基因操作原理
基因的工作原理
基因的工作原理
基因是生物体中的遗传物质，决定了生物体的遗传特征和功能。
基因的工作原理主要涉及DNA、RNA和蛋白质的相互作用。
首先，基因是由DNA分子组成的。
DNA是一个双螺旋的大分子，由两条互相缠绕的链组成。
每条链上的碱基序列编码了生物体合成蛋白质所需的信息。
基因的工作始于转录过程。
转录是指DNA链上的一个片段被
复制成为mRNA（信使RNA）。
在细胞核中，特定的酶能够
识别并结合到基因上，使其中的DNA链解开。
然后，一个名
为RNA聚合酶的酶会沿着DNA链合成RNA链，根据DNA
的碱基序列合成互补的mRNA链。
这个过程中，腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）碱基按
照特定的规则进行配对。
接下来，mRNA会离开细胞核，进入细胞质。
在细胞质中，mRNA将作为模板，被一个名为核糖体的细胞器所识别和结合。
核糖体会沿着mRNA链上“读取”信息，并根据mRNA上
的密码子来选择和组装对应的氨基酸。
氨基酸的顺序由mRNA上的密码子决定，这一顺序编码了特
定的蛋白质序列。
当核糖体组装完整个蛋白质链之后，蛋白质会通过细胞质中的其他细胞器进行后续的折叠、修饰和定位。
最终，形成的蛋白质会根据其自身的功能被运输到细胞中不同的位置，并参与到各种生物过程中。
这些过程包括细胞代谢、
信号传导、细胞结构的维持和功能的实现等。
总而言之，基因的工作原理涉及到DNA的转录、mRNA的翻
译和蛋白质的产生。
这一过程是生物体遗传特征和功能的基础，也是生命活动的关键。
基因工程原理
基因工程原理内容提要1.基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。
基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”。
该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。
2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。
3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。
根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为三大类。
Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。
第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。
4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。
基因工程中使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶连接酶和T4-DNA连接酶。
基因工程中使用的主要是T4DNA 连接酶，它是从T4噬菌体感染的中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。
5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。
6.DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。
粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。
平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。
同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。
基因操作原理名词解释
第一章1. Gene manipulation基因操作。
将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
2. Interrupted genes间断基因。
序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。
我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。
3 .Promotor启动子。
DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。
4. Subcloning亚克隆。
当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。
第二章1.Restriction and modification限制和修饰。
宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends匹配末端。
识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。
3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Isoschizomer ：同裂酶。
识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
5. Isocaudiners ：同尾酶。
来源不同、识别序列不同，•但产生相同粘性末端的酶。
6.Site preferences ：位点偏爱。
某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。
7.Star activity 星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
8. Nicking enzyme 切口酶。
基因工程的原理和技术
基因工程的基本原理：
让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细 胞中稳定和高效的表达。根据不同的实验目的，目 的基因可以有很多种，如抗虫基因、抗病基因、抗 除草剂基因、人胰岛素基因和人干扰素基因等。因 此表达的产物各不相同。通过基因工程的基本操作 ，就能实现目标。
二、基因操作的基本步骤
第三步：将目的基因导入受体细胞
选择的关键是分析基因工程的最终目的，按转基因的目的来选择：
基因工程的 最终目的
得到大量特 殊蛋白质
得到转基因动物 得到转基因植物
常用的受 体细胞
大肠杆菌 等微生物
受精卵 植物体细胞
导入的方法
Ca2＋处理法 显微注射法 农杆菌转化法
将目的基因导入微生物细胞
常选细菌 作受体细胞的原因：它 们繁殖力极强，生长速 度很快，短期内就会产 生大量后代，所以把目 的基因转入这些细菌， 就能在短时间内得到大 量的目的基因产物。
细菌的检测：
将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中 是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的 菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。
无表达产物
无表达产物
有表达产物
无表达产物
多细胞生物的检测： 将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体， 检测这些个体是否表现出相应的性状。
例：抗虫棉检测
用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不 出现中毒症状，说明未摄入目的基 因或摄入目的基因未表达。
例：下列有关基因表达载体的构建说法正确的是( C ) A．限制性核酸内切酶的功能是切割各种DNA分子 B．基因工程中经常用到的酶只有DNA连接酶和限制性 核酸内切酶 C．将目的基因与载体结合的过程，实际上就是不同来 源的DNA重新组合的过程 D．具有粘性末端的目的基因片段插入质粒的切口处， 先形成磷酸二酯键，再形成氢键
基因操作原理和方法
克隆和重组技术的应用
克隆和重组技术广泛应 用于基因工程、生物制 药、农业和医学等领域 。
在基因工程中，克隆和 重组技术用于生产重组 蛋白、疫苗和抗体等生 物制品。
在农业中，克隆和重组 技术用于改良作物品种 和提高农作物的抗逆性 和产量。
生物科学研究
基因敲除和敲入技术可用于研究基因功能、细胞信 号转导、药物筛选等生物科学研究领域，有助于深 入了解生命活动的本质。
生物制药
基因敲除和敲入技术可用于生产基因工程药物，通 过改造或增强微生物、细胞或动物细胞中的基因表 达，生产具有特定功能的药物。
敲除和敲入技术的限制和挑战
80%
技术难度高
基因敲除和敲入技术需要精确的 操作和设计，对技术和实验条件 要求较高，且存在一定的失败率 和不确定性。
05
基因编辑新技术
CRISPR-Cas9系统
总结词
CRISPR-Cas9系统是一种高效、简单、低成本的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9 蛋白的引导，实现对特定DNA序列的切割和修复。
详细描述
CRISPR-Cas9系统利用向导RNA与目标DNA序列的特异性结合，将Cas9蛋白引导至目 标位置，通过切割DNA双链形成缺口，启动细胞内的DNA修复机制。在修复过程中， 插入、删除或替换特定DNA序列成为可能，从而实现基因敲除、敲入和点突变等基因
基因操作的历史与发展
基因操作技术的起源可以追溯到20 世纪70年代，当时科学家开始探索 限制性内切酶和DNA连接酶等工具 的应用。
随着技术的不断发展，基因操作逐渐 成为现代生物学和医学研究的重要手 段，广泛应用于基因克隆、基因治疗 、基因工程等领域。
基因提取的实验原理是什么
基因提取的实验原理是什么基因提取是一种实验方法，用于从细胞中分离和纯化DNA分子。
它涉及到一系列步骤，包括细胞破碎、去除杂质、DNA溶解和纯化等。
基因提取的实验原理主要分为以下几个步骤：1. 细胞破碎：首先需要将细胞破碎以释放DNA分子。
这可以通过物理或化学方法实现。
物理方法包括振荡、摇床或超声波等，用于破坏细胞膜和壁。
化学方法则是采用细胞裂解缓冲液，其中含有蛋白酶或表面活性剂等，可以破坏细胞结构。
2. 去除杂质：细胞的破碎会释放许多非DNA的组分，如蛋白质、RNA、多余的盐和酶等。
这些杂质会影响DNA的提取和分析，因此需要通过凝胶电泳、离心沉淀或其他分离技术来除去。
一种常用的方法是通过protease K 酶处理混合物，使DNA不受蛋白质的干扰。
3. DNA溶解：细胞溶解后，DNA被释放到溶液中。
DNA在水溶液中具有一定的稳定性，但在高温、酸碱等环境条件下会降解。
因此，为了保护DNA的完整性，需要在溶解过程中加入一定的缓冲液，如Tris-HCl缓冲液或TE缓冲液（Tris-EDTA缓冲液），以维持适宜的pH值和离子强度。
4. DNA纯化：DNA溶液中仍然存在其他杂质，如RNA、酶、无机盐等。
这些杂质会干扰DNA的后续分析。
因此，需要利用分子生物学中的各种技术来纯化DNA，如甲醇沉淀、有机溶剂提取（如酚/氯仿或酒精/马尾酚方法），或者利用商用的DNA提取试剂盒进行纯化。
总体来说，基因提取的实验原理是通过破碎细胞、去除杂质、溶解DNA和纯化DNA等步骤来获得纯净的DNA样品。
这种纯化后的DNA可以用于许多后续实验，如PCR、酶切、DNA序列测定等。
基因提取是分子生物学和遗传学等领域中的关键步骤，对于研究基因功能、诊断疾病、进行基因工程等有着重要的意义。
基因操作原理知识点总结
基因操作原理知识点总结基因操作是一种在生物体内对基因进行修改或操作的技术，它的出现为生物学、医学和农业等领域带来了革命性的变革。
通过基因操作技术，科学家们可以改变生物体的一些性状，使得其具有更好的抗病性、生长速度、产量等特性，从而为人类生活和生产带来了巨大的便利和利益。
在这篇文章中，我将从基因操作的原理、技术、应用和风险等方面进行详细的介绍和讨论。
基因操作的原则基因操作的基本原理是对生物体的基因进行修改或操作，使得其具有某些特定的性状。
这是通过DNA重组技术来实现的，DNA重组技术是一种利用酶的作用或化学方法，将DNA片段进行切割、粘接、合成等操作，从而实现对基因的改变或移植。
利用这一技术，科学家们可以将某种物种的基因转移到另一种物种中，或者通过改变某个基因的表达方式来使得生物体产生一些新的性状。
基因操作的技术基因操作技术主要包括DNA重组技术、基因克隆技术、基因敲除技术、基因编辑技术等。
其中，DNA重组技术是最基本的技术，它通过切割、粘接、重组DNA片段来改变基因的结构和表达方式；基因克隆技术是一种通过细胞培养和分裂来复制基因的方法，可以用于大规模生产具有某些特定性状的生物体；基因敲除技术是一种通过干扰某个基因的表达来观察该基因在生物体中的功能和作用；基因编辑技术是一种通过精确的操纵基因序列来实现对基因的改变和操作。
基因操作的应用基因操作技术在农业、医学、生物工程等领域都有着广泛的应用。
在农业领域，基因操作技术可以用来改良作物的产量、抗病性、品质等性状，从而为农业生产提供更多的选择和可能；在医学领域，基因操作技术可以用来治疗或预防一些遗传疾病，为人类健康带来更多的希望和机会；在生物工程领域，基因操作技术可以用来生产某些特定的物质或药物，从而为生产和生活提供更多的可能性。
基因操作的风险尽管基因操作技术为人类带来了巨大的利益和希望，但是它可能也会带来一些潜在的风险和问题。
其中，最主要的风险包括对环境的影响和对人类健康的影响。
基因工程的原理
基因工程的原理
基因工程是指通过改变、插入或删除生物体内的基因来改变其特性的技术。
基因工程的原理是利用基因的特性，将特定的基因插入到生物体内，使其产生新的特性或改变原有的特性。
基因工程的原理包括以下几个方面：
DNA分子的结构和功能：DNA是生命活动的基本单位，它负责储存和传递遗传信息。
DNA分子是由若干条碱基链组成，每条碱基链由若干种碱基构成，碱基之间通过碱基对键来连接。
基因的插入和表达：基因工程的基本原理是将特定的基因插入到生物体内，使其产生新的特性或改变原有的特性。
这通常需要使用含有目标基因的质粒，并利用载体将其插入到生物体内。
插入后，基因可能会被表达，即转录成 RNA 并翻译成蛋白质。
遗传工程技术：遗传工程技术是指在基因工程实验中使用的一系列技术，包括 DNA 合成、PCR 技术、DNA 酶切割和修饰技术、基因转换技术等。
这些技术可以
帮助研究人员操纵基因，使其能够被插入到生物体内。
载体技术：载体技术是指利用载体将目标基因插入到生物体内的技术。
载体可以是质粒、噬菌体、病毒等，它们可以在生物体内复制并传播目标基因。
载体技术是基因工程的重要组成部分，可以帮助研究人员将目标基因插入到特定的生物体内，并控制基因的表达。
染色体工程：染色体工程是指对生物体染色体的操作，包括插入、删除或改变染色体的基因。
染色体工程可以帮助研究人员了解染色体的结构和功能，并使用基因工程技术改变染色体的基因组成。
基因工程在医学、农业、生物制药等领域有广泛的应用，可以帮助研究人员改变生物体的特性，为解决各种问题提供新的思路和方法。
基因编辑技术原理
基因编辑技术原理
基因编辑技术是一种以DNA序列为基础的精细操作，可以有效地改变或更改基因的结构。
它是基因工程的一个重要组成部分，可以将基因组成的两个部分组合在一起，从而实现对基因结构的改变。
这种技术已经被广泛应用于生物工程、医学研究和农业科学等领域。
基因编辑技术的基本原理是通过使用一种特殊的酶，可以将DNA 序列中的特定片段进行切割，并将另一个片段插入到切割位置。
这种技术也可以通过使用其他特殊酶来改变DNA序列中的特定片段，从而达到改变基因结构的目的。
此外，基因编辑技术还可以用于改变基因的功能。
例如，可以通过改变基因片段的顺序或结构，从而改变基因结构，使其不能正常表达基因产物。
这种技术也可以用于插入新基因，以改变某些特定基因的功能或表达，从而达到改变生物的特征的目的。
基因编辑技术的应用已经取得了巨大的成功，为我们提供了一种新的方式来改变基因，从而控制生物体的发育和进化。
它可以用来改变基因结构来调节基因的表达，也可以用来改变基因的功能，从而改变生物体的性状。
因此，基因编辑技术对于研究和改善基因组织及其功能，促进生物体性状的改良，改善农作物的产量和品质等方面都具有重要意义。
基因操作原理
基因操作原理基因操作原理题库名词解释1.同裂酶isoschizomer：识别相同序列的不同的限制性内切酶。
2.星性活性star activity：在极端⾮标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星性活性。
3.质粒不相容性：2个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象。
4.饱和诱变saturation mutagenesis：对基因的某⼀⼩区域内碱基进⾏多种形式的置换（在关键位置引⼊不同的氨基酸探寻何种替换可以获得最⼤活性）5.定点诱变：利⽤⼈⼯合成的寡聚苷酸，在离体的条件下，制造基因中任何部位的位点特异性突变的技术。
6.突变抑制基因：某⼀突变基因的表型效应由于第⼆个突变基因的出现⽽恢复正常时，称后⼀基因为前者的抑制基因。
7.融合表达载体：表达载体的多克隆位点上有⼀段融合表达标签（Tag）,表达产物为融合蛋⽩（有分N 端或者C端表达），⽅便后继的纯化步骤或检测。
8.克隆载体：为―携带‖感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的⽆性繁殖或表达有意义的蛋⽩质所采⽤的⼀些DNA分⼦。
9.穿梭载体shuttle vector：含有不同宿主的不同的复制起始点，能在不同的宿主中进⾏复制增殖，⼀种克隆载体, 可在2种或多种宿主中克隆,常⽤于重组DNA在E.coli中克隆再转到另⼀种⽣物(eg.yeast)中表达。
10.置换载体(replacement vectors)：少数载体分⼦如噬菌体基因组的中间⽚段与噬菌体的感染能⼒和DNA 复制功能⽆关，因此这个⽚段可以⽤限制酶加以切除，代之以外源DNA⽚段。
11．亲和层析（affinity chromatography）利⽤共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋⽩质混合物中能特异结合配体的⽬的蛋⽩或其它分⼦的层析技术。
12．基因⽂库(Gene library)：即某种⽣物类型全部gene的以重组体形式存在的集合。
基因工程的原理和技术
③化学方法合成目的基因
人工合成基因的方法
反转录法
根据已知的氨基酸序列 合成DNA
③化学方法合成目的基因
目的基因的mRNA 反转录
单链DNA(cDNA) 合成
双链DNA (即目的基因)
蛋白质的氨基酸序列 推测
mRNA的核苷酸序列 推测
结构基因的核苷酸序列 化学合成
胰岛素生产车间
基因工程干扰素
• 干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！ 过去从人血中提取，300L血才提取1mg！ 其“珍贵”程度自不用多说。
干扰素分子结构
干扰素生产车间
SCID的基因工程治疗
• 重症联合免疫缺陷（SCID ）患者缺乏正常的人体免 疫功能，只要稍被细菌或 者病毒感染，就会发病死 亡。这个病的机理是细胞 的一个常染色体上编码腺 苷酸脱氨酶（简称ADA） 的基因（ada）发生了突 变。可以通过基因工程的 方法治疗。
❖ 基因工程药品的生产
• 在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生 物体的哪些结构中提取？ 药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。
• 传统生产方法的缺点 由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。
• 可利用什么方法来解决上述问题？
利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地生产出各 种高质量、低成本的药品。
基因探针：
基因探针就是一段与目的基因或DNA互补的 特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的 一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而 来的RNA。
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单 链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列， 那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双 链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离 的单链。
基因操作的主要技术原理
基因操作的主要技术原理1．核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。
某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。
在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。
将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。
在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。
DNA的脉冲电泳技术 :PFGE-Pulse-field gel electrophoresis2．核酸的分子杂交技术在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地"吸印" 转移到滤膜上的。
常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)；将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。
所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
3．细菌的转化所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。
这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。
第二章基因操作的主要技术原理2
22
nothernblot
Gene engineering
四、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂 交（slot blotting ）是在Southern印迹杂交的基 础上发展的量种类式的快速检测特定核酸 （DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在 实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置， 使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜 上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技 术更适应与核酸样品的定量检测。
10
Gene engineering
尼龙膜
很强的抗张性，易于操作，与核酸分子 的结合能力大。 DNA以天然的形式从凝胶上转移到膜上， 在尼龙膜上进行原位碱变性。
11
Gene engineering
尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤
1)核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体 支持膜上(毛细管作用)
2)印迹杂交： 将具有核酸印迹的滤膜同带 有标记的DNA/RNA进行杂交。
43
Gene engineering
DNA + DMS
+ Saturating [Protein] Gel Shift
44
Gene engineering
4、甲基化干扰实验（methyltion interference assay）
根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡 啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一 种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰 实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化 对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细 地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。
第01章 基因操作原理的理论基础
第一章基因操作原理的理论基础第一节基因操作原理 (1)第二节基因的结构——理论基础 (2)第一节基因操作原理基因操作（Gene Manipulation）的核心部分为分子克隆（molecular cloning）。
由于政府对基因操作有一定的法律约束，大多数国家对此都有一个精确的法律定义。
比如在英国将基因操作定义为将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒、质粒或其它载体系统中，再整合到那些本来不含该类物质的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
（引自Principles of Gene Manipulation ，Black well Scientific Publications , RW. OLD & SB Primrose , 1985）。
强调外源核酸分子（一般情况下都是DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限，将来自不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的重要特征。
另一个特征是繁殖。
这里所说的基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的表达、调控、检测和改造等与基因研究相关的内容。
本课程就是为了讲述在核酸水平上对基因进行研究所涉及的方法、技术和策略的原理，主要是基本的、通用的原理，对于涉及到具体的学科或领域的原理不在此范围内。
基因操作原理在生物学科发展中具有重要地位。
这门课以前叫“分子克隆Ⅰ”，“分子克隆Ⅱ”为实验课。
但无论叫什么，本门课程到底要讲些什么，它的地位如何？20 世纪是生物学发展最为迅速的时期，1953 年由于认识了DNA 的双螺旋结构，从而揭开了分子生物学研究的热潮。
在整个生物学研究进程或研究层次来说，其发展过程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平，同时由于遗传学的兴起与发展，DNA 作为生命遗传信息的物质基础被确定下来，从而导致分子生物学的诞生。
分子生物学严格来说应是从分子水平或核酸水平上进行研究的生物学，研究生物的生物学现象和本质，如DNA的结构、复制、表达、调控、遗传、变异等。
基因工程实验原理
基因工程实验原理
基因工程实验的原理是基于对生物体基因组的修改和重组，旨在增加或改变生物体的特性。
下面将介绍几种常见的基因工程实验原理：
1. 基因克隆：该实验原理是将所需基因从一个生物体中剪切并插入到另一个生物体的染色体上，使目标基因能够在新宿主中表达。
2. 限制性内切酶消化：该实验原理是利用限制性内切酶切割目标DNA，创建具有粘性末端的DNA片段。
然后，可以通过连接这些片段来构建重组DNA。
3. 反转录和cDNA合成：这个实验原理是利用逆转录酶将RNA转录成DNA，即cDNA（互补DNA），然后将其克隆到表达载体中。
4. 基因敲入和敲除：该实验原理是通过CRISPR/Cas9系统或其他方法，有针对性地切割或改写目标基因，从而敲除或敲入特定的DNA片段。
5. 转基因技术：这是将外源基因导入到目标生物体中，使其表达或增强特定的功能。
转基因技术的原理可以是通过基因枪、农杆菌介导的转化等手段。
这些实验原理是基因工程研究中常用的方法，可以用于改良农
作物、生产药物、开发生物燃料等领域。
在实验过程中，研究人员需要仔细设计实验方案，并根据具体需求选择适当的方法。
高中生物基因工程的原理与操作步骤
高中生物基因工程的原理与操作步骤高中的同学们，咱们今天来聊聊基因工程这个神奇又有点复杂的家伙！话说我之前有次参加一个生物科普活动，遇到了一个特别有趣的事儿。
当时有个小朋友拿着一片叶子问我：“这叶子能变成金子不？”我笑着回答他：“小朋友，叶子变金子可不行，但通过基因工程，咱们能让植物变得更厉害哟！”这就引出了咱们今天的主题——基因工程。
基因工程啊，简单来说，就是在分子水平上对基因进行操作，就好像是给基因这个“小零件”做精细的改造和组装。
那它的原理是啥呢？其实就是利用了基因重组。
咱们都知道，不同的基因组合能产生不同的性状。
基因工程就是人为地把一些有用的基因组合在一起，创造出咱们想要的生物特性。
就好比搭积木，咱们把不同形状、颜色的积木挑出来，按照自己的想法重新搭建成一个新的造型。
基因工程也是这样，把不同生物的基因挑出来，重新组合，创造出全新的生物特性。
那基因工程具体咋操作呢？这可得一步步来。
第一步，得获取目的基因。
这目的基因就像是咱们盖房子需要的关键材料。
比如说，咱们想要让一种植物具有抗虫的特性，那就要先找到能够控制抗虫的那段基因。
这获取的方法有好几种。
可以从基因文库里找，这基因文库就像是个超级大仓库，里面堆满了各种各样的基因。
咱们得根据特定的标记或者序列，像在大海里捞针一样把咱们需要的基因捞出来。
还可以通过 PCR 技术来扩增目的基因，这就像是复制粘贴，把需要的基因大量复制出来。
第二步是基因表达载体的构建。
这一步就像是给咱们好不容易找到的目的基因搭个“车”，让它能顺利地到达目的地。
这个“车”可讲究了，得有启动子、终止子、标记基因等等。
启动子就像是发动机，能让基因开始工作；终止子就像是刹车，告诉基因什么时候该停止；标记基因呢，就像是个小旗子，能让咱们知道基因是不是成功地进入了细胞。
第三步是将目的基因导入受体细胞。
这就像是把咱们精心准备的“礼物”送进人家的“家门”。
导入的方法也有不少，比如农杆菌转化法，这农杆菌就像是个送货员，能把基因送到植物细胞里；还有基因枪法，这就像是用枪把基因“打”进细胞里；还有显微注射法，这可是个精细活儿，得用特别细的针把基因注射到动物细胞里。
基因编辑技术的原理与方法
基因编辑技术的原理与方法基因编辑技术是一种能够创造新的生命形态的科技，它可以改变生物的基因组，使其拥有更先进的基因组结构，并且可以消除人类遗传病。
基因编辑技术的主要原理是通过改变生物基因组内的核酸序列，去掉有害基因和插入有利基因，来实现对生物基因编辑的操作。
本文将讨论基因编辑技术的原理和方法。
一. 基因编辑技术的原理基因编辑技术的原理是利用现代生物技术将人类的基因或某种蛋白质编辑或修饰，使其能更好的适应环境以及更好的发挥作用。
1.重组DNA技术重组DNA技术是基因编辑技术的关键，重组DNA技术使得科学家们可以利用细胞、病毒或细菌的基因将不同的DNA片段组合在一起，产生新的DNA序列。
具体地，利用重组DNA技术在DNA链上切开并粘贴一段新的DNA，这样就可以在人类基因组上定位有害基因并进行修饰、消除。
2. CRISPR / Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种基因编辑技术，是一种高效的基因编辑工具。
与传统的基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9可以更容易地定位和修改目标基因。
它利用了CRISPR基因与Cas9蛋白的互作，在某个DNA片段上划分一个锋利的切割器，来修正、插入或删除DNA链中的基因。
这种基因编辑技术使得基因编辑更加精准和有效，对治疗包括肺癌、胃癌、乳腺癌等多种疾病均具有一定的优势。
二. 基因编辑技术的方法目前，基因编辑的主要方法有三种：基因注射法、细胞融合法和CRISPR/Cas9技术。
1.基因注射法基因注射法是一种基本的基因编辑方法，它适用于比较简单、单一的生物细胞，如蝌蚪、动物卵细胞等。
该技术的具体方法是将编码所需蛋白或RNA的DNA或RNA注射进去，使其在细胞内进行转录和后续翻译，来实现对细胞基因编辑的操作。
2.细胞融合法细胞融合法是一种通过融合两个非常相似的细胞产生一个新的细胞来编辑基因的方法，主要针对多细胞生命而言。
这种方法通过融合可以得到新细胞及其基因，可以将新细胞的某些特征加入原有的种群中，使它们更适应某些特定环境和进化。
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Separation Range Vs. % Agarose
Low Geling Agarose 4-6
0.02-0.4
用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算
Sample Well
25 ng 1 kb ladder 0.8% Agarose
Agarose Gel Electrophoresis
Reps
Cycle1 Cycle2—30
Cycle31*
1min 1min 1min
1min 1min 1min
1min 1min 10min
1× 29× 1×
*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length
10个碱基作引物
用随机引物扩增出的PCR产物，经琼脂糖 电泳后所呈现的带型，反映着用作模板 的DNA分子的总体结构特征。
核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术
核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡 内基学院（Cavnegie Institute of Washington） 的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是， 带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当 它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火 形成双链的结构。
1.其长度通常在15~30个核苷酸之间。 2.简并引物 atggctant… 3.嵌套引物
PCR扩增的长度：<2kb
• PCR技术的应用：
1.基因组克隆
突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的 添加核算序列。
• 反相PCR(reverse PCR)与染色体步移
• 不对称PCR(asymmertric PCR) 用来制备单链的DNA 特点： 两种引物的浓度不同，低浓度的限制引
• 107bp的DNA大分子。
PFGE can resolve large DNA fragments
• 基因扩增（gene amplification）
主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主
细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增
• 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大 小和构型。分子量较小的DNA分子，比 分子量较大的DNA分子迁移率要快；同 等分子量的不同构型的核酸分子，构型 紧密的比松散型的开环DNA分子或线性 DNA分子迁移率要快
• 凝胶电泳的分辨力：
与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间
水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(AC)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在 含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉 米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水 稻的psbA基因序列。
•琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的 线性多糖聚合物。
分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP） 琼脂糖。
• LMP琼脂糖 熔点：62～65℃ 熔解后，在37℃ 可保持液态数小时； 在25℃ 可保持液态约10min
• 回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提DNA； 离心获得含DNA分子的上清液；
Some DNA Polymerases Used in PCR
Enzyme Microbial Source
Thermotolerance
Klenow Escherichia coli
No
Sequenase T7 bacteriophage
No
Taq
Thermus aquaticus
Yes
BstE
• 直接酶切
• 琼脂糖凝胶电泳的参数：
缓冲液：1× TAE（TBE TPE） 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：<1μg，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短 时间
染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比
Parameter Concentration
Template pH dNTPs Gelatin Primers Mg2+ oncentration Enzyme Total volume
10 attomoles(~1×106 molecules) 8.4（10mM Tris-Hcl） 200 μM(each one)
印迹转移前的凝胶处理： 分子量不同所需转移的时间不同； 浸泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤，再进 行碱变性
碱水解，DNA链断裂 单链
（a）
Southern 凝 （b） 胶转移杂交
技术
基因组DNA
DNA限制片段
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜
（e）
同探针同源杂交的 基因DNA片段
X光底片
Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片
第二章 基因操作的主要技术原理
• 核酸的凝胶电泳
• 扩增原理 • 分子杂交 • 测序
•核酸的凝胶电泳
它是一种分析鉴定重组DNA分子及 蛋白质与核酸相互作用的重要实验手 段，同时也是分子生物学研究方法的 技术基础。
• 基本原理
带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链， 依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖 凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在 电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的 差异，以及所带电荷的不同，可以通过 电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。
150 nucleotides/sec/molecule >50% at 95℃ for 40 min 1.1×10-4 substitutions per cycle
>0.5mM<10mM 5’ to 3’only 5’ adenosines
• PCR引物： 与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的 人工合成的寡核苷酸片断。
• 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一 个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角， 下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一 侧成45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的 电场方向、电流大小、Байду номын сангаас及作用时间都在交替 地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其 泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比，分子量大的 DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位， 使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢， 从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。
1、萨瑟恩DNA印迹杂交
根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段 转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验 方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年 首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。
• 凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀 酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵 （ 10％ ）。
PolyAcrylamide Gels
• 脉冲电场凝胶电泳（PFGE）
• 1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大 分子量的DNA分子。
• 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲 电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角，下一个脉冲的 电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角，由于加 在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作 用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随 时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需 要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的 方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子 量DNA分子的目的。
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增
产物的数量满足实验需求为止。
Reaction Condition for a Typical PCR Assay
在进行核酸印迹转移的时，
1. 要将以转好的硝酸纤维素膜在80度下 烘烤1～2小时；
2. 紫外线交联法，将DNA分子上的部分 胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷 的氨基基团之间进行交联。
kb
12
10 8
EtBr Detection Limit: ~5-10 ng DNA
6
4
2
1
根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小
Agarose gel electrophoresis
Agarose gel electrophoresis
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 缓冲液：TBE
物和高浓度引物，两者浓度相差约100倍。
获得单链核苷酸的另一种方法是通过固 相支持物作DAN链的特意洗脱。（生物 素—链霉素包裹的磁珠）
• RT－PCR: 在mRNA反转录之后进行的PCR
检测RNA分子； 获取测序模板DNA； 克隆mRNA之cDNA拷贝。
基 因 的 体 外 诱 变
• 基因组的比较研究：
100 g/ml (optional) 0.5 μM(each one);(0.1—1.0μM)