密度梯度离心法分离操作流程.docx
ficoll密度梯度离心法
ficoll密度梯度离心法ficoll密度梯度离心法是用于细胞分选的一种分离技术，它借助于物体表面质量和密度梯度来达到有效分离细胞的目的。
它具有高灵敏度、可同时分离多种细胞、保护细胞结构完整和特异性高等特点，因而在细胞分选方面被广泛应用。
ficoll密度梯度离心法的原理及其详细的实施步骤，以及其在细胞分选中的广泛应用，本文要讨论和介绍。
一、ficoll密度梯度离心法的原理ficoll密度梯度离心法是一种细胞分选技术，用于不同细胞之间的分离。
该方法借助于细胞质量和密度梯度的差异来达到分离效果。
首先，在试管内容入一定量的细胞样本，并在此基础上配制密度梯度介质（如ficoll），使梯度介质有一定的密度重要，随后将其放入离心机中离心，由于细胞质量不同，会根据梯度的上下限，在密度梯度中的不同位置定位并被受力分离开。
最后，比较轻的细胞会停留在梯度的上端，而比较重的细胞则被受力推动而离开密度梯度，并落入下层。
由此可见，ficoll密度梯度离心法是利用细胞质量和密度梯度差异来进行的分离，是一种非常有效的细胞分选技术。
二、ficoll密度梯度离心法的实施步骤（一）准备介质首先，进行ficoll密度梯度离心时，需要准备好梯度介质，一般采用ficoll-paque溶液，可以根据不同的应用需求选择不同的ficoll组合。
在使用ficoll梯度介质之前，需要先进行稀释，以确保其最终浓度与所需要的目标密度梯度相匹配。
（二）均质接下来，在准备好的ficoll梯度介质中，将样本液按照一定体积加入，并缓缓搅拌均匀，使样本液完全渗透到ficoll梯度介质中，以保证系统在离心前可以得到均匀的梯度介质。
（三）离心将准备好的细胞滴定液置入离心机中，根据实验需要设定离心力度和时间，使其能够在较短时间内完成离心。
（四）细胞回收当离心运行完毕后，在离心管的各层中可分离到不同的细胞。
然后，可以分别收集不同层的细胞，以便进行进一步的分析。
三、ficoll密度梯度离心法的广泛应用ficoll密度梯度离心法借助于物体表面质量和密度梯度的差异，可以进行有效的细胞分离。
ficoll密度梯度离心
ficoll密度梯度离心ficoll密度梯度离心是一种分离组织细胞如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等的方法。
它是一种非物理性分离方法，基于不同细胞密度不同的原理进行分层分离。
该方法分离单个细胞时选择性很高，可以得到高质量的单个细胞，是细胞分离和富集的重要手段之一。
下面就具体介绍一下ficoll密度梯度离心步骤：1. 工具和试剂：ficoll、PBS缓冲液、离心管、离心机、无菌操作的平板和操作台、活细胞计数器和消毒液。
2. 细胞样品处理：制备细胞的离心液，将组织细胞含淋巴细胞、单核细胞、粒细胞的全血或组织液用PBS缓冲液稀释10倍，轻轻混合，放入无菌操作的平板中。
3. ficoll密度梯度液制备：将密度逐渐递增的ficoll液体制成梯度液，方法为：向离心管中加入2ml浓度为1.077g/ml的ficoll液，然后缓慢地滴加2ml PBS缓冲液，使其密度降低为1.074g/ml，缓慢但均匀地加入2ml浓度为1.071g/ml的ficoll液，同样的方法，逐步制成梯度液。
4. 梯度离心分离：将制备好的离心液缓慢加入离心管中，完全覆盖上层的 ficoll 密度梯度液，离心3000rpm, 20min（具体离心速度和离心时间会因细胞类型和样品情况而有所不同，需根据实验需要调整）。
5. 收集样品细胞：从离心管底部用移液管吸取相对富含细胞的区域（未与 ficoll 接触的细胞，位于 ficoll 密度梯度液的底部），将其转入新离心管中，加 PBS 缓冲液洗涤细胞2~3次，沉淀每次5min，离心1800 rpm/5min。
6. 活细胞计数：溶解细胞样品，并在活细胞计数器中用ADM-1（0.4% Trypan blue）计数活细胞数量。
总结来说，ficoll密度梯度离心法是一种可靠而高效的细胞分离方法，其过程简单，操作容易掌握。
在细胞学研究中，该方法的应用十分广泛，被广泛应用于分离和富集单种细胞类型，包括未分离、单核、淋巴细胞组，分离的细胞可用于后续的蛋白质、RNA/DNA等分子水平的研究。
过氧化物酶体密度梯度离心法
过氧化物酶体密度梯度离心法过氧化物酶体密度梯度离心法（Percoll离心法）是一种常用的分离和富集细胞器的方法，可以根据细胞器的密度差异来实现分离。
本文将介绍Percoll离心法的原理、操作步骤以及注意事项。
一、原理Percoll离心法基于浓度梯度离心的原理，通过在离心过程中产生梯度离心力，使不同密度的细胞器在不同位置沉降，从而实现分离。
具体原理如下：1. Percoll溶液：Percoll是一种均聚体，能在不同浓度下形成可调节的密度梯度。
Percoll溶液由Percoll粒子和缓冲溶液组成，通过调节Percoll的浓度可以得到不同密度的离心梯度。
2. 离心过程：将样品和Percoll溶液混合均匀后加入离心管中，然后进行离心。
离心过程中，细胞器受到离心力的作用，向离心管的底部沉降。
由于不同细胞器的密度不同，它们会在不同位置沉降。
3. 分离：离心结束后，可以通过分离离心管中的不同层次，得到不同密度的细胞器。
二、操作步骤以下是Percoll离心法的一般操作步骤：1. 准备样品：将待分离的细胞或组织样品进行收集和处理，保持细胞完整且样本纯净。
2. 制备Percoll溶液：根据实验要求调配不同浓度的Percoll溶液，并进行消毒处理。
3. 加入样品：将准备好的样品加入到含有Percoll溶液的离心管中，并轻轻混合，以确保样品均匀分布。
4. 离心：将装有样品的离心管放入离心机中，根据离心参数设置好离心条件，如转速和时间等。
5. 分离：离心结束后，从离心管中分离出不同层次的细胞器悬浮液，可以使用移液管或离心管等工具进行分离。
6. 保存和分析：将分离得到的细胞器悬浮液进行保存或进一步分析。
三、注意事项在进行Percoll离心法的实验时，需要注意以下几点：1. 严格控制离心条件：离心参数的设置需要根据具体实验目的和样品特点来确定，过高的离心力可能会损伤细胞器，过低的离心力可能无法分离细胞器。
2. 样品的处理：样品的收集和处理过程需要严格控制，保证细胞完整性和样品纯净性。
ficoll密度梯度离心法分离pbmc
ficoll密度梯度离心法是一种常用的细胞分离技术，尤其在分离外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）时被广泛应用。
该技术通过梯度离心的原理，能够将不同密度的细胞分离开来，从而得到高纯度的目标细胞。
本文将从原理、操作步骤及应用方面对ficoll密度梯度离心法分离PBMC进行介绍。
一、原理1. ficoll密度梯度离心法的原理ficoll密度梯度离心法是基于不同细胞在不同密度梯度离心条件下会沉降到不同层级的原理。
ficoll是一种聚合物，在水溶液中形成梯度，形成浓度递增的梯度。
当混有不同密度的细胞悬液样本在ficoll梯度上离心时，密度较高的细胞沉淀到ficoll浓度较高的层次上，而密度较低的细胞则会沉淀到ficoll浓度较低的层次上，从而实现了不同细胞的分离。
2. ficoll密度梯度离心法分离PBMC的原理在分离PBMC时，PBMC是由淋巴细胞和单核细胞组成的一种混合细胞悬液。
在ficoll密度梯度离心法中，PBMC会在ficoll的适当浓度层次上形成特定的固定位置，而其他细胞则会分布在不同的ficoll浓度层次上。
通过调整ficoll梯度的浓度，即可使PBMC在特定位置上沉淀，从而实现PBMC的分离。
二、操作步骤1. 制备ficoll梯度液将ficoll粉末加入等体积的PBS缓冲液中，充分溶解并混匀，得到ficoll梯度离心所需的溶液。
2. 取样、稀释取外周血样本，加入适量的PBS缓冲液稀释，使细胞密度均匀并不超出离心设备的容量。
3. 加样将稀释后的外周血样本缓慢地加入到制备好的ficoll梯度液上，避免产生气泡并保持悬液的均匀性。
4. 离心分离将加样后的离心管放入离心机中，进行高速离心。
离心过程中，细胞会根据密度在ficoll梯度上分层沉淀，形成不同层次的细胞带。
5. 取样离心结束后，用吸管或移液器沿着管壁取下PBMC所在的ficoll层次，并转移至新的离心管中。
密度梯度离心法分离PBMC操作流程
稀度梯度离心法分散PBMC之阳早格格创做1.正在15mL离心管中加进5mL淋巴细胞分散液Ficoll.2.与5mL抗凝静脉血与5mL无菌PBS依照1：1充分混匀，用移液管沿管壁缓缓叠加于分层液里上，动做一定要沉，注意脆持领会的界里.中周血，PBS，淋巴细胞分散液最后体积比为1：1：1.3.火仄离心400g×30分钟.（注意：为包管分散效验，需将离心机降落速率调至最矮，即降速为1，落速为0，那样安排后，降落速会比较缓，总体离心时间约为1小时.）4.离心后可瞅睹管内分为三层，表层为血浆战PBS，下层主要为黑细胞战粒细胞，中层为淋巴细胞分散液.正在上、中层界里处有一以单个核细胞为主的红色云雾层渺小戴(如下图)，单个核细胞包罗淋巴细胞战单核细胞.别的，还含有血小板.血浆战PBS单个核细胞淋巴细胞分散液黑细胞战粒细胞5.来除部分表层液体（用移液管吸与，没有成倾倒），余下约1mL，用移液器插到云雾层，吸与单个核细胞.置进另一15mL离心管中，加进5倍以上体积的PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞二次.6.终次离心后，弃上浑，加进黑细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解黑细胞，可根据情况适量删减时间.7.加进10mL PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞二次.8.终次离心后，弃上浑，加进含有10%FBS的RPMI1640，沉悬细胞，计数，估计细胞活力.用原法分散PBMC，每1mL齐血可分散得到1~2×106PBMC，分歧人个体之间存留一定好别.活细胞百分率正在95％以上.注意：1.所有支配皆应正在无菌条件下举止.2.正在分散前Ficoll战PBS等试剂均需正在37℃恒温火浴中预热半小时以上.3.吸与单个核细胞时没有成预防会吸到Ficoll，而Ficoll稀度比细胞要大，果此步调5中需加进脚量PBS稀释，若PBS体积太小大概会引导细胞无法离心支集.。
pbmc分离步骤
pbmc分离步骤
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的缩写，通常包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。
以下是从外周血中分离PBMC的一般步骤，主要采用密度梯度离心法：
1.材料准备：
•外周血样本
•无菌PBS（磷酸盐缓冲液）
•密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）
2.密度梯度分离：
•将外周血与相同体积的PBS混合均匀。
•将混合物缓慢地倒在密度梯度分离液上，确保形成一个清晰的界面。
•用无菌技术，将样本与PBS和分离液的混合物轻轻地分层到离心管中。
3.离心：
•使用无菌技术将离心管放入离心机，进行离心。
•设置适当的离心参数，通常是低速度离心，以避免细胞破裂。
•离心结束后，PBMC会沉积在分离液的界面上。
4.PBMC收集：
•使用无菌技术，将PBMC小心地从离心管的界面上吸取出来，放入新的离心管中。
5.洗涤：
•使用PBS或细胞培养基等缓冲液洗涤PBMC，以去除密度梯度分离液的残留。
6.计数和保存：
•使用血细胞计数板或血细胞计数仪等设备，计数PBMC的细胞数。
•根据需要，将PBMC冻存或直接用于后续实验。
注意事项：
•所有步骤应在无菌条件下进行，以避免细菌和其他污染物的引入。
•使用离心管和仪器前后要进行严格的消毒。
•密度梯度分离液的选择要根据实验需要，通常使用Ficoll-Paque 等离子浓度梯度离心介质。
这些步骤是标准的PBMC分离方法，但可能需要根据具体实验的需求进行微调。
密度梯度离心法分离PBMC操作流程
密度梯度离心法分离PBMC操作流程密度梯度离心法（density gradient centrifugation）是一种常用的方法，用于将外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）从全血中分离出来。
该方法通过利用血细胞的不同密度来实现分离，从而获得单个核细胞。
以下是密度梯度离心法分离PBMC的详细操作流程：1.准备所需材料和设备：包括离心管、离心机、无细胞培养基、PBS缓冲液、密度梯度离心液。
2.使用无菌的方法处理全血样本，以防止可能的污染。
3.将含有全血的离心管放置在室温下静置一段时间，使其形成明显的三明治结构，由于样本中的红细胞比其他细胞密度更大，红细胞将沉积在管底部。
4.使用无菌的方法，将全血缓慢倒入预先准备好的无菌离心管中，注意不要把红细胞底层的部分连同上层血浆一同倒入，只取上清层部分。
5.将上清层的全血样本缓慢地转移至一个新的无菌离心管中。
6.向离心管中加入与全血样本体积相等的PBS缓冲液，充分搅拌混匀。
7.将密度梯度离心液缓慢地倒入离心管中，注意避免形成气泡。
8.将离心管放入离心机中，设定合适的离心参数，如离心速度和离心时间。
一般采用400-500g，离心时间为20-30分钟。
离心完成后，你将看到细胞在离心管中形成了几个不同层次。
9.使用无菌的方法，将上清层液体小心地转移至新的离心管中。
在转移过程中，避免吸入其他层次的细胞。
10.将离心管用无菌PBS缓冲液冲洗一次，以去除残余的密度梯度离心液。
11.将PBMC的悬浮细胞沉淀至离心管底部，去除上清液。
12.向沉淀细胞加入足够量的细胞培养基，轻轻搅拌使细胞均匀分散。
13.对PBMC进行细胞计数，以确定细胞数目和浓度。
14.根据实验需求，进行后续的细胞培养、染色、分析等操作。
需要注意的是，在操作过程中，需要注意无菌操作，以避免细胞的污染和损伤。
此外，离心参数和离心时间也需要根据具体实验要求进行调整。
人类x和Y精子的分离密度梯度离心法
人类x和Y精子的分离密度梯度离心法(一)原理x、Y精子尽管由平衡沉淀作用获得的密度是相似的，但在分离介质中的沉降速度不等，x精子沉降速度比Y精子快；这样在一个由低到高的密度梯度中，通过适当的离心力作用下，经过一定时间离心，可在不同密度梯度中分离出富含x或Y精子的标本。
(二)试剂与器材(1)lOxEaI"le's液；(2)l×Earle's液；(3)：Percoll液；(4)Nycoprep(密度为1．15g／mL，渗透压为290mOsm／kg)；(5)14mL离心管。
(三)方法100％Percoll液制备：9份Percoll+1份10×．Earte's液+100IU／mL青霉素+1．89g ／L Nat_IC03，密度为1．11g／mL，渗透压280mOsm／kg。
在使用前一天，将100％Percoll液放在5％c02培养箱中平衡8～10 min，贮存于4cC冰箱；在使用当天，将100％Perc0儿液1000g离心10 min，以沉淀任何二氧化硅颗粒凝集物。
然后用l×Eaile's液将100％：Pel，coll液稀释成各种所需浓度。
(1)8层Percoll梯度离心法在14mL离心管中，由下至上从84％到35％Percoll液，按7％递减，各加1．0mL，形成7层：Pelcoll梯度；取1．OmL液化精液加入Percoll梯度的最上层，250g离心30 min，移去各层液体，沉淀层用1×Ealile's液(含10％胎儿脐带血清)洗涤，300g离心10 min，去上清，最后沉淀用适量Eat-le's液悬浮。
(2)8层Percoll+Nycoprep分离法在一支14mL离心管中先加入1．0mI．Nyco[Irep 液，然后在其上层依次加入各1．OmI．的100％～40％Percoll液共7层，最后，最上层再加入1．0mL的液化精液，250g离心25 min，移去各层液体，沉淀用1~2mLEal·le's 液洗涤，离心，去上清，沉淀再用适量Ear-le's液悬浮。
密度梯度分离法
密度梯度分离法
密度梯度分离法是一种常用的生物学技术，用于分离、纯化、鉴
定和定量生物大分子（如DNA、RNA、蛋白质等），并具有分离效率高、纯度高、选择性好等特点。
下面我们来分步骤介绍密度梯度分离法的
操作流程。
步骤一：制备密度梯度液
密度梯度液是密度梯度分离法的核心组成部分，其密度逐渐递增，可形成不同浓度级别的梯度。
制备密度梯度液可以采用蔗糖、葡萄糖、硝酸盐、硫酸盐等物质溶解于缓冲液中，形成梯度液。
步骤二：取样和上样
将待分离的样品通过适当的处理（如离心、裂解、纯化等），制
备成一个适合于密度梯度离心的样品上样。
通常，样品应该在离心前
等量混合适量的密度梯度液，并缓慢上样于离心管中。
步骤三：离心
将样品密度梯度离心至一定时间或速度后，生物大分子会沉积在
密度梯度中不同浓度的位置，形成一个梯度分布。
步骤四：采集分离物
轻轻地抽取有代表性的分离物进行分析，可以用分光光度计、电
泳等方法测定分离物的含量、分子量、电荷等性质，从而进行分离纯
化和鉴定。
密度梯度分离法具有以下优点：分离效率高，可同时分离多种不
同的生物大分子；纯度高，分离出的物质含杂质较少；选择性好，具
有不同密度的物质可以在同一实验中分离出来。
因此，密度梯度分离
法在生物医学研究、制药等领域中得到广泛应用。
等密度梯度区带离心 平衡区带离心
等密度梯度区带离心平衡区带离心等密度梯度区带离心与平衡区带离心一、等密度梯度区带离心1. 原理- 等密度梯度区带离心是根据粒子的密度差异进行分离的。
在离心场中，不同密度的粒子会在密度梯度介质中移动到与自身密度相等的位置形成区带。
- 密度梯度介质的密度范围要包含被分离粒子的密度范围。
例如，当分离核酸分子时，常用的密度梯度介质如氯化铯（CsCl），它可以在离心过程中形成连续的密度梯度。
2. 操作过程- 首先将样品与密度梯度介质均匀混合，然后装入离心管。
- 进行离心，离心力会使样品中的粒子在密度梯度介质中重新分布。
在足够长的离心时间后，粒子会达到与其自身密度相等的位置。
- 离心结束后，可以通过穿刺离心管底部或者分部收集的方法，将不同区带的样品分别收集起来进行分析。
3. 应用- 在分子生物学中，常用于分离不同密度的核酸分子。
例如，在研究DNA复制时，可以用等密度梯度区带离心分离重链（含重同位素标记）和轻链（正常同位素）的DNA分子，以证明DNA的半保留复制方式。
- 也可用于分离细胞器等细胞结构，根据它们不同的密度将其分离开来，有助于研究细胞器的功能和组成。
二、平衡区带离心1. 原理- 平衡区带离心也是基于物质的密度差异，但它是在一个预先形成的密度梯度介质中进行的。
- 当样品被加到这种密度梯度介质的顶部或其他合适位置后，在离心力的作用下，不同密度的粒子向离心管底部移动的速度不同。
密度大的粒子移动速度快，密度小的粒子移动速度慢。
- 随着离心的进行，粒子会在密度梯度中达到平衡位置，形成不同的区带。
2. 操作过程- 先制备密度梯度介质，如蔗糖密度梯度，可以通过不同浓度蔗糖溶液的分层来形成梯度。
- 将样品小心地加到密度梯度介质的顶部或者特定位置。
- 进行离心，离心过程中，粒子在密度梯度中迁移并形成区带。
- 离心结束后，同样采用合适的方法收集不同区带的样品。
3. 应用- 在蛋白质的分离纯化中广泛应用。
不同的蛋白质由于其结构和组成不同，具有不同的密度，通过平衡区带离心可以将它们分离开来。
分离纯化t细胞的方法
分离纯化t细胞的方法分离纯化T细胞的方法T细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有调节和介导免疫反应的作用。
为了研究T细胞的生物学特性和功能，需要对其进行分离纯化。
本文将介绍几种常用的T细胞分离纯化方法。
1. 密度梯度离心法密度梯度离心法是一种常用的T细胞分离方法。
该方法利用不同细胞类型的密度差异，在离心过程中将T细胞分离出来。
具体操作步骤如下：（1）制备密度梯度液：将高分子物质如葡聚糖或Ficoll等加入生理盐水中，制备成不同浓度的密度梯度液。
（2）收集外周血或淋巴组织细胞：将外周血或淋巴组织细胞收集到离心管中。
（3）加入密度梯度液：将密度梯度液缓慢地加入离心管中，避免与细胞混合。
（4）离心分层：将离心管放入离心机中，进行离心分层。
离心后，T 细胞会沉淀在密度梯度液的某一层中。
（5）收集T细胞：用吸管或移液器将T细胞层收集到新的离心管中。
2. 免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是一种高效、快速、特异性强的T细胞分离方法。
该方法利用磁珠表面的抗体与T细胞表面的特异性抗原结合，将T细胞分离出来。
具体操作步骤如下：（1）制备磁珠：将抗体固定在磁珠表面。
（2）收集外周血或淋巴组织细胞：将外周血或淋巴组织细胞收集到离心管中。
（3）加入磁珠：将制备好的磁珠加入离心管中，与细胞混合。
（4）磁珠分离：将离心管放入磁珠分离器中，磁珠会吸附在离心管壁上，将未结合的细胞去除，留下与磁珠结合的T细胞。
（5）去除磁珠：用离心管中的磁珠去除器将磁珠去除，留下纯化的T细胞。
3. 细胞表面标记法细胞表面标记法是一种常用的T细胞分离方法。
该方法利用T细胞表面特异性抗原的抗体与荧光染料结合，将T细胞标记出来，然后通过流式细胞术进行分离。
具体操作步骤如下：（1）制备标记抗体：将特异性抗原的抗体与荧光染料结合。
（2）收集外周血或淋巴组织细胞：将外周血或淋巴组织细胞收集到离心管中。
（3）加入标记抗体：将制备好的标记抗体加入离心管中，与细胞混合。
差速离心和密度梯度离心
差速离心和密度梯度离心差速离心和密度梯度离心是常用的离心分离技术，它们在化学、生物学、医药等领域中被广泛应用。
下面对差速离心和密度梯度离心进行介绍，并进行比较。
差速离心（Differential Centrifugation）是一种基于颗粒物体在离心力作用下沉淀速度差异实现分离的方法。
它是利用物体的大小、形状、密度等差异进行分离，适用于分离一种混合物中不同颗粒物体的方法。
差速离心的步骤如下：1. 将含有混合物的试管或离心管平衡到相同的温度和压力。
2. 将混合物加入离心管中，然后将离心管放入离心机。
3. 调节离心机的转速和离心时间，使颗粒物体在离心力作用下沉淀到离心管的底部。
4. 将上清液倒出，留下沉淀物。
差速离心的优点是操作简单方便，适用于大部分样品，但缺点是仅适用于粗分离，不能实现非常细致的分离，离心速度和时间需要通过实验确定。
密度梯度离心（Density Gradient Centrifugation）是一种基于物体在不同密度梯度中离心分层的原理实现分离的技术。
它是根据物体在不同密度溶液中离心过程中向上或向下沉降速度不同来实现分离的方法。
密度梯度离心的步骤如下：1. 准备一系列密度递增的梯度介质，例如葡聚糖或硝酸铊等。
2. 将混合物溶解在梯度介质中，获得梯度溶液。
3. 将梯度溶液加入离心管中，并且保持离心管静止，等待梯度形成。
4. 将离心管放入离心机，以一定的速度离心一段时间。
5. 在离心过程中，样品中的颗粒物体会在不同密度梯度处逐渐分层。
6. 关闭离心机，将离心管从离心机中取出，通过分层取出目标物质。
密度梯度离心的优点是可以实现较为细致的分离，对样品的纯度要求比较高，并且适用于离心分离细菌、细胞、蛋白质等生物样品。
缺点是操作相对复杂，需要较长的离心时间。
差速离心和密度梯度离心的比较：1. 分离原理不同：差速离心是根据颗粒物体的大小、形状、密度等差异进行分离，而密度梯度离心是根据物体在不同密度溶液中离心过程中向上或向下沉降速度不同来实现分离。
蛋白密度梯度离心
蛋白密度梯度离心
蛋白密度梯度离心是生物学研究中常用的技术，在细胞生物学、分子生物学等领域都有应用。
该技术可以通过梯度离心分离纯化不同密度的细胞成分。
一、制备蛋白密度梯度
首先需要制备蛋白密度梯度。
一般来说，可以选用葡聚糖或者蔗糖等高分子聚合物作为梯度介质。
将所需浓度的高分子聚合物加入到离心管中，然后将管子倾斜，使得梯度形成。
需要注意的是，聚合物在倾斜过程中要缓慢加入，否则会破坏梯度结构。
二、取样
准备待检测样品，比如细胞裂解液，将其小心地加到梯度上方。
然后，将整个离心管放入离心机中，进行离心。
离心时间和速度需要根据待分离的不同细胞成分而定。
离心的目的是将样品组分在不同密度的蛋白梯度上沉积下来。
三、分析
离心结束后，将离心管从离心机中取出，从上面开始，分别取出不同密度的沉淀物，可以用于分析不同成分的纯化。
这种方法可以用于分离某些细胞中的核酸、蛋白质、膜蛋白等组分。
此外，通过在总离心中使用密度梯度，还可以分离不同种类的病毒，如冠状病毒、禽流感病毒等。
总之，蛋白密度梯度离心是一种简单而有效的生物学分离技术，已经成为了众多实验室中常见的实验手段。
它的优点显而易见：可以最大程度地紧凑化不同密度的细胞成分，从而达到纯化的目的。
密度梯度离心法取单个核细胞具体方法
实验补充知识
• 聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液， 其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖 （商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密 度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶 液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低 浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛 影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品 Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分 层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即 可配制成密度合适分层液。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。 置入另一短中管中，加入５倍以上体积的 Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟， 洗涤细胞两次。 5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛 血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞 悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球 计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
实验补充知识
• 分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳， 因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个 核细胞在1.076～1.090之间。而不同动物血中的单个核细 胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为1.088，马为 1.090。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全 血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液 上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心 管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细 胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串 钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中， 唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层 液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。
密度梯度离心法分离提纯叶绿体及叶绿体荧光染色
密度梯度离心法分离提纯叶绿体及叶绿体荧光染色课程名称：细胞生物学实验指导老师：成绩：__________________ 实验名称：密度梯度法分离提纯叶绿体及叶绿体的荧光显微镜观察同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的学习密度梯度法，分离提纯菠菜叶绿体及叶绿体的荧光显微镜观察。
二、实验原理1、一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关；2、用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部，这样，可粗略地分离叶绿体。
三、实验用品1. 材料：新鲜菠菜叶2. 器材：光学显微镜、荧光显微镜、台式高速冷冻离心机，研钵、剪刀、托盘、玻皿等3. 试剂：（1）匀浆介质（0.25 mol/L 蔗糖、0.05 mol/L Tris-HCI 缓冲液，pH7.4）（2）50%蔗糖溶液，（3）15%蔗糖溶液四、实验步骤1. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去掉叶柄、主脉后，称取2~3g ，剪碎置研钵中。
2. 加入10ml 匀浆介质于研钵中，研磨成糜状。
3. 用双层纱布过滤捣碎液到烧杯中。
4. 将滤液倒于离心管内，500rpm 离心10min ，轻轻吸取上清液。
5. 先将50%蔗糖溶液0.4ml 加入离心管，再取15%蔗糖溶液0.4ml 小心沿管壁缓缓注入，不能搅动50%蔗糖液面，使两种溶液界面可见，制成密度梯度。
6. 加入0.4ml 上清液，严格平衡离心管后，用水平转头8000r/min 离心，20min 。
7. 用滴管轻轻吸出界面处的溶液，滴于载玻片上，盖上盖玻片后，显微镜下观察。
另装订线取部分溶液在暗室内用荧光显微镜直接观察。
实验1 密度梯度离心法分离血液单个核细胞
实验1 密度梯度离心法分离血液单个核细胞姓名：李思露学号：131140040一、实验原理外周血细胞由密度不同的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板等组成。
对人血液来讲，其中红细胞密度最大，为 1.09~1.11g/L；粒细胞密度次之，为1.080~1.092g/L；单核细胞、淋巴细胞及NK细胞密度相近，为1.050~1.077g/L；血小板密度最小，只有1.030~1.060g/L；将其中的单核细胞、淋巴细胞、NK细胞等统称为外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）。
当将稀释的抗凝血叠加于适宜密度（与单个核细胞密度相近）的淋巴细胞分离液之上，经适当的离心力离心一段时间后，不同种类细胞因密度而分布于离心管的不同位置，红细胞和粒细胞密度大于分层液，沉积于管底；血小板则因密度小而悬浮在血浆中；其中与分层液密度相当的单个核细胞分布在血浆层和分层液之间的界面。
二、实验材料、试剂及器材1.材料肝素抗凝鸡血：先给注射器中吸入0.1mL 180IU／mL肝素钠溶液，鸡翅下静脉采血5mL。
肝素抗凝绵羊血。
2.试剂（1）肝素钠溶液：用生理盐水配成180IU/mL。
（2）D-Hanks液。
（3）人淋巴细胞分离液：市售。
20℃时密度应为（1.077±0.001）g/L。
3.仪器和用具10mL低速离心机、托盘天平、一次性塑料注射器、10mL离心管、胶头滴管、40mL 小烧杯等。
三、实验操作（1）稀释血液：用D-Hanks液按1：1稀释抗凝血。
（2）加样：先在10 mL离心管中加入2 mL鸡血淋巴细胞分离液，再沿管壁在距分层液界面上1 cm处缓慢加入2 mL稀释血。
应注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。
（3）离心：2000 r/min离心20 min。
（4）肉眼观察分离效果。
（5）收集PBMC：用胶头吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出PBMC，转入另一离心管。
核糖体蔗糖密度梯度离心
核糖体蔗糖密度梯度离心
核糖体蔗糖密度梯度离心是一种常用的分离纯化核糖体的方法。
下面将对这一方法的原理、步骤和注意事项进行详细介绍。
一、原理
核糖体蔗糖密度梯度离心的原理基于不同密度的物质在离心过程中会分层的特性。
在蔗糖水溶液中加入一定量的高密度物质（如葡萄糖或蔗糖），形成密度逐渐递增的梯度，将待离心的样品在梯度上离心，不同密度的物质会在不同位置分层，在离心后的梯度上可以看到不同密度的物质呈现出不同的色带，可以将其进行分离纯化。
二、步骤
1. 制备离心液：将一定量的蔗糖或者葡萄糖溶于缓冲溶液中，混合均匀，制备出密度逐渐递增的梯度。
通常梯度密度范围为10%-50%，步长为5%。
2. 供试样品制备：取核糖体样品经过若干步骤制备出适宜的离心液上样品，目的是要使样品在离心过程中能够与梯度中的不同密度层渐进性分离。
3. 离心操作：将上述制备好的供试样品小管插入到离心管中，离心速度通常为20,000g，离心时间约为4小时，温度为4℃。
4. 取样分析：离心后，可以从顶部开始分别取出每一层样品，用分光光度计或其他检测方法进行检测所需物质的含量和纯度。
三、注意事项
1. 制备梯度时应注意密度的准确性和均匀性，否则会影响到分离效果。
2. 离心时需注意平衡和使用衡量量具，以确保离心的准确性。
3. 取样时应避免混合不同密度的样品，以免影响分析准确性。
4. 离心后的样品需在低温下进行保存，以确保样品质量。
(CsCl 密度梯度离心法)
中量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）李渊越1.将菌液倒入装有50mL TB的锥形瓶中，或从培养好的平板上挑取单克隆，锥形瓶置于37℃摇床350rpm 培养16-20h,至OD600到10-12。
（OD600到40为用TBS培养基在我们的培养条件下所能达到的最高浓度，在此浓度时，菌处于对数生长期）2.将培养好的菌液到入国产50mL离心管中，每管不超过45mL。
（有实验表明，若往离心管中装入超过45mL的液体，离心后，液体的终体积仍为45mL。
因此，一次不应离超过45mL的液体，否则将污染离心机。
）3.室温离心5,000rpm，5min。
弃上清，控干。
4.加P1-RNase至终体积到7mL，震荡重悬至菌均匀分散。
（按该法最多只能裂解45mL 13OD的细菌，如需裂解更多细菌，请按比例增加。
否则将导致细菌裂解不完全，反而提到更少的菌。
）5.加14mL P2，盖上盖子，上下颠倒混匀2min。
（该步一定要混匀，以达到将细菌完全裂解的目的。
加入P2后可见溶液澄清粘稠，该步反应时间不应过久）6.加7mL P3。
（P2和P3之间反应时间不要超过5min。
混匀后可见絮状沉淀。
该步若置于冰上，沉淀效果更好。
但位于室温的反应以足以达到实验需要。
）用H2O配平至对称管重量差<0.1g。
7.室温（4度更好，但没有必要。
）离心，10,000 rpm, 5min。
8.将上清用滤纸过滤至另一国产的50mL管中。
加0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀后室温（不可置于4度。
若置于4度，将会使部分盐析出）静置10min。
（分子克隆p35）9.室温离心10,000rpm 15min。
10.弃上清，在加1.8mL H2O溶解完全后，平均分至两个1.5mL管中，再分别往每管中加入二分之一体积的PEG8000，4C沉淀2小时。
11.3,000 rcf离心3min，弃上清。
（可以不要非常完全控干）12.加1.55mL CsCl溶液溶解至沉淀完全溶解。
密度梯度离心法
骨细胞的培养及其操作原代培养：密度梯度离心法：1.取鼠龄２个月，体重70-120g的白鼠２只2.将白鼠颈椎脱臼处死，浸入盛有３００—５００ｍｌ７５％酒精的１０００ｍｌ烧杯中浸泡５ｍｉｎ3.用镊子取出后用脱脂棉擦掉多余酒精，置于培养皿内，用手术剪剪开大腿内侧皮肤和肌肉，分离出股骨和胫骨，沿肌肉白线处清除其周围的肌肉，在培养皿中用５－１０ｍｌ７５％酒精浸泡５ｍｉｎ后移入超净工作台；4.用镊子夹住大鼠股骨和胫骨放置于无菌的培养皿上方，依次用3-5ml PBS和无血清的培养基冲洗2-3次后，移入另一无菌培养基中，用镊子和骨钳固定股骨，分别用10ml注射器在骨两端钻孔。
5.用5ml注射器吸取培养基从骨一端孔处插入，从上至下缓慢冲洗骨髓腔，用下方的无菌培养皿收集骨髓悬液，重复此过程2-3次。
6.在15ml离心管中加入15mlFicoll 分离液，再将骨髓悬液沿管壁缓缓加入其上，注意一定要轻缓，不能让骨髓悬液与分离液相混合，调整骨髓悬液与分离液的体积比为2：1.7.将离心管以2000rml离心20min离心后管内物质分为3层，用吸管小心吸取中间的白膜层置于一个新的离心管内；8.在此离心管中加5ml培养基，吹打成单细胞悬液，1000rml离心5min,离心后用吸管吸取上清液并去掉，完全培养基，并轻轻吹散细胞10-20次，制成细胞悬液。
以5*10^6cell/ml的细胞密度接种于T25培养瓶中（培养瓶中培养基终体积为5ml）,置于CO2培养箱中培养，48小时后用吸管吸出全部培养液并去掉，添加新鲜培养液，以后每隔三天全量换液一次。
全骨髓培养法1）-5）同“密度梯度离心法”；6）在15ml离心管中3ml培养基，再将骨髓悬液用吸管沿管壁缓缓加入其中；7）将离心管以1000rpm离心5min,离心后用吸管吸取上清液并去掉，加入完全培养基轻轻吹散细胞10-20次，制成细胞悬液。
8）以5*10^6cell/ml的细胞密度接种于T25培养瓶中（培养瓶中培养基终体积为5ml）,置于CO2培养箱中培养，48h后用吸管吸出约一半培养液（约2.5ml）并去掉，添加2.5ml新培养液，以后每隔三天全量换液一次。
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密度梯度离心法分离P B M C
1. 在15mL 离心管中加入5mL 淋巴细胞分离液Ficoll 。
2. 取5mL 抗凝静脉血与5mL 无菌PBS 按照1：1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。
外周血，PBS ，淋巴细胞分离液最终体积比为1：1：1。
3. 水平离心400g ×30分钟。
（注意：为保证分离效果，需将离心机升降速率调至最低，即升速为1，降速为0，这样调整后，升降速会比较慢，总体离心时间约为1小时。
）
4. 离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS ，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。
在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
此外，还含有血小板。
5. 去除部分上层液体（用移液管吸取，不可倾倒），余下约1mL ，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。
置入另一15mL 离心管中，加入5倍以上体积的PBS ，离心300g ×10分钟，洗涤细胞两次。
6. 末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适量增减时间。
7. 加入10mL PBS ，离心300g ×10分钟，洗涤细胞两次。
8. 末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS 的RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。
血浆和
PBS
淋巴细胞分
离液
红细胞和粒
细胞 单个核细
胞
谢谢观赏用本法分离PBMC，每1mL全血可分离得到1~2×106 PBMC，不同人个体之间存在一定差异。
活细胞百分率在95％以上。
注意：
1.所有操作都应在无菌条件下进行。
2.在分离前Ficoll和PBS等试剂均需在37℃恒温水浴中预热半小时以上。
3.吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll，而Ficoll密度比细胞要大，因此步骤5
中需加入足量PBS稀释，若PBS体积太小可能会导致细胞无法离心收集。
谢谢观赏。