血红蛋白的提取与分离
血红蛋白的提取和分离 基础知识
第15课时血红蛋白的提取和分离1.归纳蛋白质多样性的原因(1)图甲说明：氨基酸的种类不同，构成的肽链不同。
(2)图乙说明：氨基酸的数目不同，构成的肽链不同。
(3)图丙说明：氨基酸的排列次序不同，构成的肽链不同。
(4)图丁说明：肽链的数目和空间结构不同，构成的蛋白质不同。
2.血液包括血细胞和血浆，血细胞又分为红细胞、白细胞和血小板，其中红细胞含有血红蛋白，使红细胞呈现红色。
3.红细胞放到低渗溶液中，会吸收水分，体积膨胀直至涨破。
课堂导入蛋白质是生命活动不可缺少的物质，随着基因组测序工作的完成，人们对蛋白质的研究和应用工作进入了新的时代，这就需要获得纯度较高的蛋白质。
因此对蛋白质的分离就是生物学研究中经常要做的工作，下面我们就以血红蛋白的提取和分离来学习有关蛋白质的一些基本技术。
探究点一蛋白质分离技术生物体内的蛋白质多种多样，按照科学的需要有时要把它们分开，分离蛋白质常使用的方法是凝胶色谱法和电泳法，都是根据不同蛋白质分子的之间的差异来分离的。
1.蛋白质特性的差异(1)分子的形状和大小；(2)所带电荷的性质和多少；(3)溶解度；(4)吸附性质；(5)对其他分子的亲和力。
2.分离的方法(1)凝胶色谱法Ⅰ.概念：凝胶色谱法，也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
Ⅱ.凝胶：是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的，内含许多贯穿通道，具有多孔的凝胶又称为分子筛。
Ⅲ.凝胶色谱法分离蛋白质的原理(如图A)①蛋白质混合物上柱；②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外；③相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动；④相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开；⑤相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。
(2)电泳①概念：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
高中生物 5.3血红蛋白的提取和分离课件 新人教版选修1
4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
知识总结
血 蛋白质分子的差异性
红
蛋 凝胶色谱法 白 凝胶电泳法 的
原理
提
缓冲溶液
取
组成
和 分
蛋白质的
样品处理
离
提取分离
纯度鉴定
分离过程 作用 粗分离 纯化
【学习力-学习方法】
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血红蛋白的提取与分离(上课用)
蒸馏水
(2)血红蛋白的释放（使用蒸馏水和甲苯）
磁力搅拌器
搅拌器转子
搅拌器正在工作
(3)、分离血红蛋白溶液：
将搅拌好混合液转移到离心管内， 以2000r/min的速度离心10 min ，试 管中的溶液分为4层:
3、高温灭菌和酒精灭菌分别对蛋白
质有何种影响，作用结果是什么被破 坏？ 变性、变性、空间结构
羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
4.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA， 便于进行DNA的提取；哺乳动物的成熟 的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋 白含量丰富，便于提取血红蛋白。
(4)透析(粗分离)：
利用透析袋透析
取( 1 )ml的血红蛋白溶液装入 透析袋 （ ）中，将透析袋放入 盛有300ml的物质的量浓度为 20mmol/L（磷酸缓冲液 ）中， pH为（ ），透析12小 7.0 时.
目的是（ 除去样品中分子量较小的杂质 ） 或用于更换样品中的（ 缓冲液 ）。 说明：透析袋是一种半透膜，能使小 分子自由进出，而大分 子不能通过。
四川省南部中学
马彦平
2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成 这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代 人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传 信息
蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。 主要是对蛋白质功能的研究
本课题学习目标
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液
④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。
底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的 凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液 体残留，蛋白质分离不彻底。 c.剪尼龙网小圆片覆盖在( 橡皮塞的凹面）上，用 （ 100目 ）的尼龙纱将橡皮塞（ 上部 ）包好， 插到玻璃管一端。 出口部位），连接 d、色谱柱下端用移液头部做（ 一细的（ 尼龙管 ）， 并用螺旋夹控制尼龙管的 （ 打开与关闭 ），另一端 放入收集（ 色谱流出液 ） 的收集器内
血红蛋白的分离和提取
血红蛋白的分离和提取血红蛋白是一种存在于红细胞中的重要蛋白质，它负责运输氧气到身体的各个部位。
对于血红蛋白的分离和提取，无论是在医学研究、疾病诊断还是生物技术领域，都具有重要的意义。
要进行血红蛋白的分离和提取，首先需要了解它的基本性质。
血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，相对分子质量约为 64500，等电点在 7 左右。
准备工作是必不可少的。
我们需要新鲜的血液样本，通常可以从健康的志愿者或者实验动物身上获取。
采集到血液后，要尽快进行处理，以防止血红蛋白的变性和降解。
第一步是红细胞的分离。
将采集到的血液加入抗凝剂，如肝素或柠檬酸钠，然后通过离心的方法，将红细胞从血浆中分离出来。
离心的速度和时间需要根据具体情况进行调整，一般来说，以较低的转速离心一段时间，就可以使红细胞沉淀在离心管的底部。
得到红细胞后，接下来就是裂解红细胞以释放出血红蛋白。
常用的方法是低渗裂解法，将红细胞置于低渗溶液中，如蒸馏水，红细胞会因为吸水而膨胀破裂，释放出其中的内容物，包括血红蛋白。
然后是去除杂质。
裂解后的溶液中含有大量的其他细胞成分和杂质，需要通过过滤、离心等方法进行去除。
例如，可以再次离心，使较大的细胞碎片沉淀下来，然后取上清液。
接下来就是血红蛋白的初步分离。
常用的方法有盐析法。
向溶液中逐渐加入适量的中性盐，如硫酸铵，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度会逐渐降低而沉淀出来。
不同的蛋白质在不同的盐浓度下沉淀，通过控制盐的浓度，可以初步分离出血红蛋白。
经过初步分离后，还需要进一步的纯化。
层析法是常用的手段之一。
比如凝胶过滤层析，根据蛋白质分子大小的不同进行分离；离子交换层析，依据蛋白质的带电性质差异来分离。
在分离和提取的过程中，要始终注意保持适当的温度、pH 值等条件。
温度过高或过低、pH 值不适宜都可能导致血红蛋白的变性和失活。
另外，实验过程中的操作要规范、细致，尽量减少人为因素造成的误差和损失。
例如，在转移溶液时要避免洒出，使用的仪器要经过严格的清洗和消毒。
血红蛋白提取和分离的四步
血红蛋白提取和分离的四步血红蛋白是存在于人类血液中的一种重要蛋白质，它承担着将氧气从肺部输送到身体各个组织和器官的重要功能。
因此，对血红蛋白的提取和分离具有重要的生物学意义和医学应用前景。
接下来将介绍血红蛋白提取和分离的四个步骤。
第一步：血样采集首先需要采集含有血红蛋白的血样。
一般来说，静脉采血是最常用的方法。
在采集血样之前，需要确保采血器具干净无菌，以避免外部微生物的污染。
同时，还要确保采集到的血样足够新鲜，以保证血红蛋白的活性和稳定性。
第二步：红细胞裂解将采集到的血样进行红细胞裂解，将红细胞膜破坏，释放血红蛋白。
一般可以使用生理盐水等溶液进行红细胞裂解。
在裂解的过程中，需要注意温度和pH值的控制，以确保血红蛋白的完整性和稳定性。
第三步：血红蛋白提取在红细胞裂解后，血液中的血红蛋白被释放出来，需要进行进一步的提取。
常用的提取方法包括离心、凝胶过滤、离子交换层析等。
通过这些方法，可以将血红蛋白从其他蛋白质和杂质中分离出来，得到比较纯净的血红蛋白样品。
第四步：血红蛋白分离最后一步是对提取到的血红蛋白进行分离。
根据血红蛋白的性质和不同的应用需求，可以选择不同的分离方法。
例如，可以利用凝胶电泳、高效液相色谱等技术对血红蛋白进行分离和纯化。
通过这些方法，可以得到高纯度的血红蛋白样品，为后续的研究和应用提供基础。
通过以上四个步骤，我们可以完成血红蛋白的提取和分离工作。
这些工作不仅有助于深入了解血红蛋白的生物学功能和结构特性，还为相关疾病的诊断和治疗提供了重要的基础。
希望在未来的研究中，可以进一步完善血红蛋白提取和分离的技术，为人类健康事业做出更大的贡献。
新人教版生物选修1课题3《血红蛋白的提取和分离》优秀教案(重点资料).doc
课题：血红蛋白的提取和分离教学目标：1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理教学重点：凝胶色谱法的原理和方法教学难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填教学过程：（一）引入新课蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。
对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。
所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。
怎样提取蛋白质呢？（二）进行新课1．基础知识蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：（见课件图）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
[（3）分离过程：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
1．2缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC －NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
1．3凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同［思考］阅读投影补充材料后，填写下表：（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。
（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
2．实验设计2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。
血红蛋白的分离和提取
细胞为材料，学习初步分离血红蛋白的方法。
样品处理及粗分离1.红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。
采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500 r/min离心2 min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液），缓慢搅拌10 min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。
❖为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠，比例是每100mL血液加入3.0g柠檬酸钠。
2.血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。
在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
3.分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的溶液分为4层（图5-18）。
从上往下数，第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。
将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
4.透析取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0)，透析12h。
❖透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的。
透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
凝胶色谱操作可以自己制作色谱柱，有条件的学校也可以直接购买商品色谱柱。
1.凝胶色谱柱的制作取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端磨平。
柱底部的制作方法如下（图5-19）。
首先选择适合封堵玻璃管口的橡皮塞，中间打孔，孔径大小要能够紧密插入0.5 mL的移液管。
高中生物人教版选修一血红蛋白的提取和分离
【一题多变】 1．图中的两个分子所带的电荷是正电荷还是负电荷？为什
么？ 答案 负电荷，因为它们移向了阴极一端。 2．除了本题中的聚丙烯酰胺凝胶电泳外，常用的电泳方法 还有哪种？ 答案 琼脂糖凝胶电泳。
二、血红蛋白的提取和分离实验操作 1．样品的处理
(1)红细胞的洗涤 ①目的：去除杂蛋白。 ②方法 a．采集血样→b.低速短时间离心→c.吸取血浆→d.盐水洗 涤→e.低速离心→重复d、e步骤三次。
(3)作用 电泳利用了待分离样品中各种分子 带电性质 的差异及分子本 身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的 迁移速度， 从而实现样品中 各种分子的分离 。 (4)方法 常用的电泳方法有 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 测定蛋白质分子量时通常使用 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 。
二、 血红蛋白提取和分离的实验操作与评价 1．蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、
2．凝胶色谱操作
3．纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度 的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺 凝胶电泳。
4．结果分析与评价
项目
分析
①分层明显→样品处理完成
血液样 品的处
理
②分层不明 显的原因
洗涤次数少，未能 除去血浆蛋白 离心速度过高或 时间过长
(2)原理 ①由多孔球体 构成的凝胶，内部有许多贯穿的 通道 。 ②当 相对分子质量 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质 量 较小 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 较长，移 动速度 较慢 ，而相对分子质量 较大 的蛋白质无法进入凝胶 内部的通道，只能在 凝胶外部移动，路程 较短 ，移动速度 较快 ，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以 分离。
血红蛋白的分离和提取
血红蛋白的分离和提取血红蛋白是人体内一种极其重要的蛋白质，负责运输氧气到身体的各个部位。
对血红蛋白的分离和提取，不仅有助于我们深入了解其结构和功能，还在医学诊断、疾病研究以及生物制药等领域具有重要意义。
要进行血红蛋白的分离和提取，首先得准备好相应的材料和试剂。
新鲜的血液是必不可少的，通常可以从健康的志愿者或动物身上获取。
此外，还需要一系列的化学试剂，如磷酸盐缓冲液、生理盐水、抗凝剂等等，以及各种实验仪器，如离心机、分光光度计、电泳设备等。
在实际操作中，第一步是采集血液样本。
为了防止血液凝固，需要在采集过程中加入适当的抗凝剂。
采集后的血液要尽快进行处理，以保证血红蛋白的活性和完整性。
接下来就是红细胞的分离。
这通常通过离心的方法实现。
将采集到的血液放入离心机中，以适当的转速和时间进行离心。
由于红细胞的密度较大，会沉淀在离心管的底部，而上层则是血浆和白细胞等成分。
小心地吸取上层液体，留下沉淀的红细胞。
然后，对红细胞进行裂解，以释放出其中的血红蛋白。
这可以通过加入低渗溶液来实现。
低渗溶液会使红细胞的细胞膜破裂，从而释放出细胞内的物质，包括血红蛋白。
裂解后的混合物中含有大量的杂质，需要进一步的纯化处理。
纯化血红蛋白的方法有多种，常见的有盐析法、凝胶过滤法和离子交换层析法等。
盐析法是利用不同蛋白质在不同盐浓度下溶解度的差异，来分离和纯化蛋白质。
在血红蛋白的纯化中，可以逐渐增加盐的浓度，使其他杂质蛋白沉淀，而血红蛋白则留在溶液中。
凝胶过滤法是根据蛋白质分子大小的不同来进行分离的。
将裂解后的混合物通过装有特定凝胶的层析柱，大分子的蛋白质先被洗脱出来，小分子的则后洗脱，从而实现血红蛋白与其他小分子杂质的分离。
离子交换层析法则是基于蛋白质的带电性质进行分离。
选择合适的离子交换树脂，使血红蛋白能够与树脂结合，而其他杂质蛋白则不结合或结合较弱。
通过改变洗脱液的离子强度或 pH 值，将血红蛋白洗脱下来，达到纯化的目的。
在整个分离和提取过程中，每一步操作都需要严格控制条件，如温度、pH 值、离子强度等，以确保血红蛋白的活性和纯度。
血红蛋白的分离和提取
02
血红蛋白分离和提取的方 法
离心法
要点一
总结词
离心法是一种利用离心力分离不同密度物质的方法，常用 于血红蛋白的分离和提取。
要点二
详细描述
离心法的基本原理是利用不同物质在离心场中的沉降速度 不同而实现分离。在血红蛋白的分离中，通常将红细胞悬 浮液置于离心管中，在高速离心机中以一定速度旋转，红 细胞由于密度较大而沉降到底部，上清液即为去除了红细 胞的血浆，而红细胞中包含大量的血红蛋白，因此通过离 心法可以获得较为纯净的血红蛋白。
子交换剂表面的离子进行可逆交换，从而实现血红蛋白与其他杂质的分离。
亲和层析法
• 总结词：亲和层析法是一种利用生物分子间的特异性亲和力进行分离的
方法，常用于血红蛋白的分离和提取。
• 详细描述：亲和层析法的原理是利用生物分子间的特异性亲和力将目标分子吸附在固定相上，通过改变洗脱液的组成将 目标分子从固定相上洗脱下来而实现分离。在血红蛋白的分离中，常用的亲和层析方法为铁结合亲和层析和珠蛋白亲和 层析。铁结合亲和层析是利用血红蛋白与铁离子之间的特异性亲和力将血红蛋白吸附在固定相上，通过改变洗脱液的组 成将血红蛋白从固定相上洗脱下来。珠蛋白亲和层析是利用珠蛋白与血红蛋白之间的特异性亲和力将血红蛋白吸附在固 定相上，通过改变洗脱液的组成将血红蛋白从固定相上洗脱下来。
血红蛋白具有低免疫原性和良好的携氧能力，可以作为药物载体用于药物传递和靶向治疗，提高药物的疗效和降 低副作用。
血红蛋白在生物材料中的应用
血红蛋白作为一种生物材料，具有优良的生物相容性和可降解性，可以用于制备人工器官、组织工程和生物材料 等。
05
血红蛋白分离和提取的展 望
新技术的研发和应用
01
02
血红蛋白的提取与分离
②血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶
色谱分离时可以通过观察颜色来判断
什么时候应该收集洗脱液。这使血红
蛋白的分离过程非常直观，大大简化
了实验操作。
•1.洗涤目的：去 红细胞的洗涤 杂蛋白 除 ，利于后 或血浆蛋白 2.洗涤方法 续步骤的分离纯化。
采用低速短时间离心，如 500 用 胶头吸管 r／min,离心 2 min，然后
离 心 管 中 ， 以 2000 r ／
min的速度离心10min后，
可以明显看到试管中的溶
液分为4层：
高速长时间离心
第4层：红细胞破碎物沉淀 层（暗红色）
用 滤纸 过滤除去脂溶性 沉淀层，于 分液 漏斗中
静置片刻后，分出下层 的 红色 透明液体。
粗分离
--透析（去除分子质量较
小
的杂质）
取1mL的血红蛋白溶液装入 透 （pH为7.0 ）透析12 h。
A. 它们都是分离蛋白质的重要方法 B. 它们的原理相同不同
)
C. 使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要 都需要使用缓冲溶液维持PH D. 以上说法都正确
实验步骤
蛋白质的提取和分离一般分为四步：
样品处理
红细胞的洗涤 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液
透析—去除样品中分子量较小的杂质
粗分离
纯化 用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质
合物，SDS所带负电荷的量大大超过蛋白质分子原有的
电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳
迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。
例题5.下列各项中不属于电泳使样品中各分子分离的
原因的是( D )
A.分子带电性质的差异
B.分子的大小 C.分子的形状 D.分子的变性温度
血红蛋白的提取与分离
解决方案：开发新 型分离纯化技术， 提高分离纯度和收 率，降低成本
发展趋势：利用基 因工程技术改造血 红蛋白，提高其稳 定性和功能性
未来展望：血红蛋白 提取与分离技术将更 加成熟和高效，为生 物医学领域的发展提 供有力支持
技术改进：不断优 化提取和分离技术， 提高血红蛋白的纯 度和产量。
新技术的应用：利用 新兴技术如基因工程、 蛋白质工程等，实现 血红蛋白的定向生产 和分离纯化。
高效液相色谱法：结合了经典液相色谱和气相色谱的原理，利用吸附、分配、离子交换等原理进行分离
分离纯化的目的：去除杂质，获得高纯度的血红蛋白
分离纯化的原理：利用不同物质在介质中的溶解度、吸附性、渗透压等性质进行分离
分离纯化的方法：包括沉淀法、色谱法、电泳法等 分离纯化的流程：包括粗分离、纯化、精制等步骤
添加标题
血红蛋白的分离纯化：通过分 离纯化技术，可以从生物样本 中提取出高纯度的血红蛋白， 用于生物医学研究和治疗。
添加标题
血红蛋白在药物输送方面的应用： 血红蛋白可以作为药物输送载体， 将药物输送到病变部位，提高药 物的疗效并降低副作用。
添加标题
血红蛋白在血液替代品方面的应 用：血红蛋白可以作为血液替代 品，用于输血治疗，缓解血液短 缺问题，并避免异体输血可能引 发的免疫反应。
血红蛋白在医疗领域的应用：血红蛋白具有携氧能力，可用于治疗某些缺氧性疾病， 如贫血和心脑血管疾病。
血红蛋白在生物工程领域的应用：血红蛋白可作为生物催化剂，用于加速化学反应， 具有高效、环保的优点。
血红蛋白在食品工业领域的应用：血红蛋白可用于生产新型食品，如血红蛋白饮料、 血红蛋白面包等，具有营养价值和保健功能。
拓展应用领域：不 仅局限于医学领域 ，还将应用于生物 工程、制药等领域 。
5.3血红蛋白的提取和分离
分离、纯化生物大分子
大分子：分子量达上万或更多的有机生物活性分子 分离：将混杂的各物质通过物理或化学方法分成几种纯净物 纯化：除去物质中混有的杂质（不需要的）
分离纯化生物大分子方法
分离依据
具体方法
分子大小（相对分 1.凝胶色谱法（柱层析） 子质量）和形态 2.差速离心法（分离各种细胞器）
3.密度梯度离心法（分离不同密度物 质，如14N、15N标记的DNA） 4.透析法、 5.分子筛……
与CO结合 比O2与血红蛋白结合能力强270倍
背景知识：血红蛋白
1.概念：红细胞内负责运输O2和CO2的特殊红色蛋白质，英文缩写Hb。 2.血红蛋白的结构：2条α-肽链 2条β-肽链 亚铁血红素 3.血红蛋白的功能： ·运输作用 O2 CO2 CO ·结构作用：组成人和其他脊柱动物红细胞的主要成分（结构蛋白）
（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：
结果分析: • 测定的只是单个亚基或肽链的相对分子质量，而不是完整分子的
相对分子质量；
• 要测定蛋白质真正的相对分子质量，应与其他测定蛋白质相对分 子质量的方法加以校正。
五、 凝胶电泳法
常见种类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
分类 琼脂糖 凝胶电 泳
SDS-聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳
总结思考：
1、凝胶色谱法原理？ 2、缓冲溶液作用？ 3、电泳原理？
小分子流动慢 大分子流动快
先收集 大分子
后收集 小分子
5.结果：洗脱曲线
横轴：洗脱液体积； 纵轴：分子浓度 按照分子大小洗脱：大分子先洗脱下来，小分子后洗脱下来
思考： 在血红蛋白的提取分离实验中用的磷酸缓冲液（PBS)的目的？
利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血 红蛋白的正常结构和功能。便于观察（红 色）和进行材料的科学研究（活性）。
血红蛋白的提取和分离
本课题学习要点和难点
体验从复杂体系中提取生物大分子旳基本过 程和措施，并了解色谱法、电泳法等分离生 物大分子旳基本原理。
3、课题要点：凝胶色谱法旳原理和措施 4、课题难点：
①样品旳预处理 ②色谱柱填料旳处理和色谱柱旳装填。
2023年4月14日宣告人类基因组序列图完毕，这标志着进入了后基因组和蛋 白质组时代
2、你装填旳凝胶色谱柱是否有气泡产生？你旳色谱 柱装填得成功吗？你是怎样判断旳？
因为凝胶是一种半透明旳介质，所以能够在凝胶柱旁放一支与 凝胶柱垂直旳日光灯，检验凝胶是否装填得均匀。另外，还能够 加入大分子旳有色物质，例如蓝色葡聚糖—2023或红色葡聚糖， 观察色带移动旳情况。假如色带均匀、狭窄、平整，阐明凝胶色 谱柱旳性能良好。假如色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体 以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
血红蛋白的提取和分 离
本课题学习目的
体验从复杂体系中提取生物大分子旳基本过 程和措施，并了解色谱法、电泳法等分离生 物大分子旳基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④ 它们在血红蛋白旳提取中分别起到什么作用。
2. 主要原理：
①凝胶色谱法分离蛋白质旳原理
②电泳法分离样品旳原理
③缓冲溶液旳构成和作用机理
④洗脱：小心加入pH=7.0 旳20mmol/l旳磷酸缓冲液到合 适高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤搜集：待红色旳蛋白质接近色谱柱底端时，用试管搜集流 出液，每5ml搜集一试管，连续搜集。（在分离过程中，假如 红色区带均匀一致旳移动，阐明色谱柱制作成功）
⑥注意：正确旳加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、 贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁围绕移动。
装配好旳凝胶柱
shagnke血红蛋白的提取与分离
影响蛋白质分子运动速度的因素 3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。
在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负 电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移 速率仅取决于分子大小。
二、实验操作－－实验步骤 样品处理 血液组成成分 粗 分 离 纯 化 3.分离血红蛋白 纯度鉴定 4.透析血红蛋白
（2）材料 多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 1.凝胶色谱法 （3）分离过程 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
二、缓冲溶液
1.作用: 在一定范围内，能够抵制 外界的酸和碱 对溶
红素基团，此基团可携带 一分子氧或一分子二氧化 碳，血红蛋白因含有血红 素而呈红色。
血红蛋白的特性是：在氧含量高的地方，容易与氧结合；在氧 含量低的地方，又容易与氧分离。血红蛋白的这一特性，使红 细胞具有运输氧的功能。
血液组成成分
1.洗 涤 红 细 胞 阅读思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤过程： 吸出血浆 5倍体积生理盐水 3g柠檬酸钠
2.配制: 通常由 1~2 种缓冲剂 溶解于水中配制而成。
NaH2PO4 /Na2HPO4
H2CO3 /NaHCO3
三、 电泳---血红蛋白的分离鉴定方法
带电粒子在 电场作用下发生 迁移 的过程。 1.概念：
2.原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都
具有可解离 的基团，在一定的PH下，这些基团会带 上正电 或 负电 。在电场的作用下，这些带电分子 会向着的 与其所带电荷相反 的电极移动。电泳利用 了待分离样品中各种分子 带电性质的差异 以及分子 本身的 大小 、 形状 的不同，使带电分子产生不同 的迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。
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液 血细胞（红细胞）
血红 蛋白
两个a－肽链
（ 90％ ）
两个β一肽链 共四条肽链
血红蛋白的组成
β
β
α
α
血红素基因
可携带一分子 O2或一分子CO2
2、方法：凝胶色谱法、电泳法 3、过程
样品处理—粗分离—纯化—纯度鉴定
（1）样品处理 ①洗涤红细胞
3g柠檬酸钠
血液 100mL
低速离心 2 min
吸出血浆
蛋白质的分离纯化
一.原理： 根据蛋白质之间以及蛋白质与其
他物质之间在分子大小、溶解度、所 带电荷的多少、吸附性等方面存在的 差异进行
二.方法：
离心沉降法、透析法、凝胶色谱 法（常用）、电泳法（常用）
三. 离心沉降法 a.目的：分离分子大小、密度不同的 蛋白质
b.原理：蛋白质分子大小、密度不同
四.透析法：
品中相对分子
质量较小的杂
质
1mL
11mmLL 20mmol/L磷酸缓冲液
透析时间：12h
（3）纯化：
方法：凝胶色谱法
目的：根据蛋白质的相对分子质量 大小去除杂质蛋白
过程： 凝胶的制备 凝胶色谱柱的装填 样品的加入和洗脱
1. 色谱装填，柱内不能有气泡（气泡会搅乱 洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果） ；装完后，立即用磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶， 使凝胶装填紧密；成功标志是红色区带均匀一 致移动 。
③分离血红蛋白 目的：使血红蛋白和其它杂质分离开 方法：离心（红细胞混合液 2000r/min 10min）
红细幻幻灯片 21灯片
2110min
滤纸
过滤 离心管
烧杯
有机溶剂 血红蛋白
第1层（最上层）：
（无色透明）甲苯层
第2层（中上层）：
（ 脂溶性物质 ）的沉淀层，
（白 ）色薄层固体
c. 影响蛋白质分子运动速度的因素
决定 运动方向 电荷性质 √ 电荷量 分子形状 分子大小
电场 作用力
√
形成
决定
阻力 运动速率
√
√
√
√
√
d、类型：
琼脂糖凝胶电泳（分子带电性质差 异、分子大小；）
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（分子 的大小；消除了净电荷的影响）
七.血红蛋白的分离
1. 材料
血浆 血浆蛋白 血
5倍体积生理盐水
血浆 红细胞
红细胞
搅拌10min
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
目的：去除杂质蛋白 方法：低速短时间离心
标志：上清液没有黄色
②释放血红蛋白 目的：使红细胞吸水破裂、释放出血红蛋 白
方法：红细胞+蒸馏水、甲苯 —搅拌
1. 蒸馏水__使__红__细__胞__大__量__吸__水__胀__裂_____。 2. 甲苯___溶___解__红__细__胞___的__细__胞___膜______。 3. 搅拌___加__速__红___细__胞__的___破__裂_________。
电量远超蛋白质分子原有的负电荷
迁移率：取决于蛋白质分子的大小， 不受蛋白质原有电荷和形状的影响
优点：灵敏度较高，消除了静电 荷对迁移率的影响，使电泳迁移 率完全取决于分子的大小
（聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率 取决于所带的净电荷、分子的大 小和形状）
离心管
第3层（中下层）： （血红蛋白）的水溶液层 （红色透明）的液体
第4层（最下层）： 其它杂质（ 暗红色 ）的沉淀层
用滤纸过滤， 除去脂溶性沉 淀层，于分液 漏斗中静置片 刻后，分出下 层的红色透明 液体（血红蛋 白溶液）。
（2）粗分离 方法：透析法
透析袋一般用硝 酸纤维制成，又称 玻璃纸。
目的：除去样
a.目的：除去相对分子质量较小的杂质
b.原理：蛋白质分子不能通过半透膜，小 分子化合物可自由进出
醋酸纤维 制成—— 磷酸缓冲液--（PH=7）
小分子杂质（无机盐、单糖、二糖及氨基酸 等）从透析袋中出来，而蛋白质留在袋内。
五.凝胶色谱法：
a.目的：分离相对分子质量的大小不同的 蛋白质 b.原理：相对分子质量较小的蛋白质可以 进入凝胶内部的通道，洗脱路程较长，移 动速度较慢，后流出；而相对分子质量较 大的蛋白质不能进入凝胶内部的通道，只 能在凝胶外部移动，洗脱路程较短，移动 速度较快，先流出
六、电泳法：
a.目的：分离带电性质有差异、分子大 小、形状不同的蛋白质
b.原理：
在一定的pH下，蛋白质分子的某些基 团解离后带上正电或负电。在电场的作用 下，带电分子会向着与其所带电荷相反的 电极移动。
由于各蛋白质分子带电性质的差异以 及分子的大小、形状不同，使带电分子迁 移速度不同，从而实现各种分子的分离。
材料：
交联葡聚糖凝胶G-75 ：G—凝胶的交联程度， 膨胀程度及分离范围；75—凝胶得水值（每克 凝胶膨胀时吸水7.5g）
20mmol/L磷酸缓冲液：保持体外PH与体内一致
2.样品的加入和洗脱
①不要触及破坏凝胶面 ②贴壁加样 ③使吸管管口沿管壁环绕移动
②加透析样品
（4）纯度鉴定
方法：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS使蛋白质—SDS复合物带