第8章-2-兽药残留分析

由于四环素类抗生素易于和金属离子鳌合，为避免待测物在过固
相萃取柱时的潜在损失，一般先采用 EDTA 对反相固相萃取柱进 行预处理。
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• 2.液-液分配 • 可通过将待测化合物从水相转移到不互溶的有机相而直接去除基 质成分。 • 存在问题：四环素类化合物由于极性太强，在任何 pH 值都不能被 定量转移入不互溶的有机相。 • 当采用四丁基铵盐作为离子对试剂时，在 pH8.2 条件下采用二氯 甲烷提取土霉素和四环素的回收率超过 85 ％。
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• 强酸或酸性脱蛋白剂非常适合用来降低四环素类化合物与蛋白质 的键合作用，但在强酸性条件下四环素类抗生素易降解为脱水产 物。 • pH4 .0 的琥珀酸盐缓冲液、酸性乙睛和酸性甲醇都被成功应用于 四环素类抗生素的提取。
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• （二）样品净化 • 在样品提取步骤获得的水相或有机相样品提取液中待测四环素类 抗生素的浓度可能非常低，而且还可能含有共提取物。如果样品 的最终溶液中含有共提取物，会增加检测器的背景噪声，难以检 测痕量浓度水平的待测物质。为减少干扰和浓缩待测化合物，初 始样品提取液需要采用进一步的净化步骤，如液一液分配、固相 萃取、超滤、免疫亲和色谱或在线微量富集技术。
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• 3 、 超 剂 量 、 超 范 围 （ 对 象 ） 用 药
4.不遵守有关标签的规定
二、兽药残留的危害
• 1. 对 人 体 产 生 直 接 毒 1）急、慢性毒性 2）激素样作用 3 ） 过 敏 2.对人类胃肠道微生物平衡产生破坏 3.增强人类病原菌的耐药性 4.环境危害 • 性 作 用
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• 2.酶联免疫法 • 间接酶联免疫法可用来检测牛奶中的四环素类抗生素。 • 四环素-牛血清白蛋白共轭物用于抗体制备，同源的四环素- β -酪 蛋白共轭物作为包埋试剂，而羊抗兔 IgG-辣根过氧化物酶作为第 二抗体。 • 牛奶样品经离心脱脂，采用磷酸盐缓冲液至少以 1 :30 的比例进行 稀释后，直接采用酶联免疫法进行测定，检测限可达 5 ug / kg 。
四环素类药物
• 金霉素、土霉素和去甲基金霉素是 3 种由微生物自然产生的四环 素类药物，已经被成功地从真菌中分离出来； • 其他如强力霉素、甲烯土霉素、二甲胺四环素、毗甲四环素及四 环素则是通过半合成法制备的
二、四环素类抗生素的毒性及其代谢
• 四环素类药物为广谱抗生素，是相互关系密切的抑菌性抗生素， 抗菌谱和毒性相似，对多种α-溶血性链球菌、非溶血性链球菌、革 兰阴性杆菌、立克次体、螺旋体、支原体属和衣原体属均有效。
第8章 兽药残留
分析
一、兽药定义及兽药残留来源
• （一）兽药定义 • 1.兽药 • 是指用于预防、治疗、诊断动物疾病或者有目的地调节动物生理 机能的物质（含药物饲料添加剂），主要包括：血清制品、疫苗、 诊断制品、中药材、中成药，化学药品、抗生素、生化药品、放 射性药品、外用杀虫剂、消毒剂等。
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• 蜡状芽抱杆菌 ATCC 11778 是一种经典的用于分析四环素类的微 生物，其对金霉素的灵敏度为 0.005mg / L ，对四环素和土霉素的 灵敏度为 0.025mg / L ， 对 二 甲 胺 四 环 素 的 灵 敏 度 为 0.001~0.002mg / L 。 • 相对于其他分析方法，微生物抑制法操作简便、价格低廉、不需 要精密仪器和复杂的样品前处理过程，因而适合大量样品的筛选。 • 微生物抑制法的最大缺点是不能区分具体的四环素种类，因此也 难以进行定量检测。
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• 为避免形成金属鳌合物和在反向 LC 色谱柱上的吸附，在反向 LC 中，优化流动相的组成是四环素类抗生素残留检测的重要方法之 一。 • 通常在流动相中加入酸（如磷酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、 EDTA 等）、有机改性剂（甲醇、乙睛等）、离子对试剂掩蔽剂等，并 以加草酸为多数。
第二节 大环内酯类抗生素
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• 由于四环素类药物普遍为低亲脂性，因此在脂肪中检测不到四环 素类药物残留。 • 相反，由于四环素类抗生素对钙具有亲和性，能在家禽、猪、牛 以及鱼类的骨骼组织中蓄积。
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（二）四环素类抗生素的毒性与最大残留限量 四环素类抗生素口服吸收良好，分布广泛，易在骨骼和牙齿中沉积； 可在肝脏中富集，造成肝损害。
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• 4.高效液相色谱法 • 反向 LC 操作简单、方法灵活，已成为包括四环素类抗生素在内的 许多药物残留检测的主要分析手段。普遍使用的硅胶基反向键合 固定相表面存在残存的硅醇基或金属离子（如 Fe
3 ＋，A1 3 +
)，
而四环素类抗生素易与金属离子鳌合，反向柱残存的硅醇基与四 环素类抗生素可以通过氢键或离子交换作用，因此导致色谱峰拖 尾，保留值不稳定或过长，出现峰形异常和分离度下降。
三、四环素类兽药残留样品前处理
• （一）样品提取 • 由于四环素类抗生素的强极性性质，在生物样品中易与蛋白质形 成共轭物而提取困难。稀无机酸可将四环素类化合物与蛋白质分 离，但四环素类化合物一旦进入水相，由于其在有机相的分配系 数较低，再将其提取入易挥发的有机相进行浓缩和净化就变得困 难了。
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四、抗生素类兽药
• 抗生素是由细菌、真菌或其他微生物在生活过程中所产生的物质， 具有抑制或杀灭细菌、真菌、螺旋体、支原体、依原体等致病微 生物的作用。 • 抗生素是能抵抗致病微生物的药物，是抗菌消炎药中最大的一类。
市场上有售的常用的品种：
抗生素类药物广泛地应用于各种感染性疾病，其品种繁多。

1. 四环素类 2. 大环内酯类 3. β-内酰胺类 4. 氨基糖甙类 5. 氯霉素类
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• 当采用商业化试剂盒检测蜂蜜中的四环素、金霉素和土霉素残留 时发现其对金霉素具有强烈的交叉反应活性。试剂盒对四环素和 金霉素的检测限均为 15 ug / kg ，但由于所用抗体与土霉素的交叉 反应活性较低，对土霉素的检测限为 250 u g / kg ． • 实验表明，空白蜂蜜样品经缓冲液稀释 50 倍已足以消除基质干扰。
第一节 四 环素类
• 一、四环素类化合物的 结构和性质 • 四环素类抗生素（TCs） 具有共同的基本母核 （氢化并四苯环），仅 取代基有所不同。
常见的四环素类药物
• 包括：四环素（TC ）、土霉素（ OTC ）、金霉素（ CTC ）、强 力 霉 素 （ DC ） 、 二 甲 胺 四 环 素 （ MINO ） 、 甲 烯 土 霉 素 （MTC ）、去甲基金霉素（DMCTC ）和毗甲四环素（PRMTC ） 等
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• （三）四环素类兽药的分析 • 四环素类抗生素残留的测定方法主要包括微生物抑制法、 酶联免 疫法、分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱一 质谱法等。样品经过提取和净化后，四环素类抗生素可通过薄层 色谱或液相色谱进行分离，再采用分光光度、荧光或质谱检测系 统进行定量浦定。
• •
• •
反
应
三、常见兽药的种类
1.抗生素类药物 2.磺胺类药物 3.硝基呋喃类药物 4.抗寄生虫类药物 5.激素类药物
分析方法
主要有微生物分析法、放射化学法、免疫法（包括放射免疫法、酶联 免疫法、荧光免疫法、化学发光免疫法）、气相色谱法、薄层色谱法、 高效液相色谱法（包括柱前和柱后衍生荧光法）、液相色谱 - 质谱法 和气相色谱-质谱法。
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• 3.薄层色谱法 • 薄层色谱法（ TLC ）又分为正相薄层色谱（ NP-TLC ）和反相薄 层色谱（ RP -TLC ）。 • 正相薄层色谱一般使用纤维素、硅胶、硅藻土等作为吸附层。总 体而言，正相薄层色谱是一种简单的、不需特殊设备的分离方法， 但在制板时却要花费大量时间消除 TCs 与金属离子的鳌合作用， 故通常在吸附剂和溶剂系统中加入 EDTA 以消除金属离子的影响。
四环素类抗生素
• 在动物养殖中应用广泛，主要作为饲料添加剂用于预防和治疗疾 病。近些年来，在牛、猪、绵羊、山羊、家禽及水产养殖中常用 的四环素类抗生素主要是土霉素、金霉素、四环素和强力霉素等。
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• （一）四环素类抗生素的代谢 • 四环素类药物的给药可通过几种方式： • 口服（添加到饲料或饮用水中）、注射及通过乳腺注入。 • 无论采用何种给药方式，四环素类抗生素都能在体内广泛分布， 而在肾脏和肝脏组织中含量尤高。
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• 将四环素类抗生素从可食动物产品中分离出来是一个相当复杂的 步骤。 • 主要困难在于这些化合物在被分离时倾向于与金属离子形成鳌合 物或与样品基质成分键合。 • 为提高提取效率，推荐采用EDTA 、柠檬酸盐、琥珀酸盐或草酸 等四环素类化合物的竞争性鳌合剂。同时需要考虑采取适当的提 取条件以减少与蛋白质的键合。
• 多数四环素类化合物对光敏感，而且在强酸或碱性条件下不稳定， 在弱酸性（ pH=3 ）条件下形成差向异构体，在强酸性（ pH < 2 ） 条件下形成脱水产物。
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• 分析液体样品（如牛奶）中的四环素类抗生素残留时，一般需要 一个预离心步骤以除去脂肪。 • 在净化步骤之前，还需采用乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液对样品 进行稀释。对于半固体样品，如肌肉、肾脏、肝脏，通常需要更 强烈的样品预处理步骤以破碎组织。可采用切碎机和组织均质器 通过机械分散作用来完成这一步骤。
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• 反相薄层色谱分析 TCs 时，溶剂系统中通常加入草酸以消除金属 离子的影响．在 RP -TLC 溶剂体系中通常含有磷酸、柠檬酸、酒 石酸、 EDTA 等以获得对TCs好的分离效果，但脱尾现象比较严重； 在 RP-TLC 溶剂体系中加人草酸后，可以消除 TCs 与金属离子的 鳌合作用，减少脱尾现象。
• 在我国，鱼药、蜂药、蚕药也列入兽药管理。 • 2.兽药残留 • 对食品动物用药后，动物产品的任何食用部分中的原型药物或 /和 其代谢产物，包括与兽药有关的杂质的残留。