基因工程重点

第一章

基因工程的定义：

狭义：指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行剪切重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达新的性状。

广义：DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。

第二章

载体的功能

⑴运送外源基因高效转入受体细胞

⑵为外源基因提供复制能力或整合能力

⑶为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

一个理想载体应具备四个条件：

⑴具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

⑵具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点

⑶具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点

⑷具有合适的筛选标记

质粒：是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA。

重要的大肠杆菌质粒载体

A、质粒pBR322

质粒pBR322结构：

（1）氨苄青霉素抗性基因。3种限制酶单一识别位点。

（2）四环素抗性基因

（3）DNA复制起点

优点：

（1）具有较小的分子量。

（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。

（3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。

（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。

B、pUC质粒载体

优点：

（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数

（2）适用于组织化学法检测重组体

（3）具有多克隆位点区段

质粒DNA的分离纯化

碱溶法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁，加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNA

质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间

沸水浴法：用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体 ;加溶菌酶裂解细菌细胞壁 ;沸水浴40秒钟;离心，用无菌牙签挑去沉淀物;乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA。质粒DNA纯度底、快速、操作简便

各种载体的承载能力：

（1）l-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb

限制性核酸内切酶的类型及其主要特性

特性

I 型II 型III 型

限制修饰活性双功能的酶限制酶和修饰酶

分开

双功能酶

内切酶的蛋白

质结构

3种不同亚基单一成分2种亚基

限制辅助因子ATP、Mg2+和S-

腺苷甲硫氨酸

Mg2+ ATP、Mg2+和S-

腺苷甲硫氨酸

ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点5

‘端至少1000bp

位于识别位点上特异性位点3‘端

24-26bp处

特异性切割不是（随机）是是

基因克隆中无用非常有用用处不大

II型限制性核酸内切酶的基本特点

1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。

2、识别序列的对称性靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。

3、切割位点的规范性交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA 分子）。

同位酶：一部分酶识别相同的序列，但切点不同。

同裂酶：识别位点与切割位点均相同来源不同的酶。

同尾酶：识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。

影响限制性核酸内切酶活性的因素

1底物DNA

2内切酶的用量

3反应缓冲液(浓度（10×）mmol/L)

4反应温度，大多数内切酶的最适温度为37℃

DNA 连接酶连接的作用机制

⑴

E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppi

E(酶)＋NAD→E－AMP＋NMN

⑵

E－AMP ＋DNA＝DNA－AMP＋E

⑶

DNA上的3’－OH对被活化的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。

T4DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，

需ATP辅助因子，活性高，常用。

其他工具酶

1. Klenow片段酶

实际上是大肠杆菌DNA聚合酶IC端的大片段。

Klenow片段的主要用途（利用5’→3’的聚合酶活性）

⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端

⑵标记DNA片段的末端

底物用［α－32P］－dNTPs

⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成

⑷DNA序列的测定

2.末端转移酶

末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。来源小牛胸腺。在人工黏性末端的构建中极有用处。

3、S1核酸酶常用来切平突出的单链末端以及制作S1谱图。

4、T4-DNA聚合酶有5-3聚合活性、5-3外切活性及3-5外切活性。用于修平非平头的cDNA分子以及由某些限制性核酸内切酶水解产生的3突出末端。

1个标准单位(U)的任何限制性核酸内切酶的定义为在最佳缓冲体系中，37℃反应1h完全水解1μg pBR322DNA所需的酶量。

一个标准的酶切反应设计为：0.1-1.01μgDNA5µL、10倍的缓冲液2µL、酶1µL，无菌重蒸水12µL，反应总体积为20µL。

1国标单位(U)的T4-DNA连接酶定义为：在最佳缓冲体系中15℃、1h内，完全连接1μgλ-DNA的HindⅢ片段所需的酶量。

连接反应温度与时间常采用下列几种几组组合：15℃-2h,12℃-8h,7℃过夜。

重组率是指在连接反应后，含有外源DNA片段的重组分子数与所投入的载体分子