重金属诱导拟南芥原生质体DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测
单细胞凝胶电泳检测镉对中华倒刺钯肝细胞DNA的损伤
有限公司 ） ， 水 平电泳槽 和电泳仪 （ 北京六一 仪器厂） ， 荧光显 微镜 （ Ｎ ｉ ｋ ｏ ｎ ９ ０ ｉ ） 等。
１ ． ３ 试 验 方 法
无水氯化镉（ Ｃ ｄ Ｃ １ ， ＞９ Ｉ ９ ％， Ａ ｌ ｆ ａ Ａ ｅ ｓ ａ ｒ ） 、 低 熔点琼脂糖 、 Ｔ ｉ ｒ ｔ ｏ ｎ—Ｘ １ ０ ０ （ 聚乙二醇辛基苯基醚 ） 、 二 甲基亚砜 （ Ｄ Ｍ Ｓ Ｏ） 、 溴化 乙锭 （ Ｅ Ｂ） 、 Ｅ Ｄ Ｔ Ａ、 ｒ ｉ ｆ ｓ （ 上海 生工生 物工 程股份 有 限公
１ ． ３ ． １ 毒性试验
试 验 温 度设 为 （ ２ ５± １ ）ｏ Ｃ， 采 用 静 水 法 生
物测试 ， 试 验 期 间不 更 换 药 液 。
我 国《 渔业水质标准》 镉 含量标准为 ≤０ ． ０ ５ ｍ ｇ ／ ｋ ｇ ； 我 国 《 地表水环境质量标准》 镉 含量标准 为：Ｉ 类 ≤Ｏ ． ０ ０ １ ｍｇ ／ ｋ ｇ ，
中图分类号 ： Ｘ１ ７ 文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ２—１ ３ ０ ２ （ ２ ０ １ ３ ） ０ １ — ０ ２ ７ ５— ０ ２
２ ０ １ ２年广西龙 江镉 污染事件影 响很大 ， 部分水体镉 含量 严重超标 。在污染 严 重水 域 ， 镉含 量超 《 地 表水 环 境质 量标
摘要 ： 以 中华倒刺鲤为研究对象 ， 利用单细胞凝胶 电泳技术检测不 同浓度 的氯化镉 对倒刺鲍 肝细胞 Ｄ Ｎ Ａ的损伤
作用 ， 检测指标包括尾部 Ｄ Ｎ Ａ含量 、 尾长 、 尾矩 、 Ｏ ｌ ｉ ｖ ｅ 尾矩 。结果显 示 ， 低 浓度 的镉虽然 并不会 引起试验 鱼 明显 的中 毒症状 ， 但 已经对肝脏 Ｄ Ｎ Ａ产 生损伤 。０ ． ０ １ ｍ ｇ ／ ｋ ｇ组 ４个指标 与对照组无显著差 异 ； ０ ． ０ ５ ｍ ｇ ／ ｋ ｇ组尾部 Ｄ Ｎ Ａ含量 、
单细胞凝胶电泳
30min。
8. 染色观察
• 用20μg/L的吖啶橙（一种荧光色素，其检
测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。 它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发 出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光， 与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。 ）染
色3－5min，用双蒸水洗掉表面的染料， 24小时内在荧光显微镜下观察。
0.5%LMA 载玻片 1%NMA 0.8%NMA
4. 裂解
• 将制好的凝胶放入冷的裂解液中，4℃ 下裂解2小时； • 裂解液使用时新配:
90ml裂解液（十二烷基磺酸钠 SDS） 10ml DMSO（二甲基亚砜） 1ml Trion-X100裂解液中将载玻片取出，在蒸 馏水中洗去过多盐，晾干。 • 将新配制的电泳缓冲液倒入电泳 槽中，约覆过载玻片 0.25cm ，盖 上盖子，在高 pH 电泳缓冲液中放 置20 min以便DNA解螺旋。
• 经碱处理和在碱性电解质的作用后，DNA 解旋，损伤的DNA断链及其片段会被释放 出来，而在电泳条件下， DNA片段可进入 凝胶孔隙发生迁移。由于这些DNA分子量 很小，所以在电泳过程中会离开核DNA向 正极移动，形成彗星状的图像。 • 在一定条件下，DNA迁移距离和DNA含量分 布与DNA损伤程度呈线性相关。随着DNA损 伤程度加剧，断片数目增加，表现为尾部 DNA含量增加，彗尾延长，荧光强度加强。
实验十七
实验十七 单细胞凝胶电泳技术
单细胞凝胶电泳技术
——丁书茂
• 单细胞凝胶电泳技术(single cell gel electrophoresis, SCGE) ，也称彗星试验 (comet assay) ，是Ostling O和Johanson KJ首次提出，后经Singh等进一步完善的一 种在单个细胞水平上检测DNA损伤、交联和 修复的方法。因其简单、灵敏、低耗、快速 等优点而广泛应用于生物检测、遗传毒理、 流行病学调查等诸多方面。
单细胞凝胶电泳技术应用进展
又被称为“ 彗星电泳” ］ 细胞的生物膜在细胞裂解液的作用下被破坏， ［． ７ 使细胞内的 Ｄ Ａ 蛋白质及其 Ｎ 、 他成分进入凝胶， 继而扩散到裂解液中， 惟有核 Ｄ Ａ仍 附着在剩余的核骨架上而 留在原位 ． Ｎ 如果细胞 未受损伤， 电泳中核 Ｄ Ａ停留在核基质中， Ｎ 经荧光染色后呈现 圆形 的荧光团， 无拖尾现象 ． 若细胞受
到损伤， 在碱性电泳液（Ｈ＞１） Ｄ Ａ双链解螺旋且碱变性为单链， ｐ ３ 中， Ｎ 单链断裂的碎片离开核 Ｄ Ａ向 Ｎ 阳极迁移， 形成拖尾 ． 细胞核 Ｄ Ａ受损伤越严重， Ｎ 产生的断链或碱变性碎片就越多， 片断也越小， 电泳 表现为彗星尾越长和彗尾越亮［ ． ８ 通过荧光显微镜观察有无彗星及彗尾的长度、 】 亮度、 出尾率等， 判断
以研究活细胞 Ｄ Ａ的损伤， Ｎ 还可以研究死细胞的 Ｄ Ａ损伤， Ｎ 从而避免了只能用活细胞 （ 如染色体畸 变、 微核、 姐妹染色单体互换等） 的限制， 因而其对于建立动物模型深入探讨运动性氧应激与 Ｄ Ａ损伤 Ｎ 的分子生物学机制仍不失为一种优越的研究方法 ． 同时，Ｃ Ｅ技术也将为运动性疾病和运动性疲劳的早期诊断提供更有效 的实验方法和手段 ． ＳＧ 在 使用单细胞凝胶电泳技术在运动医学中的应用得 出结论 ：Ｃ Ｅ技术 由于需样品量少， Ｄ Ａ损伤检 ＳＧ 对 Ｎ 出的灵敏性高， 无需同位素标记， 技术简单、 费用低， 能够快速、 准确检测有害物质存在场所中各类人群 的 Ｄ Ａ损伤及筛检对 Ｄ Ａ损伤因素敏感的高危人群 ． Ｎ Ｎ
速、 低耗 等优 点 ， 因此被 广泛应 用在 Ｄ ＮＡ的损 伤与 修复 、 传 毒理 、 境监 测 以及氧 化 应 激和 细胞 凋亡 遗 环
等研 究中［１ ６．
１ 单细胞凝胶电泳技术原理
【国家自然科学基金】_单细胞凝胶电泳试验_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140731
推荐指数 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
科研热词 dna损伤 造血细胞 苯并[a]芘 臭氧 脐血 皮肤变态反应 氯化消毒 染色体损伤 单细胞凝胶电泳 体外扩增 五氯酚钠 hepg2细胞 dna聚合酶β
推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
科研热词 dna损伤 镍 重金属 细胞毒性试验,免疫 细胞增殖 细胞凋亡 氧化性dna损伤 拟南芥 彗星试验 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐 原生质体 单细胞凝胶电泳 pm10 nf-κ b抑制剂 k562细胞 hepg2细胞 dna链断裂
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
科研热词 彗星试验 氧化应激 抗氧化剂 微生物 保护 高甲基化 肝肿瘤/遗传学 细胞恶性转化 红芪/药理学 氯化镉 有机污染物 多糖类/药理学 x线/副作用 n-乙酰半胱氨酸 mgmt dna损伤/辐射效应 dna损伤
2008年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
科研热词 dna损伤 锰 细胞毒性 纳米碳 纳米氧化锌 环境污染 小鼠胚胎成纤维细胞 单细胞凝胶电泳(scge) sh-sy5y pcb153 pbde-47 dna修复基因
推荐指数 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
推荐指数 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
2011年 科研热词 推荐指数 dna损伤 2 马粪海胆 1 马氏珠母贝 1 血淋巴细胞 1 荧光原位杂交技术 1 苯并[a]芘 1 细胞增殖 1 甲醛 1 检测 1 损伤与修复 1 彗星试验 1 彗星拖尾 1 应用 1 基因损伤 1 单细胞水平 1 单细胞凝胶电泳( scge) 1 单细胞凝胶电泳 1 0 #柴油 1
李韶山教授简介
李韶山教授简介李韶山，广东省珠江学者特聘教授。
1992年在华南师范大学获理学博士学位；曾留学瑞典Lund University和Örebro University以及美国College of William & Mary。
现任华南师范大学生命科学学院副院长，生态学专业博士生导师。
多年来从事植物生理生态学研究，主要研究方向是植物紫外辐射（UV-B）效应的细胞和分子机理研究、植物对重金属污染的分子响应和生态毒理、微生物与植物根系的相互作用、以及入侵植物的生态适应性和比较基因组学研究。
已主持承担多项国家自然科学基金、教育部博士点基金、教育部留学回国人员科技项目以及广东省高层次人才项目等。
在国际、国内重要学术刊物发表的代表性论文（标注*为通讯作者）：1.Jiang Lei, Wang Yan, Li Qianfeng, Björn LO, He Junxian, Li Shaoshan*.Arabidopsis STO/BBX24 negatively regulates UV-B signaling by interacting with COP1 and repressing HY5 transcriptional activity.Cell Research, 2012, 22:1046-1057 (IF=10.526)2.Qin Rong, Zhang Huaning, Li Shaoshan, Jiang Wusheng, Liu Donghua*. Threemajor nucleolar proteins migrated from nucleolus to nucleoplasm and cytoplasm in root tip cells of Vicia faba L. exposed to aluminum. Environmental Science and Pollution Research, 2014, 21: 10736-10743（IF=2.681）3.Gong Ni, Wang Yutao, Björn L O, and Li Shaoshan*. DNA C-values of 20invasive alien species and 3 native species in south China. Archives of Biological Sciences, 2014, 66(4): 1465-1472 (IF=0.607)4.Chen Yong, Zou Shenshen, Zhou Fan, Yu Sidney, Li Shaoshan, Li Dan, SongJingzen, Li Hui, He Zhiyi, Hu Bing, Björn L O, Liang Yongheng*, Xie Zhiping, Segev Nava*. A Vps21 endocytic module regulates autophagy. Molecular Biology of the Cell, 2014, 25: 3166-3177 (IF=4.548)5.Zou Shenshen, Chen Yong, Liu Yutao, Segev N, Yu S, Ye Min, Zeng Yan, MinGaoyi, Zhu Xiaoping, Hong Bing, Björn LO, Liang Yongheng*, Li Shaoshan*, Xie Zhiping*.Trs130 and Trs65 regulate autophagy through GTPases Ypt31/32 in Saccharomyces cerevisiae.Traffic 2012, , DOI: 10.1111/tra.12024 (IF=4.919)6.Chen Da, Wang Yan, Yu Lehuan, Luo Xiaojun, Mai Bixian, Li Shaoshan*. 2013.Dechlorane plus flame retardants in terrestrial raptors from northern China.Environmental Pollution, 2013, 176: 80-86 (IF=3.746)7.Björn LO*, Li Shaoshan. Teaching about photosynthesis with simple equipment:Analysis of light-induced changes in fluorescence and reflectance of plant leaves.Photosynthesis Research, 2013, 116: 349-353 (IF=3.243)8.Björn LO*, Uvdal P, and Shaoshan Li. Ecological importance of the thermalemissivity of avian eggshells. Journal of Theoretical Biology, 2012, 301: 62-66 (IF=2.371)9.Jiang Lei, Wang Yan, Björn LO, Li Shaoshan*. UV-B-induced DNA damagemediates expression changes of cell cycle regulatory genes in Arabidopsis root tips. Planta, 2011, 233: 831-843 (IF=3.372)10.Wang Yan, Smith W, Wang Xiaodong, Li Shaoshan. Subtle biological responsesto increased CO2 concentrations by Phaeocystis globosa Scherffel, a harmful algal bloom species. Geophysical Research Letters, 2010, 37, L09604, DOI:10.1029/2010GL042666 (IF=3.204)11.Jiang Lei, Wang Yan,Björn LO, Li Shaoshan*. ArabidopsisRADICAL-INDUCED CELL DEATH1 is involved in UV-B signaling.Photochemical and Photobiolgy Sciences, 2009,8: 838-846 (IF=2.708)12.Kalbina I, Li Shaoshan, Kalbin G, Björn LO, Strid Å*. Wavelength dependenceof expression of UV-B-induced molecular markers in Arabidopsis thaliana.Functional Plant Biology, 2008, 35: 222-227 (IF=2.375)13.Jiang Lei, Wang Yan, Li Shaoshan*. Application of the comet assay to measureDNA damage induced by UV radiation in the hydrophyte, Spirodela polyrhiza.Physiologia Plantarum, 2007, 129: 652-657 (IF=2.708)14.Li Shaoshan, Kalbin G, Olsman H, Pettersson M, Engwall M, Strid Å*, Effects ofUV-B in biological and chemical systems: Equipment for wavelength dependence determination. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2005, 65: 1-12 (IF=1.286)15.Li Shaoshan and Strid Å*, Anthocyanin accumulation and changes in CHS andPR-5 gene expression in Arabidopsis thaliana after removal of the inflorescence stem (decapitation). Plant Physiology and Biochemistry, 2005, 43: 521-525(IF=2.485)16.Li Shaoshan*, Wang Yan, Björn LO, Effects of temperature on UV-B-inducedDNA damage and photorepair in Arabidopsis thaliana. Journal ofEnvironmental Sciences, 2004, 16: 173-176 (IF=1.412)17.Li Shaoshan, Paulsson M, Björn LO, Temperature-dependent formation andphotorepair of DNA damage induced by UV-B radiation in suspension-cultured tobacco cells. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology, 2002,66 : 67-72 (IF=2.708)18.Li Shaoshan, Wang Yan, Wang Xiaojing, Bin Jinhua and Liu Songhao. CPDsaccumulation in relation to UV-B sensitivity in rice cultivars. Acta Botanica Sinica, 2000, 42 (6): 576-581 (IF1.395)19.汪骢跃†、王宇涛†、曾琬淋、李韶山*，钙和钾对拟南芥幼苗镉毒害的缓解作用。
重金属诱导拟南芥原生质体DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测_聂志刚
植物学报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ２００９， ４４ （１）： １１７−１２３， ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ收稿日期： ２００７－１０－１７； 接受日期： ２００８－０１－０７基金项目： 国家自然科学基金（Ｎｏ．３０３７０１２６、３０４７０２８３和３０６７０１５６）、教育部留学回国人员科研启动基金（Ｎｏ．２００５－３８３）、广东省教育厅自然科学研究项目（Ｎｏ．Ｚ０２０１８）和高等学校博士学科点专项科研基金（Ｎｏ．２００７０５７４００３）＊ 通讯作者。
Ｅ－ｍａｉｌ： ｌｉｓｈｓｈ＠ｓｃｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．技术方法．重金属诱导拟南芥原生质体ＤＮＡ损伤的单细胞凝胶电泳检测聂志刚１ ， 王艳１， ２ ， 李韶山１＊１华南师范大学生命科学学院， 广东省高等学校生态与环境科学重点实验室， 广州 ５１０６３１２暨南大学理工学院， 广州 ５１０６３２摘要 以拟南芥原生质体为实验体系， 研究不同浓度的３种重金属离子对拟南芥原生质体的毒性和ＤＮＡ损伤的差异。
结果表明， 用１－５ ｍｍｏｌ．Ｌ－１的Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋ 和Ｃｕ２＋分别处理的拟南芥原生质体， ２ 小时内活力逐渐下降， 并表现出明显的浓度依赖性；与相同浓度的Ｃｄ２＋ 和Ｃｕ２＋ 相比， Ｚｎ２＋对拟南芥原生质体活力的影响程度较小， 表现出较低的毒性。
单细胞凝胶电泳检测发现，用０．１－０．８ ｍｍｏｌ．Ｌ－１的Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋ 和Ｃｕ２＋ 分别处理拟南芥原生质体３０ 分钟， 以ＯＴＭ值表示的原生质体ＤＮＡ损伤量随重金属离子浓度的增加而递增； 相同浓度（０．５ ｍｍｏｌ．Ｌ－１）的３种重金属离子相比， Ｚｎ２＋对原生质体的遗传毒性明显低于Ｃｕ２＋ 和Ｃｄ２＋。
综合原生质体活力和ＤＮＡ损伤的单细胞凝胶电泳检测结果， 发现Ｚｎ２＋对拟南芥原生质体的遗传毒性较低， 而Ｃｄ２＋ 和Ｃｕ２＋的遗传毒性较高。
本研究建立的拟南芥原生质体实验体系， 结合运用单细胞凝胶电泳技术， 能够快速、灵敏地检测重金属对植物细胞的遗传毒性。
重铬酸钾致鲫鱼肝细胞DNA损伤作用研究
重铬酸钾致鲫鱼肝细胞DNA损伤作用研究饶朝龙;刘天强;黄冠军;刘衍鹏;肖丹【摘要】目的建立鲫鱼肝细胞彗星试验方法.检测重铬酸钾致鱼肝细胞DNA损伤作用.方法制备鲫鱼原代肝细胞悬液,以0.5,0.25和0.1 mM重铬酸钾染毒细胞1.5 h,彗星试验检测细胞DNA损伤.结果重铬酸钾各浓度作用组细胞平均拖尾长度和拖尾细胞率存在剂量反应关系,且0.5和0.25 mM作用组细胞平均拖尾长度与阴性对照组之间差异具有统计学意义(P<0.05).结论鲫鱼肝细胞彗星试验方法成功建立,重铬酸钾具有致鱼肝细胞DNA损伤作用.【期刊名称】《四川解剖学杂志》【年(卷),期】2010(018)002【总页数】2页(P16-17)【关键词】重铬酸钾;鲫鱼;肝细胞;彗星试验;DNA损伤【作者】饶朝龙;刘天强;黄冠军;刘衍鹏;肖丹【作者单位】成都中医药大学,成都,610075;通威股份有限公司,成都,610041;通威股份有限公司,成都,610041;通威股份有限公司,成都,610041;成都中医药大学,成都,610075;通威股份有限公司,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】R994.6鱼类生活于水生生态环境中,具有对水生环境污染物生物浓集,且对DNA损伤修复能力差等特点,常被作为一种敏感的生物标记物。
单细胞凝胶电泳试验(彗星试验),是一种检测基因组DNA损伤和修复的重要方法,已在诸多领域得到了广泛应用,但目前尚未见直接以鱼肝细胞为材料的彗星试验的相关报道。
重铬酸钾是常见的工业毒物和环境污染物,并具有较强的致DNA损伤作用,可引起细胞DNA链断裂、DNA-DNA交联、DNA-蛋白质交联和铬-DNA加合物等多种遗传危害,因而在毒理学研究中常作为阳性对照[1]。
本研究拟建立鲫鱼肝细胞彗星试验方法,并应用于重铬酸钾致鱼肝细胞DNA损伤作用的检测。
1 材料与方法1.1 实验材料与设备健康未成年鲫鱼,每尾约60克,由通威水产科技园提供。
单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤的方法及进展_赵琳娜
DNA 交联损伤 、 伤、 检测 DNA 加合物修复的切除位点 。 另一方面与荧光原位杂交技术相结合， 利用不同的探 针能 够 检 测 到 该 基 因 在 癌 症 病 理 样 本 DNA 中 的 丰 ［3 ］ FISH 技术检测到与癌症 度 ， 很多科研组利用 Comet［2 ， 4 ］ 。 由于彗星电泳技术与其 发生相关的染色体位点 他检测 DNA 损伤技术相比具有灵 敏 度 高 、 所需样本
［17 ］ 迁移仅表现 SSB， 此时 ALS 不能表达 。 所以在 pH 值大于 13 条件下 DNA 迁移比 pH 值等于 12. 1 有所增 ［16 ］
单细胞凝胶电泳技术（ single cell gel electrophoresis，SCGE） 又称“彗星电泳 ” （ comet assay ） ， 是一种常 用的检测 DNA 损伤的技术。1984 年 stling 和 Johanson 首 先 提 出 利 用 凝 胶 电 泳 技 术 来 检 测 单 个 细 胞 的 DNA 损伤， 但他们所采用的中性电泳条件仅能检测双 strand breaks，DSB ） ， 链 DNA 断裂（ double这在很大程 ［1 ］ 度上限制了该技术的应用 。 但在接下来的几十 年 里， 彗星电泳技术得到了飞速的发展， 一方面在改变自 双 链 DNA 的 断 裂 损 身实验条件下能够检测到单链 、
85
生 物 学 杂 志 Vol. 30 No. 3 2013 Jun， JOURNAL OF BIOLOGY
第 30 卷第 3 期 2013 年ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ6 月
单细胞凝胶电泳技术及在土壤生态毒理学中的应用
单细胞凝胶电泳技术及在土壤生态毒理学中的应用3林爱军 耿春女 朱永官33 童依平(中国科学院生态环境研究中心土壤环境研究室,北京100085)摘 要 单细胞凝胶电泳技术又称为彗星实验,是最近几年发展起来的一种快速、简单、灵敏、可靠的检测细胞核DNA 损伤的技术。
总结了近几年来单细胞凝胶电泳技术的发展、原理、方法及其应用,并指出其下一步的发展趋势。
彗星实验中,镶嵌于琼脂糖中的细胞核在电场中向正极移动,因细胞核与DNA 片段迁移速率不同,而形成类似“彗星”的图像。
目前采用的彗星实验有多种,可以检测诸如DNA 双链断裂、单链断裂、碱不稳定位点等多种类型的DNA 损伤。
碱性彗星实验因其高灵敏度而被广泛采用。
彗星实验的主要步骤包括细胞核悬浮液的获得、彗星电泳胶板制备、细胞裂解、DNA 变性解旋、电泳、中和、染色和观察等。
目前彗星实验广泛应用于各个研究领域,近年来开始用于环境污染的基因毒性研究和生物监测,并取得了迅速发展。
关键词 单细胞凝胶电泳,DNA 损伤,基因毒理中图分类号 X835.2 文献标识码 A 文章编号 1000-4890(2005)08-0975-05Single cell gel electrophoresis technique and its applications in soil ecotoxicology.L IN Aijun ,GEN G Chunn ü,ZHU Y ongguan ,TON G Y iping (Depart ment of Soil Environmental Sciences ,Research Center f or Eco 2Environmental Sciences ,Chinese Academy of Sciences ,Beijing 100085,China ).Chinese Journal of E 2cology ,2005,24(8):975～979.The single cell gel electrophoresis technique (comet assay )is a simple ,sensitive ,reliable ,and rapid method to detect DNA damage in eukaryotic cells.The paper reviewed the principles ,advances and methodology of comet assay ,and its applications in soil ecotoxicology ,with its development in future predicted.Nuclei embedded in low 2melting 2point agrose in an agar gel sandwich migrated towards the anode under an electrical current with a different rate from that of DNA strands presented the appearance of a “comet ”.Different techniques are available with different sensitivity to detect DNA damages such as double strand breaks ,single strand breaks ,delay DNA repair sites and alkali labile sites.The basic procedure of the technique included cell sus pension preparation ,slide preparation ,lysis ,unwinding ,electrophoresis ,neutralization ,dying and view.The method has been widely used in several areas in the past few years ,especially in genotoxicology research in environmental biomonitoring.K ey w ords single cell gel electrophoresis ,DNA damages ,genotoxicity.3中国科学院知识创新重大项目(KZCX12SW 219)、国家重点基础研究发展规划项目(2002CB410808)及中国科学院“百人计划”资助项目。
单细胞dna彗星实验步骤
单细胞dna彗星实验步骤彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish 分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。
《拟南芥ZincNutritionEssential1(ZNE1)锌转运蛋白的功能鉴定》范文
《拟南芥Zinc Nutrition Essential 1（ZNE1）锌转运蛋白的功能鉴定》篇一一、引言植物在生长和发育过程中，需要吸收和转运各种必需的营养元素，其中锌（Zn）是植物生长的关键微量元素之一。
锌在植物体内具有多种生理功能，包括参与酶的活性调节、基因表达调控以及细胞结构维持等。
拟南芥作为一种重要的模式植物，其Zinc Nutrition Essential 1（ZNE1）锌转运蛋白在锌的吸收、转运和分配过程中发挥着重要作用。
本文旨在通过对ZNE1锌转运蛋白的功能鉴定，探讨其在植物锌营养中的作用机制。
二、材料与方法2.1 材料本实验以拟南芥为研究对象，通过基因克隆技术获取ZNE1基因。
实验所用药品、试剂及培养基等均为市售优质产品。
2.2 方法2.2.1 基因克隆与表达分析利用PCR技术从拟南芥基因组中扩增ZNE1基因，构建过表达和沉默表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化法将载体转入拟南芥中，获得过表达和沉默表达株系。
2.2.2 生理指标测定测定野生型和转基因型拟南芥在不同Zn浓度下的生长状况、叶绿素含量、Zn含量等生理指标。
2.2.3 亚细胞定位及互作蛋白鉴定通过荧光标记技术对ZNE1进行亚细胞定位，同时利用酵母双杂交等技术鉴定ZNE1的互作蛋白。
三、结果与分析3.1 ZNE1基因的克隆与表达分析成功克隆了ZNE1基因，并构建了过表达和沉默表达载体。
将载体转入拟南芥中，获得了稳定的过表达和沉默表达株系。
通过对转基因株系的表达分析，发现ZNE1的表达水平发生了显著变化。
3.2 生理指标测定结果在不同Zn浓度下，野生型和转基因型拟南芥的生长状况、叶绿素含量和Zn含量等生理指标存在显著差异。
在Zn缺乏条件下，过表达ZNE1的拟南芥表现出更好的生长状况和更高的Zn含量；而沉默ZNE1的拟南芥则表现出生长受抑和Zn含量降低的现象。
这表明ZNE1在植物锌营养中发挥重要作用。
3.3 亚细胞定位及互作蛋白鉴定结果通过荧光标记技术发现ZNE1主要定位在细胞膜和细胞质中。
《拟南芥ZincNutritionEssential1(ZNE1)锌转运蛋白的功能鉴定》范文
《拟南芥Zinc Nutrition Essential 1（ZNE1）锌转运蛋白的功能鉴定》篇一一、引言锌是植物生长和发育过程中不可或缺的微量元素，对植物的生命活动起着至关重要的作用。
拟南芥作为植物生物学研究的模式植物，其Zinc Nutrition Essential 1（ZNE1）蛋白在锌转运过程中扮演着关键角色。
本文旨在通过对ZNE1锌转运蛋白的功能进行鉴定，为进一步了解其在植物锌营养代谢中的作用提供理论依据。
二、材料与方法1. 材料准备本实验所用的材料为拟南芥野生型及ZNE1基因敲除型植株。
实验所用药品和试剂均为分析纯，实验所使用的仪器设备包括分光光度计、PCR仪、显微镜等。
2. 方法（1）基因克隆与表达分析：通过PCR技术扩增ZNE1基因，构建表达载体，并转化至大肠杆菌中进行表达分析。
（2）转基因植物构建：利用农杆菌介导法将ZNE1基因转入拟南芥中，获得转基因植物。
（3）生理生化指标测定：测定野生型和转基因型拟南芥在不同锌浓度下的生长状况、锌含量、抗氧化酶活性等生理生化指标。
（4）亚细胞定位：利用GFP标签技术对ZNE1蛋白进行亚细胞定位，观察其在细胞中的分布情况。
（5）功能鉴定：通过敲除ZNE1基因和过表达ZNE1基因的方法，分析ZNE1在锌转运过程中的作用。
三、实验结果1. 基因克隆与表达分析成功克隆了ZNE1基因，并构建了表达载体。
在大肠杆菌中成功表达了ZNE1蛋白，Western blot结果显示表达量较高。
2. 转基因植物构建成功将ZNE1基因转入拟南芥中，获得了转基因植物。
PCR 检测结果显示，转基因植物中ZNE1基因已成功整合到基因组中。
3. 生理生化指标测定在低锌条件下，ZNE1过表达的拟南芥植株生长状况明显优于野生型和ZNE1敲除型植株，锌含量也较高。
同时，过表达株系的抗氧化酶活性也较高。
而在高锌条件下，过表达株系并未出现明显的毒害症状，表明ZNE1在锌平衡调节中发挥了重要作用。
Cd、Cu胁迫对拟南芥错配修复基因甲基化水平的影响研究的开题报告
Cd、Cu胁迫对拟南芥错配修复基因甲基化水平的影
响研究的开题报告
题目： Cd、Cu胁迫对拟南芥错配修复基因甲基化水平的影响研究
背景与意义：
拟南芥是被广泛应用于重金属毒害研究的模式植物之一，其生长发育过程受到胁迫的影响较为敏感。
Cd、Cu等重金属在自然环境中广泛存在，且由于人类活动的影响，重金属污染日趋严重。
拟南芥种子萌发过程中以及早期幼苗时期的生长过程需要错配修复系统来修复DNA单链断裂和碱基突变等损伤，而基因甲基化作为一种重要的表观遗传学修饰方式，对错配修复基因的表达和功能发挥具有重要作用。
材料与方法：
选取拟南芥种子，种植在含有不同浓度的Cd、Cu的培养基上，分别观察不同处理条件下拟南芥的生长情况。
采用高通量测序技术，对拟南芥中错配修复基因的甲基化水平进行分析。
预期结果：
Cd、Cu胁迫处理会导致拟南芥的生长受到明显影响，影响程度与胁迫浓度相关。
重金属胁迫可以影响错配修复基因的甲基化水平，表明重金属污染可能影响DNA修复功能的发挥。
意义：
本研究结果可为深入探究重金属污染对植物DNA修复机制影响提供基础研究数据，为评价重金属污染对生物多样性和生态安全的影响提供科学依据。
镉诱导拟南芥细胞程序性死亡过程中NO产生和亚细胞定位观察
镉诱导拟南芥细胞程序性死亡过程中NO产生和亚细胞定位观察叶芸;李哲;邢达【摘要】Cadmium ( Cd ), a non-essential element, exhibits high levels of toxicity. Cd2+ exposure could inhibit plant growth and even result in cell death. Yet the mechanisms of Cadmium-induced programmed cell death ( PCD ) remain largely unknown. Using fluorescent probes molecular imaging and laser confocal scanning microscopy, the temporal and spatial characteristics of nitric oxide ( NO ) production during Cd2+ -induced PCD in Arabidopsis protoplasts were investigated in vivo and in real-time. Results demonstrated that high doses of Cd2+ strongly decreased cell viability and induced large amount of NO. After 12 h treatment with 100 μmol/L Cd2+ the NO content reached a maximum. NO was first generated in the mitochondrial regions of protoplasts and subsequently in chloroplasts and even whole cell as the treating time went on.To study the effects of laser on animal corneal proteins structure and explore the molecular mechanism of laser induced cornea injury, the rabbits were divided randomly into injury group and normal group, and fourier transform infrared spectroscopy ( FT-IR ) was applied to observe the change of proteins structure in the corneal epithelium and stro-ma. It reveals that there are significant spectral differences of the peak position and the percentages of absorption value for secondary protein structure after laser exposure. These results suggest that the secondary structure ofcorneal epithelium and stroma proteins have changed since the laser irradiation, which may lead to the decrease in proteins structural stability and the loss of proteins function.%镉是一种高度有毒的重金属,能够抑制植物生长,甚至导致死亡,但是其诱导细胞程序性死亡(PCD)的分子机制仍然不是很清楚.本文利用荧光探针分子成像和激光共聚焦扫描显微技术,以拟南芥叶肉细胞原生质体为材料,观察100 μmol/L CdCl2诱导PCD过程中一氧化氮(NO)的产生和亚细胞定位.结果表明高浓度CdCl2能够明显降低细胞活力,100 μmol/L CdCl2能够诱导大量NO产生,在处理12 h后NO产生达到峰值.亚细胞定位观察发现NO荧光首先和线粒体有共定位.随着处理时间的延长在叶绿体和胞质也观察到NO荧光.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2012(021)006【总页数】6页(P486-491)【关键词】镉;一氧化氮;细胞程序性死亡【作者】叶芸;李哲;邢达【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东,广州,510631;华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东,广州,510631;华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东,广州,510631【正文语种】中文【中图分类】Q255镉是一种环境中普遍存在的高度有毒的重金属元素，极易被植物吸收并积累，超过一定限度不仅严重影响作物的产量和品质，而且还对植物和动物产生很强的毒性，并且有可能通过食物链影响人体健康［1-3］。
DNA损伤检测—单细胞凝胶电泳技术的研究
DNA损伤检测—单细胞凝胶电泳技术的研究
朱文文;王晓涛
【期刊名称】《微量元素与健康研究》
【年(卷),期】2007(24)3
【摘要】单细胞凝胶电泳(SCGE)又称为彗星实验,是一种可以在单个细胞水平上检测DNA断裂的技术。
近年来该技术被广泛应用于特定的DNA损伤、DNA特异性染色、DNA修复、遗传毒理、环境生物监测等方面的研究。
在前人的基础上对该实验方法做了进一步的研究和改进,使改进后的方法更加快速简捷、经济可行。
【总页数】2页(P6-7)
【关键词】单细胞凝胶电泳;DNA损伤
【作者】朱文文;王晓涛
【作者单位】河南科技大学动物科技学院;河南平顶山工学院
【正文语种】中文
【中图分类】R329.27
【相关文献】
1.应用单细胞凝胶电泳技术检测K562细胞 DNA损伤的研究 [J], 景学安;张显忠;宋文刚;宗传龙;康莉
2.单细胞凝胶电泳技术检测丙烯酰胺亚急性中毒大鼠的单细胞DNA损伤 [J], 杨淑芸;李国良;付正英;张引国;张金波
3.单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤的方法及进展 [J], 赵琳娜;陈薛钗;钟儒刚
4.用单细胞凝胶电泳技术检测粉纹夜蛾5BI细胞DNA损伤的研究 [J], 甘耀坤;乔琰;鲁志松;刘凯于;杨旭
5.单细胞凝胶电泳技术检测蜘蛛血细胞DNA损伤研究 [J], 李锐;李生才;杨怀卿;刘佳;罗原
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单细胞凝胶电泳测量国产甲基叔丁基醚致DNA损伤
单细胞凝胶电泳测量国产甲基叔丁基醚致DNA损伤
黄关麟;赵进顺
【期刊名称】《中国公共卫生学报》
【年(卷),期】1998(17)6
【摘要】随着甲基叔丁基醚（ＭＴＢＥ）的广泛使用，其致突变效应及遗传毒性已引起关注。
本实验采用单细胞凝胶电泳（ＳｉｎｇｌｅＣｅｌｇｅｔＡｓａｙ；ＳＣＧ）技术测试国产ＭＴＢＥ对人的外周血有核细胞的ＤＮＡ损伤作用。
方法（１）样品ＭＴＢＥ１：国产，纯度９７％；ＭＴＢ...
【总页数】1页(P334)
【作者】黄关麟;赵进顺
【作者单位】南京炼油厂医院;南京铁道医学院卫生所
【正文语种】中文
【中图分类】R994.3
【相关文献】
1.应用单细胞凝胶电泳技术测定巢湖水有机提取物致鱼红细胞DNA损伤 [J], 赵影
2.单细胞凝胶电泳技术检测丙烯酰胺亚急性中毒大鼠的单细胞DNA损伤 [J], 杨淑芸;李国良;付正英;张引国;张金波
3.用单细胞凝胶电泳检测砷,汞,铅致DNA损伤的研究 [J], 朱靳良;邓丽霞
4.应用碱性单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测镉致鸡脾淋巴细胞DNA的损伤效应[J], 李金龙;熊永忠;徐世文;李术;刘丽玲
5.应用单细胞凝胶电泳技术检测辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤 [J], 洪承皎;王静;童建
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单细胞凝胶电泳法检测单细胞DNA损伤
单细胞凝胶电泳法检测单细胞DNA损伤
陈安
【期刊名称】《国外医学：临床生物化学与检验学分册》
【年(卷),期】1998(019)004
【摘要】单细胞凝胶电泳技术已广泛应用于单细胞ＤＮＡ损伤的检测。
其实验原
理在于损伤的ＤＮＡ在电场中从核内溢出，形成与细胞核“头部”相区别的“尾部”目前主要用形状指标、距离指标、强度指标、“矩”类指标等国类指标分析实验结果。
【总页数】2页(P145-146)
【作者】陈安
【作者单位】第三军医大学临床生物化学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R446.1
【相关文献】
1.单细胞凝胶电泳法检测HBV患者外周血淋巴细胞DNA损伤 [J], 黄金梅;曾小云;仇小强
2.单细胞凝胶电泳法检测研究同步辐射软X射线辐照引起的DNA损伤 [J], 顾月华;高恒景;王琦;赵凌
3.单细胞凝胶电泳法检测双酚A对小鼠睾丸细胞DNA损伤 [J], 杜鹃;周涌;宋春梅;任兴全
4.单细胞凝胶电泳法检测双酚A对小鼠睾丸细胞DNA损伤 [J], 杜鹃;周涌;宋春梅;
任兴全
5.对单细胞凝胶电泳法检测细胞核DNA损伤的影响因素 [J], 李恩民;杨帆;陈爱云;吴健谊;陈玮莹;温博贵;黄革;许丽艳
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单细胞凝胶电泳检测酞酸酯类对DNA的损伤
单细胞凝胶电泳检测酞酸酯类对DNA的损伤赵文红;厉曙光;石红军【期刊名称】《中国公共卫生》【年(卷),期】2004(20)10【摘要】目的应用单细胞凝胶电泳 (SCGE)技术对增塑剂 (DEHP)邻苯二甲酸二乙基己酯致小鼠胚胎成纤维细胞 (3T6细胞 )DNA损伤、损伤程度以及有无剂量 -效应关系进行检测。
方法将溶剂二甲基亚砜处理的 3T6细胞作为阴性对照组 ,用H2 O2 染毒的 3T6细胞作为阳性对照组(80 μmol/LH2 O2 染毒 ) ,将不同浓度DEHP处理的 3T6细胞设为 4个剂量组(6 2 5 ,12 5 ,2 5 0 ,5 0 0 μg/ml)进行SCGE检验。
结果各染毒组细胞DNA损伤与阴性对照组比较 ,均有显著性差异(P <0 0 5 ) ;且随DEHP染毒浓度增加 ,3T6细胞DNA损伤程度加重 ,有剂量 -效应关系。
结论DEHP体外染毒对 3T6细胞能造成损伤。
【总页数】2页(P1164-1165)【关键词】DEHP;单细胞凝胶电泳;小鼠胚胎成纤维细胞;DNA损伤【作者】赵文红;厉曙光;石红军【作者单位】蚌埠医学院预防医学系;同济大学基础医学院【正文语种】中文【中图分类】R392.1【相关文献】1.自制单细胞凝胶电泳玻片用于检测细胞DNA损伤 [J], 朱进;阳东荣;单玉喜2.单细胞凝胶电泳检测非小细胞肺癌患者淋巴细胞DNA损伤 [J], 宋娜娜;黄宏君;吴白平;邓爽;熊志敏;徐克前3.单细胞凝胶电泳技术检测丙烯酰胺亚急性中毒大鼠的单细胞DNA损伤 [J], 杨淑芸;李国良;付正英;张引国;张金波4.单细胞凝胶电泳检测单细胞DNA损伤 [J], 杨建一;彭芸;李莉5.单细胞凝胶电泳法检测单细胞DNA损伤 [J], 陈安因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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２００３；Ｓａｇｉ ａｎｄ Ｆｌｕｈｒ，２００６），对细胞内的蛋白质分子、 ＤＮＡ和脂质等生物大分子造成损害，严重时将导致细 胞死亡。Ｇｉｃｈｎｅｒ等（２００６）报道，在被重金属污染 的土壤中，烟草和番茄植株叶片细胞核ＤＮＡ损伤明 显高于对照。
单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｇｅｌ ｅＩｅｃ”ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ＳＣＧＥ）Ｘ称彗星试验（ｃｏｍｅｔ ａｓｓａｙ）是近年来发展起来 的可以在细胞水平检测真核细胞ＤＮＡ损伤的一种遗传 毒理分析技术，具有简便、快速、灵敏、样品用量少 和无需放射性标记等特点。这一技术可以检测真核细 胞中的多种ＤＮＡ损伤。如单链断裂、双链断裂、碱性 不稳定位点、不完全切除修复位点和ＤＮＡ交联等。本 实验室对动物细胞单细胞凝胶电泳技术进行改进，使之 适合植物材料样品，并成功获得了紫外辐射诱导植物叶 片ＤＮＡ损伤的彗星图像和定量分析结果（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａ１．。
万方数据
１１８植物学报４４（１）２００９
２００７；王静等，２００７）。本研究以拟南芥叶肉细胞原生 质体为实验材料，应用改进的植物单细胞凝胶电泳技术， 比较了锌、镉和铜３种重金属离子对植物细胞的毒性和 对ＤＮＡ损伤的影响。以期探索重金属对植物遗传毒理效 应的检测方法和实验体系，并为研究植物响应重金属胁 迫的细胞和分子机理提供新的证据。
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图４ 不同浓度的重金属处理对拟南芥原生质体ＤＮＡ损伤的影 响（处理时间均为３０分钟）
植物学报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ２００９。４４（１）：１ １７－１２３．州州．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ
－技术方法－
重金属诱导拟南芥原生质体ＤＮＡ损伤的 单细胞凝胶电泳检测
聂志刚１，王艳１一，李韶山１’
１华南师范大学生命科学学院．广东省高等学校生态与环境科学重点实验室，广州５１ ０６３１ ２暨南大学理工学院，广州５１ ０６３２
收稿日期：２００７—１０－１７；接受Ｈ期：２００８．０１－０７ 基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ．３０３７０１２６、３０４７０２８３和３０６７０１５６）、教育部留学回国人员科研启动基金（Ｎｏ．２００５·３８３）、广东省 教育厅自然科学研究项目（Ｎｏ．Ｚ０２０１ ８）和高等学校博士学科点专项科研基金（Ｎｏ．２００７０５７４００３） ‘通讯作者。Ｅ．ｍａｉｌ：ｌｉｓｈｓｈ＠ｓｃｎｕ．ｅｄｕ．Ｇｎ
万方数据
１２０植物学报４４（１）２００９
图３ 不同浓度重金属锌、镉和铜离子胁迫诱导的拟南芥原生质体ＤＮＡ损伤的单细胞凝胶电泳彗星图像
Ｆｉｇｕｒｅ ３ Ｃｏｍｅｔ ａｓｓａｙ ｉｍａｇｅｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌｓ Ｚｎ２＋．Ｃｄ２＋ｏｒ Ｃｕ２＋ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ
聂志刚等：重金属诱导拟南芥原生质体ＤＮＡ损伤的单细胞凝胶电泳检测 ”ｇ
图２ 不同浓度莺．金属Ｚｎ２＋（Ａ）、Ｃｄ２＋‘Ｂ）和Ｃｕ２＋（ｃ）胁迫对拟南 芥原生质体存活率的影响
Ｆｉｇｕｒｅ ２ Ｔｉｍｅ ａｎｄ ｄｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ·ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌｓ Ｚｎ“（Ａ）， Ｃｄ２＋（Ｂ）ａｎｄ Ｃｕ２＋（Ｃ）ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｉｍｅ．
液中加入不同浓度的单一重金属，处理一定时间后，用荧 光染料ＦＤＡ染色５分钟，在荧光显微镜下计数确定原生 质体的存活率。从图２中可以看出，浓度为１－５ ｍｍｏｌ－
Ｌ．１的Ｚｎ“、Ｃｄ２＋和Ｃｕ“３种重金属离子都不同程度地 诱导了拟南芥叶肉原生质体的死亡；当加入Ｚｎ“的浓度 为１ ｍｍｏｌ－Ｌ。１时，与对照相比，原生质体的死亡率较低； 而当Ｚｎ“的浓度增加至２或５ ｍｍｏｌ－Ｌ～，原生质体的存 活率随着处理时间的增加而明显降低。与Ｚｎ２＋相比， Ｃｄ２＋和Ｃｕ“的处理浓度无论是１、２或５ ｍｍｏｌ·Ｌ～。 原生质体的存活率均随着处理时间的延长而急剧降低， 而且不同浓度Ｃｄ２＋和Ｃｕ２＋处理的原生质体存活率都低 于相应浓度的Ｚｎ２＋处理的原生质体的存活率。从原生 质体存活率这一指标而言，Ｚｎ２＋毒性相对较小，而Ｃｄ２＋ 和Ｃｕ“对原生质体的毒性则较大。
１ 材料与方法
１．１ 植物材料的培养
所用拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｌ．Ｈｅｙｎｈ．）为哥伦比 亚生态型（Ｃｏｌｕｍｂｉａ－０ｌ。将拟南芥种子置于４。Ｃ冰箱中 ２天进行低温春化处理。培养基质由营养土与蛭石按体 积比１：１混合而成。待真叶长出后，每盆保留３株健 壮幼苗，用１／２ＭＳ营养液施肥。光周期为１６４，时光照／ ８小时黑暗，光期温度２２。Ｃ，黑暗时温度２００Ｃ，相对湿 度大于７５％，光合有效辐射（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｊｃａ¨ｙ ａｖａｉｌ－ ａｂｌｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ，ＰＡＲ）强度为１００ ｌ咀ｍｏｌ·ｍ－２，ｓ～。选取 ４周龄拟南芥完全伸展的成熟叶片用于分离原生质体。
植物在受到重金属污染时通常会表现出光合作用受 到抑制、抑制直至停止，严重时甚至导致 作物产量和品质的降低及植物体死亡。植物对重金属 的抗性及其细胞和分子机理研究，已发展成为植物生态 学和污染生态学的前沿和热点领域。近年来的大量研 究证实，植物适应重金属胁迫的机制包括阻止和控制重 金属离子的吸收、体内螯合解毒、体内区室化分割以 及代谢平衡等（许勤松和施国新，２００１）。研究表明，重 金属诱导植物体产生各种活性氧自由基（Ｏｌｍｏｓ ｅｔ ａ１．，
１．４ 原生质体活力的测定
取重金属处理后的原生质体悬浮液９９“Ｌ，加入１ ｐＬ浓 度为１％的荧光染料ＦＤＡ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ，Ｍｏ． ＩｅｃｕＩａｒ Ｐ ｒｏｂｅ公司产品），使ＦＤＡ的最终浓度为 ０．０１％。５分钟后在荧光显微镜（ＴＥ一２０００Ｕ，Ｎｉｋｏｎ，日 本）下进行观察，发绿色荧光的为有活力的原生质体，不发 绿色荧光的为失活的原生质体。用血球计数板记录有 活力的原生质体数目。每个处理重复３次，细胞活力计 数取平均值。
摘要以拟南芥原生质体为实验体系，研究不同浓度的３种重金属离子对拟南芥原生质体的毒性和ＤＮＡ损伤的差异。结果表 明，用１－５ ｍｍｏｌ·Ｌ．１的Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋和Ｃｕ２＋分别处理的拟南芥原生质体，２小时内活力逐渐下降，并表现出明显的浓度依赖性： 与相同浓度的Ｃｄ“和Ｃｕ“相比，Ｚｎ２＊对拟南芥原生质体活力的影响程度较小，表现出较低的毒性。单细胞凝胶电泳检测发现， 用０．１—０．８ ｍｍｏｌ·Ｌｏ的Ｚｎ“、Ｃｄ“和Ｃｕ“分别处理拟南芥原生质体３０分钟，以ＯＴＭ值表示的原生质体ＤＮＡ损伤量随重金 属离子浓度的增加Ｉｆｉｉ递增：相同浓度（０．５ ｍｍｏｌ·Ｌ．１）的３种重金属离子相比，Ｚｎ“对原生质体的遗传毒性明显低于Ｃｕ２＋和Ｃｄ“。 综合原生质体活力和ＤＮＡ损伤的单细胞凝胶电泳检测结果，发现ｚｎ“对拟南芥原生质体的遗传毒性较低，而Ｃｄ２＋和Ｃｕ２＋的遗 传毒性较高。本研究建立的拟南芥原生质体实验体系，结合运用单细胞凝胶电泳技术，能够快速、灵敏地检测重金属对植物 细胞的遗传毒性。
为了研究重金属对拟南芥原生质体ＤＮＡ损伤的剂 量－效应关系，设置了较低浓度重金属处理实验，使原生 质体经过一定处理时间后，仍然能够维持在较高的存活 率，并得到经单细胞凝胶电泳（检测ＤＮＡ损伤）的彗星图 像（图３）。不同浓度的重金属Ｚｎ“、Ｃｄ２＋或Ｃｕ“处理 原生质体３０分钟，经单细胞凝胶电泳检测发现，浓度为 ０．１ ｍｍｏｌ·Ｌ＿１的Ｚｎ２＋几乎不能诱导原生质体细胞核ＤＮＡ 的迁移，当Ｚｎ２＋的浓度增加到０．５或０．８ ｍｍｏ卜Ｌ一时。 尽管ＤＮＡ损伤程度较低，但与对照相比，彗尾明显增 大。与相同浓度的Ｚｎ“处理相比，重金属Ｃｄ２＋和Ｃｕ２＋ 引起原生质体彗星图像拖尾极为明显（图３）。不同浓度 重金属处理的拟南芥原生质体经单细胞凝胶电泳所形成 的彗星图像，采用Ｃａｓｐ软件定量分析后，得到ＤＮＡ损 伤指标ＯＴＭ（ｏｌｉｖｅ ｔａｉｌ ｍｏｍｅｎｔ）值与重金属处理浓度的 关系（图４）。结果显示，０．１ ｍｍｏ卜Ｌ＿１的Ｚｎ“处理的 ＯＴＭ值与对照相比无显著差异。而当重金属的浓度增加 到０．２ ｍｍｏｌ－Ｌ＿１时，ＯＴＭ值与对照相比显著增加（尸之 ０．０５）。重金属Ｃｄ２＋和Ｃｕ２对原生质体的ＤＮＡ损伤更 为明显，达到极显著水平（Ｐ＜０．０１）。
１．５ 单细胞凝胶电泳
低浓度重金属处理原生质体所使用的浓度分另Ｕ为０、 ０．１、０．２、０．５和０．８ ｍｍｏｌ－Ｌ～，处理时间为３０分钟。 将处理后的原生质体以１００ Ｘ ｇ离心２分钟，除去上清 液，加入适量缓冲液调整悬浮原生质体到适当的密度。 单细胞凝胶电泳和彗星图像分析方法参照本实验室已发 表的文献报道（蒋磊等，２００６；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａ１．，２００７；王静 等，２００７）。
１．２ 原生质体的分离 取拟南芥成熟叶片，用锋利的刀片切成长０．５－１ ｍｍ的 小条，放入５ ｍＬ的酶解缓冲液（含１．５％纤维素酶， ０．４％离析酶，０．４ ｍｏｌ－Ｌ．１甘露醇，０．０２ ｔｏｏｌ·Ｌ～ＫＣＩ， ０．０２ ｍｏｌ·Ｌ－１ ＭＥＳ（ｐＨ ５．７），０．０１ ｍｏｌ－Ｌ～ＣａＣｌ２， ０．１％ＢＳＡ）中，于２２０Ｃ黑暗环境中酶解３小时。酶解 混合物用２００目滤网过滤，将滤液转移至离心管中，以１００ ×夕离心２分钟，除去上清液；加入适量等渗缓冲液（Ｏ．５ ｍｏｌ－Ｌ＿１甘露醇。４ ｍｍｏｌ·Ｌ～ＭＥＳ，２０ ｍｍｏｌ·Ｌ—ＫＣＩ， ｐＨ ５．７），并轻微摇动，悬浮原生质体，置于冰浴备用。
１．３ 重金属处理
将氯化镉（ＣｄＣｌ２）、硫酸锌（ＺｎＳ０４）和硫酸铜（ＣｕＳ０４）分 别溶解于去离子水中，配制成浓度为０．１ ｍｏｌ－Ｌ叫的重金 属离子溶液。用不同浓度的单一重金属分别处理原生 质体，重金属离子的浓度设为０、１、２和５ ｍｍｏｌ－Ｌ．１， 处理时间分别为０、３０、６０、９０和１ ２０分钟。