RealTimeRTPCR常见问题分析
PCR常见问题、原因分析及其对策
镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有 重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降； 镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失 败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐 ，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增 效果，因此需要确保模板的纯度和浓 度，避免使用降解严重的模板，以提 高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时， 合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特 异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视， 提高模板质量可以提高pcr的产量和特 异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质， 这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模 板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤 的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。
RealTimeRTPCR常见问题分析
Real-Time RT-PCR常见问题分析1.某一孔荧光信号特别强问题：同一批样品，其中某一个荧光信号特别强？原因：①试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；②试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；③也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；2. 扩增曲线有一向上或向下的尖峰问题：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？原因：①反应过程中电压不稳定；②可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；③如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；3. 部分样本扩增效率过低问题：部分样本扩增效率过低？原因：①提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；②反应液未严格取量混匀或分装不均匀；③试剂失效；4.阴性对照或空白对照翘尾，可能原因：1、模板提取环境有污染。
2、模板提取操作有污染。
3、配液过程存在污染。
问题：阴性对照或空白对照翘尾？原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染；5. 直线型扩增曲线问题：直线型扩增曲线？原因：①探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；②反应液中有PCR抑制物；6.没有扩增曲线问题：没有扩增曲线？原因：①PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage 1阶段；②电脑设定了自动休眠；7.基线下滑问题：扩增曲线有一个下滑阶段？原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；8.扩增曲线断裂问题：扩增曲线断裂？原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值＜15，而基线范围仍取3－15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据9.样品浓度跨度过大样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，原因及解决办法同“扩增曲线断裂”。
PCR常见问题分析及对策
.PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低.6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。
RTPCR常见问题分析
严格控制实验操作过程
总结词
实验操作过程的准确性和规范性对RTPCR实验结果具有重要影响，严格控制实验操作 过程可以有效提高实验的准确性和可靠性。
详细描述
遵循标准的RTPCR实验操作流程，确保每一步操作的准确性和规范性。在实验过程中， 注意避免交叉污染和误差传递，使用一次性吸头和离心管，避免使用污染的工具和容器。
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RTPCR常见问题分析
目录
• RTPCR技术概述 • RTPCR实验过程常见问题 • RTPCR结果解读常见问题 • RTPCR技术改进和优化建议
01
RTPCR技术概述
RTPCR技术简介
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR），简称RTPCR， 是一种在PCR反应过程中实时监测荧 光信号的分子生物学技术。
同时，对实验操作人员进行培训和考核，确保其具备足够的技能和经验。
完善扩增产物检测方法
总结词
扩增产物检测是RTPCR实验的关键环节，完善扩增产物 检测方法可以有效提高实验的准确性和可靠性。
详细描述
选择灵敏度高、特异性好的检测方法，如荧光定量PCR 、熔解曲线分析等。同时，采用内参基因对实验结果进 行校正和标准化处理，以排除实验过程中可能存在的误 差和干扰因素。此外，应定期对检测方法进行验证和优 化，以确保其性能的可靠性和稳定性。
04
RTPCR技术改进和优化 建议
优化样本采集和保存方法
总结词
详细描述
样本质量是影响RTPCR实验结果的重要因素， 优化样本采集和保存方法可以有效提高实验 的准确性和可靠性。
在采集样本时，应选择适当的采集时间、部 位和数量，避免样本受到污染或降解。采集 后应尽快将样本保存于适当的介质中，并保 持低温，以维持样本的稳定性和活性。
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案!
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案！PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日进行检查，大于48h后带型不规章甚至消逝。
但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的推断，详细归类为以下常见的4点，描述如下：问题一：无扩增产物现象：正对比有条带，而样品则无。
缘由：1、模板:含有抑制物，含量低。
2、Buffer对样品不合适。
3、引物设计不当或者发生降解。
4、反应条件：退火温度太高，延长时间太短。
对策：1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量。
2、更换Buffer或调整浓度。
3、重新设计引物（避开链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物。
4、降低退火温度、延长延长时间。
问题二：非特异性扩增现象：条带与估计的大小不全都或者非特异性扩增带。
缘由：1、引物特异性差。
2、模板或引物浓度过高。
3、酶量过多。
4、Mg2+浓度偏高。
5、退火温度偏低。
6、循环次数过多。
对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR。
2、适当降低模板或引物浓度。
3、适当削减酶量。
4、降低镁离子浓度。
5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法。
6、削减循环次数。
问题三：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
缘由：1、模板不纯。
2、Buffer不合适。
3、退火温度偏低。
4、酶量过多。
5、dNTP、Mg 2+浓度偏高。
6、循环次数过多。
对策：1、纯化模板。
2、更换Buffer。
3、适当提高退火温度。
4、适量用酶。
5、适当降低dNTP和镁离子的浓度。
6、削减循环次数。
问题四：假阳性现象：空白对比消失目的扩增产物。
缘由：靶序列或扩增产物的交叉污染。
对策：1、操作时应当心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
2、除酶及不能耐高温的物质外，全部试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
RT-PCR中遇到的问题及解决方法
RT-PCR中可能遇到的问题及处理方法摘要：本文就在RT-PCR实验中可能遇到的，包括在琼脂糖凝胶电泳分析中看到少量或没有RT-PCR产物、在琼脂糖凝胶分析中看到非预期条带、多聚糖同RNA共沉淀、cDNA第一链合成错误或数量少、RNA二级结构太多等问题进行分析，并提出了相应的可能的处理方法。
RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
RT-PCR的关键步骤在是RNA 的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。
1 材料与方法1.1材料1.1.1 RT-PCR技术相关试试剂:oligo: 多聚体，相当于mRNA引物AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs：脱氧核苷酸RNase：RNA酶抑制剂PCR Buffer：RT-PCR缓冲液MgCl2：2价镁离子1.2 方法1.2.1 RNA提取组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停）。
转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min。
加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min。
10000 rpm 4℃离心15min。
转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min。
Realtime PCR检测原理和问题处理(技术材料)
技术研究
2
★实时荧光定量PCR检测技术
（Real-time PCR) 定量PCR的数学原理
定量PCR的化学原理
定量PCR的光学原理
技术研究
3
什么是PCR？
技术研究
4
PCR的反应过程
技术研究
5
RT-PCR原理图
技术研究
6
荧光定量PCR的数学原理
1、Baseline (基线) 2、Threshold (阈值)
推荐措施：提高引物设计质量，避免形成引物二聚体 补救措施：优化引物浓度和退火温度，专设高温度的收集信号步骤
技术研究
53
实例7：重复性不佳
正常的原始数据
技术研究
54
实例7：重复性不佳
不正常的原始数据
原因：盖子未盖紧，溶液蒸发。
技术研究
55
疾病监测中常用的反应Mix
ABI公司 AgPath-IDOne Step RT-PCR Kit（货号 AM1005）
8
阈值
阈值= 基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即 PCR扩增信 号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲 线的增长拐点处附近。
技术研究
9Ct值Biblioteka 扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循 环数，即PCR增长信号与 Threshold发生交汇的循环数，也是 FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。
16
定量PCR的数学原理 定量PCR的化学原理 定量PCR的光学原理
技术研究
17
常用的荧光标记方法
1、DNA双链特异性染料 SYBR Green 、SYTO 9、LC Green、Evagreen
2、序列特异性探针
RT-PCR常见问题
RT-PCR常见问题什么是RT-PCR？RT-PCR全称为反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction），是一种常用的分子生物学技术。
它通过先将RNA转录成cDNA，再进行聚合酶链式反应来扩增目标DNA序列，从而便于对目标基因的定性和定量分析。
RT-PCR的原理是什么？RT-PCR的基本原理是先通过逆转录酶（Reverse Transcriptase）将RNA转录成互补的cDNA，然后利用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）对cDNA进行扩增。
逆转录酶根据RNA模板合成cDNA，聚合酶负责在不断升高的温度下合成新的DNA链。
RT-PCR常见的应用有哪些？RT-PCR技术在许多领域得到广泛应用，主要用于以下方面：1.基因表达分析：通过检测转录产物的浓度，了解特定基因在不同生理状态下的表达水平。
2.病原微生物检测：对病原微生物的核酸进行扩增和检测，用于诊断和监测传染病。
3.肿瘤检测和诊断：检测癌细胞中特定基因的表达水平，以辅助肿瘤的早期诊断和治疗选择。
4.病毒感染检测：通过检测病毒基因组的存在和复制水平，帮助诊断病毒感染。
5.遗传病诊断：通过检测患者DNA中的突变位点，早期发现和预防遗传病。
RT-PCR实验中常见的问题有哪些？在进行RT-PCR实验时，常见的问题包括：1.污染：实验室环境和试剂可能导致样品污染，影响实验结果。
因此，严格控制实验条件和采取相应的质量控制措施非常重要。
2.物质稀释和浓度计算：正确计算样品和试剂的稀释倍数以及逆转录反应液和扩增反应液的浓度对于得到准确结果至关重要。
3.阴性对照：包括模板对照和水对照，用于检测反应物的特异性和检测污染。
如果阴性对照出现阳性结果，可能是污染导致的。
4.温度控制：在逆转录和扩增过程中，保持恒定的温度是非常重要的。
温度的变化可能导致逆转录或扩增效率低下或产生非特异性产物。
PCR常见问题分析及对策
PCR 常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 2009-03-28 11:38问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear 状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR 引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30 碱基之间。
PCR常见问题分析与对策
PCR常见问题分析与对策PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
PCR常见问题分析及对策
一、PCR反应的关键环节：①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量；④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
（1）模板：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
（2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
（5）反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50u l，或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
（6）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
Real Time PCR技术原理及常见问题
普洛麦格（北京）生物技术有限公司 电话：800 810 8133，010 58256268
中文网址：
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Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd 英文网址：
2.B 染料法原理——特异性与双链 DNA 结合的荧光染料
中文网址：
Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd 英文网址：
3 / 11
3. Real Time PCR 数据分析
Real Time PCR 实验完成后，通常可以得到以下三组数据：扩增曲线、标准曲线（只有采用标准品时才 有）、溶解曲线（只有染料法才有）。对 Real Time PCR 结果进行分析，主要是研究此三组数据。
Real Time PCR 技术原理及常见问题
Promega GoTaq® Amplification Family
目录
1. End-Point vs. Real Time PCR(终点法与实时荧光定量 PCR） ................................................................................ 1
3. Real Time PCR 数据分析 ......................................................................................................................................... 4 4. 相对定量 vs 绝对定量 ......................................................................................................................................... 5
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
PCR、RT-PCR常见问题及分析
提高PCR、RT-PCR
04
实验成功率的建议
选择合适的引物
总结词
引物的选择是PCR和RT-PCR实验的关键步 骤，直接影响到实验的成功与否。
详细描述
选择引物时，应确保引物与目标序列的特异 性结合，避免引物二聚体和非特异性扩增的
产生。引物长度、GC含量和特异性等参数 需进行优化，以提高扩增效率和特异性。
试剂问题
总结词
试剂的质量和纯度对PCR实验结果具有重Biblioteka 要影响。VS详细描述
DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2等试剂的 质量和纯度都会影响PCR实验结果。低质 量的试剂可能导致PCR产物减少或非特异 性扩增。此外，试剂的储存和配制过程中 的问题，如试剂过期、污染等，也可能影 响PCR实验结果。
PCR、RT-PCR实验
总结词
假阳性是指PCR或RT-PCR结果中出 现的实际不存在的产物。
详细描述
假阳性可能是由于污染（如试剂、样 品或实验室环境的污染）或交叉污染 引起的。此外，不适当的引物设计或 使用过期的试剂也可能导致假阳性。
假阴性
总结词
假阴性是指PCR或RT-PCR结果中未检测到 实际存在的产物。
详细描述
假阴性可能是由于引物与模板的结合位点减 少或消失，或者由于反应条件不适当（如温 度、离子浓度等）导致的。此外，样品中存 在的抑制剂也可能影响PCR或RT-PCR的扩 增效率，导致假阴性。
PCR、RT-PCR常见问 题及分析
contents
目录
• PCR、RT-PCR基本原理 • PCR、RT-PCR实验操作中的常见问题 • PCR、RT-PCR实验结果分析中的常见问
题 • 提高PCR、RT-PCR实验成功率的建议
实时定量PCR中的常见问题及解决办法
实时定量PCR中的常见问题及解决办法1、反应后无扩增曲线出现1）确认程序中是否设置了信号采集步骤：两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
2）扩增效率问题：电泳检测realtimePCR反应产物，观察是否有正确大小的目的条带出现。
如果没有，则逐一排查引物、模板以及反应条件问题。
3）循环数不够：一般可设置循环数为40。
2、Ct值出现太晚1）模板浓度过低或模板降解：重新制备模板再进行实验。
2）扩增效率低：优化反应条件，或者重新设计PCR引物。
3）PCR产物过长：一般设计为100-200bp即可。
4）反应体系中含有抑制剂：常在模板质量不高时出现，重新制备模板或将模板稀释后使用。
3、扩增曲线形状异常1）扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。
提高模板浓度重复实验。
2）扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct 值。
减小基线终点 (Ct值- 4)，重新分析数据。
3）个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。
进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
4、阴性对照出现扩增曲线1）阴性对照在35个循环以后出现扩增曲线很有可能是因为出现引物二聚体，属于正常现象。
可通过融解曲线分析进行判断。
2）反应体系被模板污染：更换水、反应试剂、引物。
5、标准曲线线性关系不佳1）加样误差：将模板稀释，扩大体积是一个有效的解决办法。
2）标准品降解：重新制备标准品。
3）模板浓度过高：稀释模板重新实验。
6、实验重复性差1）加样误差：将模板稀释，扩大体积是一个有效的解决办法。
2）模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差。
适当增加模板量。
3）仪器误差：不同的孔温度控制不一致也会导致重复性差的问题。
请专业人员对仪器进行校准。
7、融解曲线出现多峰1）引物非特异扩增：重新设计引物，优化扩增条件。
2）引物浓度太高：引物浓度过高容易引起扩增条带弥散。
PCR检测常见问题与解决途径剖析
PCR检测常见问题与解决途径剖析PCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
5. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
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Real-Time RT-PCR常见问题分析
1.某一孔荧光信号特别强
问题：同一批样品，其中某一个荧光信号特别强？
原因：①试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；②试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；③也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这
时就要清除热槽中的污染；
2. 扩增曲线有一向上或向下的尖峰
问题：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？
原因：①反应过程中电压不稳定；②可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；③如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；
3. 部分样本扩增效率过低
问题：部分样本扩增效率过低？
原因：①提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；②反应液未严格取量混匀或分装不均匀；③试剂失效；
4.阴性对照或空白对照翘尾，可能原因：1、模板提取环境有污染。
2、模板提取操作有
污染。
3、配液过程存在污染。
问题：阴性对照或空白对照翘尾？
原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染；
5. 直线型扩增曲线
问题：直线型扩增曲线？
原因：①探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；②反应液中有PCR抑
制物；
6.没有扩增曲线
问题：没有扩增曲线？
原因：①PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage 1阶段；②电脑设定了自动休眠；
7.基线下滑
问题：扩增曲线有一个下滑阶段？
原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；8.扩增曲线断裂
问题：扩增曲线断裂？
原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值＜15，而基线范围仍取3－15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，
阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据
9.样品浓度跨度过大
样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，原因及解决办法同“扩增曲线断裂”。
10.山坡形曲线
问题：山坡形曲线？
原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。