核桃蛋白肽的抗氧化活性研究

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材料与方法
材料与试剂 核桃蛋白质, 自制, 蛋白质含量 75% ; 碱性蛋白
在 1 m L 各浓度样品 ( 空白用 1 mL 蒸馏水代替 , 其他试剂依次同下) 中 , 加入 2 5 mL 质量分数为 1% 的铁 氰化 钾溶 液和 2 5 mL 的磷 酸盐 缓冲 液 ( pH 6 6, 0 2 mol/ L ) , 混匀后在 50 保温 20 min, 然后加 入 2 5 mL 质量分数为 10% 的三氯乙酸 , 混和后以 3 000 r/ min 离心 10 m in, 取上清液 2 5 mL , 加入 2 5
生物活性肽一般由 3~ 20 个氨基酸构成 , 其生理 活性功能包括促进营养吸收, 提高免疫力, 调节神经, 抗氧化 , 降血压和抗菌等
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- C, 江阴市有机化工厂 ; 葡聚糖凝胶 Sephadex G25, Sig ma 公司。其它试剂均为分析纯试剂。 1 2 主要仪器与设备 超级恒温槽 , 上海精密仪器有限公司 ; 高速离心 分离机, 上海手术机械厂 ; 电子天平, 梅特勒 - 托利多 仪器( 上海) 有限公司; L XJ- II 型离心机, 上海医分 仪器制造有限公司 ; UV m ini 1240 紫外可见分光光 度计, 日本岛津 公司; 氨基酸自动分析仪 , 美国 Agi lent 公司。 1 3 1 3 1 实验方法 核桃蛋白木瓜蛋白酶水解物的制备 )进 称取一定量的核桃蛋白, 按照酶解条件 ( 底物浓 度 4% , 酶浓度 1 500 u/ g, pH 值 8 0, 温度 40 行水解。在水 解的 过程 中不 断滴 加 0 5 mo l/ L 的 NaOH 溶液 , 使 pH 值稳定在 8 0。水解 4 h 后 , 沸水 浴灭酶 10 m in, 冷却后用 1 mol/ L H Cl 调酶解液 pH 值到 7, 在 3 000 r/ m in 下离心 15 m in, 将获得的上清 液采用截留分子质量为 3 000 u 的聚砜膜进行超滤 , 收集滤过液 , 再采用大孔树脂 DA 201- C 对 滤过液 进行脱盐处理, 最后经真空浓缩和冷冻干燥, 得到分 子质量分布在 3 000 u 以下的核桃蛋白肽产品。 1 3 2 抗氧化活性试验 核桃蛋白肽的还原能力测定[ 6] 1 3 2 1
将 2 mL 无水乙醇与 2 mL 20 mmo l/ L 的 DP P H 乙醇溶液加入同一试管中, 摇匀, 放置 30 m in, 用无水乙醇作参比于 517 nm 处测定其吸光度 A 空 ; 测定 样 品清 除 能 力时 , 将 2 m L 样品 与 2 mL 20 mmo l/ L 的 DPPH 乙醇溶 液混匀 于试管 中, 静置 30 min 后, 以同浓度样品液作为参 比测定其吸光度 A 样 。自由基清除率按下列公式计算: A 空 A样 100 A空 1 3 3 核桃蛋白肽的分子质量分布测定 清除率/ % = 采用 Sephdex G- 25 凝胶层析柱 ( 1 2 cm 80 cm) , 以 0 1 mol/ L, pH 8 0 的磷酸盐缓冲液洗脱 , 洗 脱速度为 0 5 m L/ min, 每管收集 1 mL 洗脱液 , 测定
食品与发酵工业 FOOD AND F ERME NT AT ION INDU STRIES
核桃蛋白肽的抗氧化活性研究
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刘昭明, 黄翠姬, 孟陆丽, 黄娟娟, 周文武
( 广西工学院生物与化学工程系 , 广西 柳州 , 545006) 摘 要 以 V C 为对照 , 研究了分子质量小于 3 000u 的核桃蛋 白肽混合物的还原能力 、 羟自由基清除 能力 、 超氧
。生物活性肽显示的各种
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生理活性功能与肽的氨基酸组成与序列有关 。在 食品工业中, 脂肪的氧化是影响食品的风味、 质构和 外观的主要因素 [ 3] , 具有抗氧化活性的生物活性肽可 能是潜在的天然、 安全、 高效的抗氧化剂
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。此外, 人
体在新陈代谢过程中产生的过量的自由基会对机体 产生损伤 , 为避免自由基造成的机体伤害, 防止疾病, 在膳食中加入具有抗氧化功能的外源性抗氧化物质, 可能会对促进人类健康, 延年益寿有重要的作用。 已有的研究表明 , 抗氧化生物活性肽具有清除体 内自由基的功能 , 也是一种潜在的可以利用的外源性 抗氧化物质
2+ [ 7]
各 管 的 OD 280 。 标 准 分 子 量 物 质 采 用 杆 菌 酶 ( M W 1 450) 和谷胱甘肽 ( M W 307) 。 1 3 4 核桃蛋白肽的氨基酸组成分析 在适量核桃蛋白肽中加 入 6 mo l/ L H Cl 溶液 , 真空封口, 在 110 下水解 24 h, 冷却后定容、 过滤 , 采用氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成分析。色谱 条件: 柱温 : 40 , 流速: 1 0 mL / m in, 紫外检测器 : 338 nm , 262 nm 。
研究报 告
mL 蒸馏水和 0 5 mL 质量分数为 0 1% 的 F eCl3 , 混 匀后在 700 nm 波长下比色, 记录吸光度值。以 V C 作为对照。吸光度值越大则样品的还原能力越强。 1 3 2 2 核桃蛋白肽的羟自由基( OH ) 清除能力 的测定 采用 邻 二氮 菲 -Fe 氧 化 法 。( 1 ) 取 1 5 mmo l/ L 的邻二氮菲溶液 1 m L 于试管中 , 依次加入 磷酸盐缓冲液 PBS( 0 2 m ol/ L , pH 7 4) 2 mL 和蒸馏 水 1 mL 、 0 75 m mol/ L 硫酸亚铁液 1 mL , 充分混匀, 加体积分数为 0 01% 的 H 2 O2 1 mL , 于 37 下恒温 反应 45 m in, 于 536 nm 处测其吸光度( A P ) , ; ( 2) 同 前步 , 惟其中用 1 m L 蒸馏水代替 H 2 O 2 , 测得的吸光 度称 A B ; ( 3) 用试样液 1 mL 代替( 1) 中的 1 mL 蒸馏 水, 测得到吸光度称 A S ; OH 自由基清除率计算公 式如下: 清除率 / % = 1 3 2 3 AS AB AP AP 100 )
[ 8] [ 9]
从图 1 中可以看出, 在试验浓度范围 , 随着核桃 蛋白肽浓度的增加, 其还原能力增强。但是 V C 的还 原能力在浓度达到 0 5 mg/ mL 之前 , 其还原能力随 浓度的增加而增大; 0 5 m g/ m L 之后, 其还原能力则 有缓慢下降的趋势。在 浓度为 30 mg/ mL 时, 核桃 蛋白肽还原能力达到 V C 的 57 1% 。 2 2 核桃蛋白肽的羟自由基( OH ) 清除能力 在浓度 10~ 50 mg / mL , 比较 了核桃 蛋白肽 和 ) 清除能力 , 如图 2 所示。
图3 核桃蛋白肽对超氧阴离子的清除作用
主 要 分 布 在 2 个范 围。与 标 准 分 子 量 的 杆 菌 酶 ( M W 1 450) 和谷胱甘肽 ( M W 307) 的洗脱体积比较可 知 , 核桃蛋白肽的分子质量在 1 450u 以上的有一部 分 , 而分子质量在 307u 和 1 450u 之间的则占了稍大 比例。 2 6 核桃蛋白肽的氨基酸组成 采用氨基酸自动分析仪测定核桃蛋白肽氨基酸 组成, 结果见表 1。
图 1 核桃蛋 白肽的还原能力
水, 再加入 100 L 的 0 45 mol/ L 邻苯三酚溶液, 振 荡并计时, 3 m in 时, 立 即加入 100 L 质量分 数为 3% 的抗坏血酸溶液 , 振荡, 终止反应 , 在 325 nm 处 测吸光度 A 。以空白的吸光度为 A 空 , 加样品溶液时 的吸光度为 A 样 , 自由基清除率计算 : A 空 A样 清除率/ % = 100 A空 1 3 2 4 ( DP PH 核桃蛋白肽对二苯代苦 味酰基自由基的 ) 的清除能力的测定
[ 5]
。近年来, 有关食品蛋白质水解制备抗
氧化活性肽的研究逐步增多。核桃仁是传统的保健 食品 , 含有 20% 左右的蛋白质。本 试验是以核桃蛋 白为底物 , 采用碱性蛋白酶水解核桃蛋白 , 经超滤和 脱盐工序后, 制得分子质量小于 3 000u 的核桃蛋白 肽混合物 , 对其还原能力、 羟自由基清除能力、 超氧阴 离子自由基清除能力以及二苯代苦味酰基自由基清 除能力进行了研究。
酶 Alcalase 2 4 L , 丹麦 N ovo 公司 ; 大孔树脂 DA201
第一作者 : 硕士 , 副教授。 * 广西区教育厅科研立项项目 ( 200708LX 184 收稿日期 : 2008- 08- 14, 改回日期 : 2008- 11- 14
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同的浓度点, 二者对羟自由基 ( OH
) 清除能力基本
采用 Sephdex G - 25 凝 胶 层 析 , 得 杆 菌 酶 ( M W 1 450) 和谷胱甘肽 ( M W 307) 的洗脱体积分别为 23 m L 和 44 m L, 质量浓度为 1% 核桃蛋白肽的凝胶 层析图谱见图 5。
相同。在浓度为 10 mg/ mL 时 , 核桃蛋白肽和 V C 对 羟自由基 ( OH ) 的清除率分别是 48 1% 和 50 0% , 在浓度为 50 m g/ m L 时, 核桃蛋白肽和 V C 对羟自由 基( OH ) 的清除率分别 69 1% 和 67 2% 。
阴离子自由基清除能力以及二苯代苦味酰基自 由基清除能力 。 结 果显示 , 随着核 桃蛋白 肽浓度 的增加 , 其还 原 能力 、 羟自由基的清除能力和超氧阴离子清除能力增大 , 在浓度 为 30 mg / mL 时 , 核桃蛋 白肽还 原能力 达到 VC 的 57 1% ; 在浓度为 50 mg/ mL 时 , 核桃蛋白肽对羟自由基 ( OH ) 的清除率分别 69 1% , 对超氧 阴离子自由 基 的清除率达到了 85% 。 而对二苯代苦 味酰基 自由基 清除能力 则是先 增大后 变小 , 在 20 mg/ mL 时达到 最大 值 66% 。 核桃蛋白肽的分子质量分布主要有 2 大区域 , 蛋白肽氨基酸含量达到 89 74% 。 关键词 核桃蛋白肽 , 抗氧化活性 , 自由基
表1
氨基酸种类 天冬氨酸 苏氨酸 丝氨酸 谷氨酸 甘氨酸 丙氨酸 胱氨酸 缬氨酸 蛋氨酸
从图 3 可见, 在试验测定的范围内 , V C 对超氧阴 离子自由基的清除率基本一致, 达到了 99% 。随着 浓度的增大, 核桃蛋白肽对超氧阴离子自由基的清除 能力逐步增大, 在浓度为 50 mg / mL 时 , 核桃蛋白肽 对超氧阴离子自由基的清除率达到了 85% 。 2 4 核桃蛋白肽的二苯代苦味酰基自由基 ( DPPH ) 清除能力 在浓度 10~ 50mg / mL , 比较了核桃蛋白肽和 V C 对二苯代苦味酰基自由基( DPP H ) 的清除能力, 见 图 4。
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2 3 核桃蛋白肽的超氧阴离子自由基 ( O2 除能力
) 的清
在浓度 10 ~ 50 mg / mL , 比 较了核桃 蛋白 肽和 V C 对超氧阴离子自由基的清除能力 , 见图 3。
图5
Sephadex G- 25 凝胶层析测核桃 蛋白肽的分子质量分布
从图 5 可知 , 核桃蛋白肽 在洗脱体积 38 m L 和 53 m L 有最大的洗脱峰, 说明核桃蛋白肽的分子质量
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结果与讨论
核桃肽的还原能力 为便于比较 , 将不同浓度的核桃蛋白肽的还原能
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力与对应浓度的 V C 的还原能力进行比较 , 结果见图 1。
核桃蛋白肽的超氧阴离子自由基 ( O 2
的清除能力的测定 采用邻苯三酚方法 [ 5] 。在一系列的试管中加 3 mL 0 05 mol/ L 的 T ris - H Cl 缓冲液 ( pH 8 2) , 分别 加入待测样品溶液 100 L, 空白组加入同体积蒸馏
V C 对羟自由基( OH
图2
核桃蛋白肽对羟自由基的清除能力
从图 2 中可以看出, 随着浓度的增大 , 核桃蛋白 肽和 V C 对羟自由基 ( OH ) 清除能力均增大。在相
2009 年第 35 卷第 1 期 ( 总第 253 期 )
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