等。
▪ （2）淋巴因子：α、β和γ干扰素，1、2和6白 细胞介素。
▪ （3）酶原激活剂：纤维蛋白溶酶原激活剂 （ProUK），组织型纤溶酶原激活剂（t-PA） 等。
▪ （4）单克隆抗体：McAb
▪ （5）红细胞生成素：EPO
▪ 但在培养基中加入表皮生长因子，可使上 皮细胞的培养寿命从50代增至150代。
▪ ③当细胞经自然或人为的因素转化为异倍 体后，可转变成无限细胞系，或称连续细 胞系，此时细胞的寿命是无限的，更适合 工业化生产的需要。
▪ 4、动物细胞对周围环境十分敏感
▪ 动物细胞培养难度很大，对环境条件非常 敏感。
▪ 因其无细胞壁，仅有细胞膜，一切能影响 脂质和蛋白质分子变性的因素都会影响动 物细胞的存活。
▪ 对多种物理化学因素，如渗透压、pH、离 子强度、剪切力、微量元素等的变化耐受 力很弱。
▪ 5、对培养基要求高
▪ 不仅需要12种必需氨基酸，8种以上的维生 素，多种无机盐和微量元素，以及碳源葡 萄糖外，还需多种生长因子和贴壁因子。
▪ 1、细胞分裂周期长
▪ 动物细胞分裂所需时间一般为12~48h。不 仅随细胞种属的不同而不同，同一种属、 不同部位的细胞所需的时间也不同；
▪ 培养条件如温度、pH、培养基的成分等， 也会影响分裂周期的长短。
▪ 整个分裂周期 = 间期（G1期+S期+G2期） + 分裂期（M期）
▪ G1期：DNA合成前期。 ▪ S期：DNA合成期。 ▪ G2期：DNA合成后期。 ▪ 细胞分裂一次，即传代一次。
▪ （6）其它：第8因子、肿瘤坏死因子（TNF）、 蛋白C、粒细胞克隆刺激因子（G-CSF）、上皮 生长因子（EGF）及SOD等。
第二节 动物细胞的形态和生理特点
▪ 一、动物细胞的结构和形态 ▪ （一）动物细胞的结构 ▪ 动物细胞的结构较原核细胞复杂得多，无
细胞壁，有微管、微丝、微体、纤毛、伪 足、微绒毛、胞饮沟、由核膜延伸形成的 内质网、核糖体、高尔基体、线粒体、中 心粒、酶原粒、核膜、核仁等。
▪ 3、正常二倍体细胞生长寿命是有限的
▪ ①细胞离体培养开始，我们称为原代培养。 经传代后，即成为有限细胞系。
▪ 即使培养条件都很理想，有限细胞系也只 能生长有限时间，经若干代传代培养后将 逐渐死亡。
▪ ②该时间的长短取决于种属和年龄。
▪ 如：人成纤维细胞可培养50代，鸡胚成纤 维细胞可传代30代，小鼠成纤维细胞只能 培养8代。而且年龄越大，培养代数越少。
▪ 三、细胞工程学及其内容
▪ 1、细胞工程学（Cell engineering）: 以细 胞为单位，应用细胞生物学、分子生物学 等学科的理论和技术，按人们的意志改变 细胞的某些遗传特性，以达到改良或创造 新品种的目的，以及使细胞增加或获得产 生某种特定产物的能力，并通过在离体条 件下进行细胞的大量培养、增殖，并从中 提取对人类有用的产品。
▪ （2）接触抑制现象（contact inhibition）
▪ 当细胞贴附在基质上分裂增殖，逐渐汇合 成片时，即每个细胞与周围的细胞相互接 触时，细胞就停止增殖，若保持充足的营 养，细胞仍可存活相当一段时间，但密度 不再增加，该现象称之接触抑制或密度依 赖抑制现象。
▪ 若细胞转化为异倍体后，该现象随之消失， 细胞可多层生长，密度也可大大增加。
▪ 这种规定极大限制了细胞的来源和更大规 模生产的可能性，因二倍体细胞的寿命一 般都不会超过50代。
▪ 人们担心异倍体细胞的核酸会影响到人们 正常的染色体，而有致癌的危险。
▪ 2、近年来的规定
▪ ①取消了对异倍体传代细胞的限制；
▪ ②需参照美国食品与药品管理局FDA对细 胞株的要求，严格限制最终产品中残留的 DNA量。
▪ （1）自发的转化过程：正常细胞在传代过 程中，大部分细胞随着传代次数的增加寿 命逐渐终结，但其中有个别细胞可自发地 转化而形成有无限生命力的细胞系。这种 转化多发生在啮齿动物。
▪ （2）人为诱发
▪ 在细胞培养过程接入某些病毒（如SV40） 或加入某些化学试剂（如甲基胆蒽等）， 促进正常细胞转化成异倍体细胞系。
▪ 由于组织块内常有多种细胞组成，而真正 生产需要的只是其中的一小部分。因此， 用原代细胞来生产生物制品常需要大量的 动物，费钱费劳力。
▪ 常用的有鸡胚、兔肾或鼠肾原代细胞，以 及血液的淋巴细胞。
▪ 2、二倍体细胞系（有限细胞系）
▪ 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种 细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有 一定特征的细胞株。
▪ 该细胞仍具备“正常”细胞的特点。 ▪ ①它的染色体组型仍然是2n的核型。 ▪ ②具有明显的贴壁依赖和接触抑制的特性。 ▪ ③增殖能力有限，一般可连续传代50代。 ▪ ④无致癌性。 ▪ 一般从动物的胚胎组织中获取，广泛应用
的有WI-38、MRC-5、2BS等。
▪ 3、异倍体转化细胞系
▪ 这类细胞是通过某个转化过程，由于染色 体的断裂变成异倍体，从而失去了正常细 胞的特点，而获得了无限增殖能力。
第三节 生产用动物细胞的要求 和获得
▪ 一、生产用动物细胞的要求 ▪ 什么样的细胞允许用以生产人用的药品，这
是多年来人们争论的焦点。 ▪ 1、早期的生物制品法规定 ▪ ①只有从正常组织分离的原代细胞才能用来
生产生物制品，如鸡胚细胞、兔肾细胞。
▪ ②只要是二倍体细胞，即使经多次传代也 可用于生产。但非二倍体细胞是绝对禁止 使用的。
▪ （3）直接从动物的肿瘤组织中分离制备的 细胞系也是转化的细胞。
▪ 转化细胞系的特点： ▪ ①具有无限增殖能力； ▪ ②倍增的时间较短； ▪ ③对培养条件和生长因子等要求较低； ▪ ④更适于大规模工业化生产的需要。
▪ 近年来常用于生产的转化细胞系有： Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞等。