pCoBlast昆虫表达载体说明
昆虫表达系统
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病毒基因组的结构特点
➢ 病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组 很小
➢ 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成
➢ 多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成 ，病毒基 因组的大部分是用来编码蛋白质的 ，噬菌体（细胞病毒） 的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的 ，无内 含子
• 在杆状病毒所表达的一系列蛋白中,有一类蛋白具有较高的表达量,并且均为病毒基因组复制所
非必需, 其中最具代表性的有多角体蛋白与 P10蛋白, 均属于晚期表达的蛋白,受晚期启 动子的调从而提供了外源
DNA插入座位。
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➢ 部分载体具有宿主细胞特异性
➢ 识别受体 ➢ 假病毒颗粒
• 杆状病毒及其基因组模型
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昆虫杆状表达系统简介
• 杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群 ,发现最早 、研
究最多且实用意义很大的昆虫病毒。20世纪80年代以来由
于杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system，BEVS）的建立 ,已被公认为是当今 基因工程四大表达系统之一 。该系统具有许多优点, 如多角体启动子控制下的高效表达 ,完善的转译后 加工修饰 ,较易从无血清培养上清中纯化的蛋白,无 内毒素污染等。 • 杆状病毒载体系统主要分为两大类,一类是用于表达单 个外源基因的载体,另一类是多元表达载体,用于插人 并表达2个或多个外源基因
871~ 881.
• （小鼠中枢神经系统）Sarkis C. , Serguera C. , Petres S. , Buchet D. ,Ridet J.L. et al.
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料：1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。
抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。
实验步骤：一、昆虫细胞转染：1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。
加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。
27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、病毒贮液的制备：1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。
即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。
长期保存分装冻存于-80℃。
3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体真核细胞，表达载体1、pCMVp—NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在.2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途：该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT—Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点：pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β—肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
pCold GST载体说明
pCold-GST编号 载体名称北京华越洋生物VECT4560 pCold-‐GSTpCold G ST载体基本信息载体名称: pCold-‐GST质粒类型: 大肠杆菌表达载体高拷贝/低拷贝: 低拷贝克隆方法: 限制性内切酶；多克隆位点启动子: cspA载体大小: 5097 b p5' 测序引物及序列: pCold F orward: 5′-‐ACGCCATATCGCCGAAAGG-‐3′3' 测序引物及序列: pCold R everse 5′-‐GGCAGGGATCTTAGATTCTG-‐3′载体标签: GST T ag（N-‐端）, H RV 3C蛋白酶切位点（N-‐端）,His T ag（N-‐端）载体抗性: 氨苄青霉素（Ampicillin）克隆菌株: DH5alpha等表达菌株: 任意E.coli菌株备注: pCold-‐GST载体表达GST融合蛋白，GST标签可以提高目的蛋白的可溶性，提高目的蛋白的纯度。
稳定性: 稳表达组成型/诱导型: 诱导型（IPTG)病毒/非病毒: 非病毒pCold G ST载体质粒图谱和多克隆位点信息pCold G ST载体简介pCold G ST D NA在冷休克载体的基础上，整合了来源于Schistosoma j aponicum的谷胱甘肽S-‐转移酶(glutathione S-‐transferases, G ST)可溶性标签。
通过GST在目的蛋白质N末端的融合表达，可提高融合蛋白质的稳定性和可溶性。
本制品在cspA启动子的下游插入了5’非编码区（5’-‐UTR）、翻译增强元件（TEE）、His标签、GST标签和多克隆位点（MCS）（下图）。
此外，在cspA启动子下游还插入了可以严格调控目的基因表达的lac o perator。
昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)
姓名：宋志瑞 专业：生物工程 学号： 2015304120207
NO.1
BEVS 简介
BEVS简介
昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)是基于昆虫杆状病 毒及其宿主细胞建立起来的表达体系；是继大肠杆菌， 酵母，哺乳动物细胞表达系统建立起来的，始于上世纪 80年代。
NO.2
BEVS 优点
2
Bac-to-Bac
3
BaculoDirect源自BacPAKBac-to-Bac
BaculoDirect
三大体系的区别
NO.5
BEVS常用宿主
常用宿主
Thanks
√
√ √ Sometimes Sometimes
Glycosylation
Acylation
√
√
表达高
加工 修饰
安全
B E VS
高效
容量大
NO.3
BEVS 原件
BEVS原件
1. 转移载体 2. 杆状病毒（AcNPV) 3. 宿主（培养细胞或虫体）
NO.4
BEVS三大系统
BEVS三大系统
1
BacPAK
BEVS优点
Features Simple to use Protein size Multiple gene expression Signal peptide cleavage BEVS √ unlimited √ √ Bacterial √ <100kD
Intron splicing
Functional protein Phosphorylation
pFastBacI-Gus昆虫表达载体说明
pFastBacI-Gus编号 载体名称北京华越洋生物KCVECT127 pFastBacI-‐GuspFastBacI-‐Gus载体基本信息载体名称: pFastBacI-Gus质粒类型: 昆虫细胞表达载体高拷贝/低拷贝: --启动子: --克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 6661bp5' 测序引物及序列: --3' 测序引物及序列: --载体标签: --载体抗性: Ampicillin筛选标记: Gentamicin备注: --稳定性: --组成型: --病毒/非病毒: 杆状病毒pFastBacI-‐Gus载体质粒图谱和多克隆位点信息pFastBacI-‐Gus载体简介pFastBac1-‐Gus is a 6661 bp control vector containing the Arabidopsis thaliana gene for β-‐glucuronidase (Gus) (Kertbundit et al., 1991), and was generated by restriction cloning of t he G us g ene i nto p FastBac1. T he m olecular w eight o fβ-‐glucuronidase i s 68.5 k Da.pFastBacI-‐Gus其他昆虫表达载体：pMT/BioEase-DEST pVL1392 pVL1393 pXINSECT-DEST39 pXINSECT-DEST38 pBacPAK9 pBacPAK8 pIB/V5-His-TOPO pIEX/Bac-1 pFastBacHT B pFastBacHT A pFastBac1pMT/V5-His-TOPO pMT/BiP/V5-His A pCoHygro pAc5.1/V5-His C pAc5.1-V5-His A pAc5/V5-HisA pAc5-V5-HisB pAc5-V5-HisC pCoBlast pAc5.1/V5-His B pIZ/V5-His pIB/V5-HispIZT/V5-His pMIB/V5-His C pMIB/V5-His A pMT/BiP/V5-His C pMT/BiP/V5-His B pIEx/Bac-4 pIEx/Bac-3 pIEXBac-c-EGFP-3 pIEXBac-c-EGFP-1 pIEXBac-c-EGFP-4 pAc5.1B-EGFP pBlueBacHis2 A pBlueBacHis2 C pBlueBacHis2 B pFastBacHT C pMT-Bip-V5-HisA pFBDM pUCDM pFastBac Dual pMIB/V5-His B pMT/V5-His C pMT/V5-His B pMT/V5-His A pAcGP67ApAc5.1b pAc5.1a pVL1392-XyIE control vector pFastBac-c-His-TEV pFastBac-N-GST-TEV pFastBacI-Gus pFastBacHT-CAT pBADZ-His6Cre。
pFastBac-N-GST-TEV昆虫表达载体说明
pFastBac-N-GST-TEV编号 载体名称北京华越洋生物KCVECT113 pFastBac-‐N-‐GST-‐TEVpFastBac-‐N-‐GST-‐TEV载体基本信息载体名称: pFastBac-N-GST-TEV质粒类型: 昆虫细胞表达载体高拷贝/低拷贝: --启动子: --克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: --5' 测序引物及序列: --3' 测序引物及序列: --载体标签: GST载体抗性: --筛选标记: --备注: --稳定性: --组成型: --病毒/非病毒: 杆状病毒pFastBac-‐N-‐GST-‐TEV其他昆虫表达载体：pMT/BioEase-DEST pVL1392 pVL1393 pXINSECT-DEST39 pXINSECT-DEST38 pBacPAK9 pBacPAK8 pIB/V5-His-TOPO pIEX/Bac-1 pFastBacHT B pFastBacHT A pFastBac1pMT/V5-His-TOPO pMT/BiP/V5-His A pCoHygro pAc5.1/V5-His C pAc5.1-V5-His A pAc5/V5-HisA pAc5-V5-HisB pAc5-V5-HisC pCoBlast pAc5.1/V5-His B pIZ/V5-His pIB/V5-HispIZT/V5-His pMIB/V5-His C pMIB/V5-His A pMT/BiP/V5-His C pMT/BiP/V5-His B pIEx/Bac-4 pIEx/Bac-3 pIEXBac-c-EGFP-3 pIEXBac-c-EGFP-1 pIEXBac-c-EGFP-4 pAc5.1B-EGFP pBlueBacHis2 A pBlueBacHis2 C pBlueBacHis2 B pFastBacHT C pMT-Bip-V5-HisA pFBDM pUCDM pFastBac Dual pMIB/V5-His B pMT/V5-His C pMT/V5-His B pMT/V5-His A pAcGP67ApAc5.1b pAc5.1a pVL1392-XyIE control vector pFastBac-c-His-TEV pFastBac-N-GST-TEV pFastBacI-Gus pFastBacHT-CAT pBADZ-His6Cre。
基因表达载体last
BACK
使用化学方法进行人工合成 对目的基因有什么要求？
BACKA1 基因组 2 cDNA 3 PCR 4 化学合成 B C D E F G
研究某生物的基因组 比较某生物不同器官的细胞中 基因的表达情况 获得一个较大（3kb）且序列已 知的目的基因 合成一个含有20个碱基的引物 研究非编码区DNA序列的功能 获得用于在大肠杆菌中表达的 人干扰素基因 获得一个经蛋白质工程设计的 较小（200bp）的目的基因
影印法
EcoRⅠ
BamHⅠ
BamHⅠ
EcoRⅠ
氨苄青霉素
四环素
表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点， 如要将图中外源基因连入该质粒构建表达载体，你能 选出最佳的酶切方式吗？
限制酶 识别序列 及 切割位点
BamH I
Hind III
EcoR I
Sma I
已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-， 限制酶Ⅱ的识别序列和切点是 -↓GATC-。根据图示 判断下列操作正确的是
基因的结构
基因
启动子 编码区 原核 内含子 真核 外显子 非编码区 非编码区 终止子
想一想：
组织特异性启动子
如要使转基因牛分泌的乳汁中含有 大量人血清白蛋白，应在构建基因表达 载体时选用什么样的启动子？
乳腺生物反应器
基因的结构
基因
启动子 编码区 原核 内含子 真核 外显子 非编码区 非编码区 终止子
Kb
0 10 20 30 40 49
头部、尾部蛋白基因
DNA合成 裂解等相关基因
裂解生长非必需基因
可携hona Puke BACKPCR技术的中文全称？
你能简单介绍一下这项技术吗？
昆虫嗅觉相关蛋白的结构和功能
性球蛋白质，由 120 ～ 150 个 氨 基 酸 组 成，二 级 结 构 由 6 个 α 螺旋构成多维 二 聚 体，往 往 有 翻 译 后 修 饰 的现象［4］，配体结合点位于 α 螺旋结构中. 1. 1. 2 OBPs 的结合态与非结合态结构 近年来研 究表明，昆虫 OBPs 存在结 合 态 与 非 结 合 态 之 别［5］. 非结合态蛋白其分 子 组 成、氨 基 酸 特 征 与 结 合 态 蛋 白存在显著区别［6］. 以家蚕（ Bombyx mori） 的 信 息 素 结合蛋白 BmorPBP 为例，其与蚕蛾醇结 合 的 蛋 白 和 非结合态蛋白之间存在 3 个主要的区别：（1） 结合 态蛋白具有不规则的 C 末端，而非结合态蛋白具有 不规则的 N 末端；（2 ） 非结 合 态蛋 白 的 α3 和 α4 之 间的松散区域更长；（3） 非结合态蛋白的 C 末端形 成了第 7 个 α 螺 旋，此 螺 旋 填 充 了 蛋 白 的 结 合 口 袋. 如 Fig. 1 所示，其中非结合态 的 PBPs 用 A-form 表示.
532
中国生物化学与分子生物学报
第 26 卷
些蛋白溶解并运输 植 物 和 捕 食 者 等 发 出 的 气 味，穿 过触角感器中亲水 性 的 淋 巴 液 到 达 嗅 觉 受 体，引 起 昆虫的行为反 应. 嗅 觉 受 体 ORs 是 G 蛋 白 耦 联 受 体（ G protein-coupled receptor） . ORs 可 以 分 为 典 型 气味受 体 和 Or83b 非 典 型 受 体 （ 或 者 称 为 辅 助 受 体） 两类［3］.
Structure and Function of Insect Olfactory Proteins
REN Zhen-Zhen，LIU Xiao-Lei，HU Mei-Ying*
碧云天生物技术pCMV-C-mOrange2说明书
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线: 400-1683301或800-8283301订货e-mail:******************技术咨询: *****************网址: 碧云天网站 微信公众号pCMV-C-mOrange2 (橙色荧光蛋白)产品编号产品名称包装D2625-1µg pCMV-C-mOrange2 (橙色荧光蛋白)1µgD2625-100µg pCMV-C-mOrange2 (橙色荧光蛋白)100µg产品简介：pCMV-C-mOrange2是碧云天自行研发的哺乳动物细胞表达质粒，用于表达C端含mOrange2标签的融合蛋白。
mOrange2蛋白是一种极其明亮的桔色荧光蛋白，与mOrange蛋白相比，其蛋白稳定性得以提高。
pCMV-C-mOrange2含有CMV启动子，可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达。
pCMV-C-mOrange2在多克隆位点的后面有一个mOrange2的完整编码序列，因此在多克隆位点根据阅读框插入目的基因就可以表达C端含有mOrange2标签的融合蛋白。
利用mOrange2的荧光特性可以比较容易地观察融合蛋白的表达水平和细胞内定位，也可以利用mOrange2抗体来检测或免疫沉淀融合蛋白。
mOrange2与GFP没有序列同源性，不能使用GFP抗体检测mOrange2，但可以尝试使用抗mcherry的抗体检测mOrange2。
pCMV-C-mOrange2为卡那霉素抗性，并且含有Neomycin筛选标记，转染细胞后，可使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。
pCMV-C-mOrange2质粒的主要信息如下：Feature Nucleotide PositionCMV promoter 1-602T3 promoter and T3 primer binding site 620-639Multiple cloning site 651-740mOrange2 741-1448 T7 promoter and T7 primer binding site 1498-1519 SV40 polyA signal 1531-1914 f1 origin of ss-DNA replication 2052-2356 bla promoter 2381-2505 SV40 promoter2525-2863 Neomycin/kanamycin resistance ORF 2898-3689 HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal 3690-4148 pUC origin 4277-4944pCMV-C-mOrange2质粒(4996bp)的图谱如下：pCMV-C-mOrange2的多克隆位点的详细图谱如下：SmaISacI SacII NotI XmaI BamHI HindIII651 GAGCTCCACC GCGGTGGCGG CCGCTCTAGC CCGGGCGGAT CCAAGCTTCTCTCGAGGTGG CGCCACCGCC GGCGAGATCG GGCCCGCCTA GGTTCGAAGAEcoRI EcoRV SalI XhoI XbaI mOrange2701 GCAGGAATTC GATATCGTCG ACAGATCTCT CGAGTCTAGA ATGTCTAAGGCGTCCTTAAG CTATAGCAGC TGTCTAGAGA GCTCAGATCT TACAGATTCC751 GAGAAGAAAA TAATATGGCT ATCATCAAGG AATTTATGCG TTTTAAGGTCCTCTTCTTTT ATTATACCGA TAGTAGTTCC TTAAATACGC AAAATTCCAG801 CGTATGGAAG GTTCAGTCAA TGGTCACGAA TTTGAAATTG AAGGTGAAGGGCATACCTTC CAAGTCAGTT ACCAGTGCTT AAACTTTAAC TTCCACTTCC851 AGAAGGTCGT CCATACGAAG GTTTTCAAAC TGCTAAATTG AAGGTAACCATCTTCCAGCA GGTATGCTTC CAAAAGTTTG ACGATTTAAC TTCCATTGGT901 AAGGTGGACC ATTACCTTTT GCATGGGATA TTTTGTCACC ACAGTTTACATTCCACCTGG TAATGGAAAA CGTACCCTAT AAAACAGTGG TGTCAAATGT951 TACGGAAGTA AAGCATATGT TAAGCATCCA GCTGATATTC CTGATTACTTATGCCTTCAT TTCGTATACA ATTCGTAGGT CGACTATAAG GACTAATGAA1001 TAAATTGAGT TTTCCTGAAG GTTTTAAATG GGAACGTGTC ATGAATTTTGATTTAACTCA AAAGGACTTC CAAAATTTAC CCTTGCACAG TACTTAAAAC1051 AAGATGGTGG AGTTGTCACC GTAACACAAG ATTCTTCATT GCAGGATGGATTCTACCACC TCAACAGTGG CATTGTGTTC TAAGAAGTAA CGTCCTACCT1101 GAATTTATCT ACAAGGTTAA ATTGCGTGGA ACCAATTTTC CATCTGATGGCTTAAATAGA TGTTCCAATT TAACGCACCT TGGTTAAAAG GTAGACTACC1151 TCCTGTCATG CAAAAGAAAA CAATGGGTTG GGAAGCAAGT TCTGAACGTAAGGACAGTAC GTTTTCTTTT GTTACCCAAC CCTTCGTTCA AGACTTGCAT1201 TGTACCCTGA AGATGGAGCC CTTAAAGGTG AAATCAAGAT GCGTTTGAAAACATGGGACT TCTACCTCGG GAATTTCCAC TTTAGTTCTA CGCAAACTTT1251 CTTAAGGATG GTGGACATTA CACTTCTGAA GTCAAGACAA CTTACAAGGCGAATTCCTAC CACCTGTAAT GTGAAGACTT CAGTTCTGTT GAATGTTCCG1301 CAAAAAGCCA GTACAGCTTC CTGGAGCTTA CATCGTTGGT ATCAAATTGGGTTTTTCGGT CATGTCGAAG GACCTCGAAT GTAGCAACCA TAGTTTAACC1351 ATATTACATC ACACAATGAA GATTACACTA TCGTTGAACA ATATGAACGTTATAATGTAG TGTGTTACTT CTAATGTGAT AGCAACTTGT TATACTTGCAApaI1401 GCAGAAGGTC GTCACTCTAC TGGTGGTATG GATGAACTTT ACAAGTAAG GCGTCTTCCAG CAGTGAGATG ACCACCATAC CTACTTGAAA TGTTCATTC C1451 GGGCCCGGTA CCTTAATTAA TTAAGGTACCCCCGGGCCAT GGAATTAATT AATTCCATGGpCMV-C-mOrange2中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-C-mOrange2)包括：AclI AfeI AgeI AhdI AscI AsiSI BbsI BcgI BlpI BmgBI Bpu10I BsiWI BsmBI BspEI BsrGI BssHII BstZ17I EarI EcoNI Esp3I FseI PmeI PmlI PpuMI PshAI PspXI SapI SbfI SgrAI SpeI SwaI XcmIpCMV-C-mOrange2中的单酶切位点（Restriction enzymes that cut pCMV-C-mOrange2 once）包括：AccI GT’MK,AC 718 MluI A’CGCG,T 1914 AflII C’TTAA,G 1251 MscI TGG|CCA 3108 AleI CACNN|NNGTG 661 NarI GG’CG,CC3026 ApaI G,GGCC’C 1453 NheI G’CTAG,C597 ApaLI G’TGCA,C 4630 NotI GC’GGCC,GC 668 BaeI ,N)5’(N)10ACNNNNGTAYC(N)7,(N)5’ 1185 PaeR7I C’TCGA,G 729 BamHI G’GATC,C 687 PciI A’CATGT 49442 / 4 D2625pCMV-C-mOrange2(橙色荧光蛋白) 400-1683301/800-8283301 碧云天/BeyotimeBclI T’GATC,A 1685 PflFI CCAN,NNN’NTGG 3144 BglII A’GATC,T 723 PflMI G,GCGC’C 1146 BmtI G,CTAG’C 601 PluTI G,GCGC’C 3029 BsaI GGTCTCN’NNNN, 4015 PspOMI G’GGCC,C 1449 BsaXI ,NNN’(N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN’ 2078 PstI C’TGCA,G 703 BseRI GAGGAG(N)8,NN’ 2844 PvuI CG,AT’CG 1531 BsgI GTGCAG(N)14,NN’ 1420 RsrII CG’GWC,CG 3524 BspDI AT’CG,AT 2866 SacI G,AGCT’C 655 BstBI TT’CG,AA 3708 SacII CC,GC’GG 662 BstEII G’GTNAC,C 893 SalI G’TCGA,C 717 BstXI CCAN,NNNN’NTGG 663 SfiI GGCCN,NNN’NGGCC 2801 BtsI GCAGTG,NN’ 1867 SfoI GGC|GCC 3027 ClaI AT’CG,AT 2866 SmaI CCC|GGG 682 CspCI ,NN’(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN’ 382 SnaBI TAC|GTA 346 DraIII CAC,NNN’GTG 2144 SrfI GCCC|GGGC 682 Eco53kI GAG|CTC 653 StuI AGG|CCT 2847 EcoRI G’AATT,C 705 TspMI C’CCGG,G 680 EcoRV GAT|ATC 713 Tth111I GACN’N,NGTC 3144 HindIII A’AGCT,T 693 XbaI T’CTAG,A 735 HpaI CC,TGCA`GG 1791 XhoI C’TCGA,G 729 KasI G’GCGC,C 3025 XmaI C’CCGG,G 680 MfeI C’AATT,G 1778 XmnI GAANN|NNTTC 871 pCMV-C-mOrange2质粒中推荐使用的测序引物序列如下：T3 primer (620-639): 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'C-mOrange2 primer (852-873): 5'- AACCTTCGTATGGACGACCTTC -3'pCMV-C-mOrange2的全序列信息请参考碧云天的网站上该质粒的信息。
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点:pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40or igin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK 基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途:该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP 的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。
蛋白纯化CSM-昆虫细胞中蛋白表达与纯化
14.2 His 标签蛋白表达纯化1、把His 标签蛋白表达质粒，进行转化，转到大肠杆菌的感受态细胞BL21 中，冰上放置30min，加入新鲜的LB 培养基孵育大约1h，然后涂板，于37℃培养箱中进行过夜培养。
2、第二天，小心地挑取培养菌落中的单克隆，加入到10mL 的加有适当抗性的LB液体培养基中，放在37℃的摇床中培养过夜。
3、把过夜培养的菌液倒入800mL 加有适当抗性的LB 液体培养基中，于37℃摇床中摇到大约OD600 值在0.6～0.8 之间，就可以拿出，把菌液放置于4℃冷却菌液20～30min。
4、在超净台中，加入诱导剂IPTG 至终浓度0.1mM，诱导蛋白表达，于18℃摇床中培养6-8h。
5、诱导完成以后，8000 rpm 离心10min，沉淀收集菌体。
6、在沉淀后的细菌菌体中，加入lysis buffer（10 mM 咪唑，300 mM NaCl，50 mMNaH2PO4，用NaOH 调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂）中重悬，1g 湿重的菌体沉淀用5mL 的裂解缓冲液，进行超声破碎，然后12000rpm 离心20min，离心后取上清。
7、在上清中加入1 mL Ni-NTA beads 到4 mL 裂解液中，于4℃冰箱中轻轻地混合60 min 左右。
8、加入4 mL 的wash buffer（300 mM NaCl，20 mM 咪唑，50 mM NaH2PO4，用NaOH 调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂），在冰上洗4 次，每次孵育10min。
9、加入elution buffer（250 mM 咪唑，300 mM NaCl，50 mM NaH2PO4，用NaOH调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂）洗脱重组蛋白4 次，每次用500μl。
14.3 GST 融合蛋白的表达与纯化1、把GST 标签蛋白表达质粒，进行转化，转到大肠杆菌的感受态细胞BL21 中，冰上放置30min，加入新鲜的LB 培养基孵育大约1h，然后涂板，于37℃培养箱中进行过夜培养。
昆虫细胞表达
昆虫细胞表达昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。
昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。
将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。
昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。
细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。
而昆虫细胞表达系统具有很多优点：1、具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统；2、正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构；3、具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；4、昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白。
高表达量，最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；5、可表达非常大的外源性基因（~200kD）而不至于影响本身的增殖；6、具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个基因的能力；7、通用性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因；8、对脊椎动物是安全的，杆状病毒属于昆虫病毒，有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性，而且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然界的生存能力很弱，被认为是安全的载体。
猪氨基肽酶在昆虫细胞的分段表达及鉴定
２ １年 ９ ０２ 月
东
北
农
业
大
学 学
报
４ ｅ ． １
Ｊ ｕ ａ ｆＮｏｔｅ ｓ ＡｇｉｕｔｒｌＵｎｖ ｒｉ ｏ ｒｌ ｏ ｒ ａ ｔ ｒｃ ｌ ａ ｉｅ ｓｔ ｎ ｈ ｕ ｙ
猪氨基肽酶在 昆虫细胞 的分段表达及鉴 定
单智夫 ，唐丽杰 ，乔薪媛 ，葛俊伟 ，李 一经
（东北农业大学动物医学学院 ，哈尔滨 １ ０３ ５０ ０）
摘
要 ：为研 究猪 的氨基肽酶（ ｏｃ ｅ ｍｉｏｅ ｔ ａｅｐ Ｐ 的特异性功能 区域及作用机制，将 除去信号肽 的 Ｐ ｒｉ ｎｐｐｉ ｓ，Ａ Ｎ） ｎａ ｄ
ｐＰ Ａ Ｎ分 为 Ｓ Ａ，Ｓ Ｂ和 Ｓ Ｃ三段 ，利 用 一 对 同尾 酶 ｆ 和 Ｓ ｌ将 信 号 肽 分 别 与 Ｓ Ａ，Ｓ Ｂ和 Ｓ Ｃ 连 接 后再 构 建 Ｐ Ｐ Ｐ Ｉ ａＩ Ｐ Ｐ Ｐ相
Ａｂｓ ｒ ｃ ： ｏ ｉｖ ｓｉａｅｗｈｃ ａｔ ｆ ｏ ｃｎ ｍｉｏ ｅ ｔ ａ ｅ（Ａ ）ｉ ｔｅｆｎ ｔ ｎ ｌ ｏ ｉ ｏ ｔ ａ ｔ Ｔ ｅ ｔ ｔ ｉｈｐ ｒ ｏ ｒｉｅａ ｎ ｐ ｐｉ ｓ ｐ ＰＮ ｓ ｈ ｕ ｃｉ ａ ｍａｎ ｆ ｎ ｇ ｐ ｄ ｏ ｄ
ｒｃ ｐｏ ｅ ｅ ｔ ｒｆ ＰＥＤＶ， ｅｍｏｖ ｄ ｔ ｅ ｓｇ ａｌ ｅｐｉ ｄ ｄｖｄ ｄ ｐ ｏｒ ｗｅ ｒ ｅ ｈ ｉｎ ｐ ｔ ａｎ ｉｉｅ ＡＰＮ ｉｔ ｈ ｅ ｅｃｉｎ ：ＳＰＡ， ｄｅ ｎｏ ｔ ｒ ｅ ｓ ｔ ｓ ｏ ＳＰＢ ｄ ａｎ
到杆状病毒表达载体 ｐ ａｔａＴ 上 ，通过杆状病毒一 Ｆ ｓ ｃ Ｍ１ Ｂ 昆虫细胞表 达体 系进行蛋 白表 达。结果表明 。￣ Ｓ Ｓ Ｐ Ｇ ￣ Ｄ—Ａ Ｅ 分析 可见获得 的 目的蛋 白与预期 大小相一致 ，即 Ｓ Ａ约 为 ４ ｕ Ｐ 和 Ｓ Ｃ相 同 ，约 为５ ｕ Ｐ ２ｋ ，Ｓ Ｂ Ｐ ６ｋ 的分泌蛋 白 ：经
昆虫细胞蛋白表达
一、实验目的表达蛋白二、实验材料三、仪器耗材四、实验步骤1.载体构建1.1设计引物在GenBank中找到嗅觉受体蛋白基因全长，设计引物1.2基因克隆与扩增利用RNA抽提试剂盒提取总RNA，以RNA为模板使用RT-PCR试剂盒进行反转录成cDNA；以cDNA为模板，PCR扩增目的基因；PCR产物电泳鉴定，胶回收试剂盒回收DNA。
1.3目的基因与载体连接利用限制性核酸内切酶对pFastBac1载体和目的基因进行双酶切，酶切后分别回收纯化；将载体与目的基因连接，取5ul的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，37度，培养16h；挑单克隆进行菌落PCR后测序鉴定；将测序正确的pFastBac1-目的基因的单克隆置于LB培养基37度，摇菌16h，提取质粒。
2.转化与筛选2.1化转大肠杆菌DH10Bac感受态将质粒转化进大肠杆菌DH10Bac感受态，加入无菌SOC培养基，37度，220rpm培养4h，对转化液进行梯度稀释涂于LB平板（50ug/ml卡那霉素，7ug/ml庆大霉素，7ug/ml四环素，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG）上，37度培养48h。
2.2平板筛选挑取白色菌落，重新划线LB平板，37度培养16h；挑取白色单菌落，转接到液体LB 培养基（50ug/ml卡那霉素，7ug/ml庆大霉素，7ug/ml四环素）中，37度，220rpm，培养16h。
2.3质粒抽提用杆状病毒穿梭载体Bacmid小量抽提试剂盒提取目的基因-Bacmid质粒，以该质粒为模板，利用通用测序引物M13进行PCR，测序鉴定。
3.蛋白表达3.1昆虫细胞用培养基将昆虫细胞Sf9，27度，无CO2条件下培养至细胞密度达70%~90%。
3.2 质粒转染利用Lipolnsect昆虫转染试剂将目的基因-Bacmid质粒转染到Sf9昆虫细胞中，同时设置转染空质粒的Sf9细胞为阴性对照，继续培养并注意观察细胞形态。
3.3 继代培养待所有细胞都裂解时，收集细胞培养液上清，即为P1代重组杆状病毒；使用P1代病毒感染贴壁约1h的Sf9细胞（2*106/ml），病毒感染复数（MOI）为0.1；27℃培养72h 后，收集培养液，500xg离心5min，获得的上清为P2代杆状病毒。
昆虫细胞蛋白表达常见问题解析
昆虫细胞蛋白表达常见问题解析昆虫细胞蛋白表达常见问题解析1、昆虫细胞蛋白表达系统能否将两个基因共同表达？答：昆虫细胞可以同时表达多个基因,杆状病毒衣壳内可以容纳较大的外源DNA插入片段，可以分别构建2个质粒，然后一起转染昆虫细胞，这种方式的优点是可以分别优化两个蛋白的表达水平，可以控制两个蛋白的表达平衡，相对于一个质粒共表达的方式缺点是在蛋白表达之前质粒构建，质粒抽提，蛋白病毒包被工作及成本费用都是增加一倍的；另一种共表达的方式是pFastBac Dual载体上构建两个目的基因，就可以同时表达两个蛋白。
pFastBac Dual载体上两个启动子分别为PH和P10启动子，其中PH启动子蛋白表达效率要高于P10启动子。
2、昆虫细胞蛋白表达系统的优势（1）、可以表达大分子量的蛋白，目前做过250KD蛋白表达，依然稳定性较好，没有断裂或降解。
（2）、昆虫细胞相对哺乳动物细胞培养相对简单，27度培养，无需CO2补充，目前商业化的培养基细胞培养非常成熟，细胞密度能够达到15*10^6个/ml，昆虫表达系统成本较哺乳表达系统较低。
（3）、病毒一次包被，长期使用，稳定表达。
较哺乳瞬时表达系统而言，该系统放大表达较容易，不需要抽提大量的质粒，质粒的质量以及批次差异会影响蛋白表达。
昆虫表达系统只需要包被好病毒，做好表达小试即可稳定放大表达。
（4）、昆虫细胞体系能进行翻译后的加工修饰，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等；（5）、可以同时表达多个基因，比如抗体、 fab、互相结合作用的蛋白等；（6）、杆状病毒对脊椎动物无感染性。
（7）、可以表达有毒蛋白，比如抗菌肽。
3、昆虫病毒的保存方式对病毒有怎样的影响？答：制备病毒时添加2%的细胞培养级别的BSA或者胎牛血清，有助于保护病毒，如果忘记添加，在收货病毒后添加，放在4度或者负80保存，短期使用（一般半年左右）可以放在4度，长期使用建议负80保存，再次使用建议检测一下病毒滴度或者做个表达小试，防止病毒滴度降低或失效。
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pCoBlast编号 载体名称北京华越洋生物KCVECT105 pCoBlastpCoBlast载体基本信息载体名称: pCoBlast质粒类型: 昆虫表达载体；筛选载体克隆方法: --启动子: copia载体大小: 3907 bp5' 测序引物及序列: --3' 测序引物及序列: --载体标签: 无载体抗性: 氨苄青霉素真核筛选标记: Blasticidin克隆菌株: TOP10；DH5-T1R宿主细胞（系）: 果蝇细胞系S2备注: pCoBlast载体与昆虫表达载体共转染，建立稳表达细胞系。
瞬表达/稳表达: --组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 非病毒pCoBlast载体质粒图谱和多克隆位点信息pCoBlast载体简介pCoBlast is a 3907 bp selection vector that can be cotransfected with the expression vector of choice to to create stable cell lines in Drosophila. It contains the Streptomyces griseochromogenes bsd gene under control of the Drosophila copia promoter to confer resistance to blasticidin in S2 cells.引用及参考文献A novel allelic variant of the human TSG-6 gene encoding an amino acid difference in the CUB module. Chromosomal localization, frequency analysis, modeling, and expression.Nentwich Hilke A; Mustafa Zehra; Rugg Marilyn S; Marsden Brian D; Cordell Martin R; Mahoney David J; Jenkins Suzanne C; Dowling Barbara; Fries Erik; Milner Caroline M; Loughlin John; Day Anthony J;J Biol Chem (2002) 277:15354-15416Product usage: The full-length coding sequence of human TSG-6 (A431 allele encoding Gln at amino acid 144), including the signal sequence and stop codon,was excised from the pAcCL29-1 vector by digestion with KpnI/XbaI and cloned into the corresponding sites in the Drosophila Expression SystempCoBlast载体序列TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCT GTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGG CTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGAT GCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATC GGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTA ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCG ACTCTAGAGGATCCGGTGCGTGGTGGTTTCATGCTTCTGGGAACGGCAAATGGGTTTAGGATTGGGAACC CCTCATCATCTGTTGGAATATACTATTCAACCTACAAAAATAACGTTAAACAACACTACTTTATATTTGA TATGAATGGCCACACCTTTTATGCCATAAAACATATTGTAAGAGAATACCACTCTTTTTATTCCTTCTTT CCTTCTTGTACGTTTTTTGCTGTGAGTAGGTCGTGGTGCTGGTGTTGCAGTTGAAATAACTTAAAATATA AATCATAAAACTCAAACATAAACTTGACTATTTATTTATTTATTAAGAAAGGAAATATAAATTATAAATT ACAACAGGTTCCCTTTATGCGAAGGGATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAGAATCCACCCTCATTGAAAG AGCAACGGCTACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAGACTACAGCGTCGCCAGCGCAGCTCTCTCTAGC GACGGCCGCATCTTCACTGGTGTCAATGTATATCATTTTACTGGGGGACCTTGCGCAGAACTCGTGGTGC TGGGCACTGCTGCTGCTGCGGCAGCTGGCAACCTGACTTGTATCGTCGCGATCGGAAATGAGAACAGGGG CATCTTGAGCCCCTGCGGACGGTGCCGACAGGTTCTTCTCGATCTGCATCCTGGGATCAAAGCCATAGTG AAGGACAGTGATGGACAGCCGACGGCAGTTGGGATTCGTGAATTGCTGCCCTCTGGTTATGTGTGGGAGG GCTAACCCTTATACGCAAGGGAGTAGATGCCGACCGAACAAGAGCTGATTTCGAGAACGCCTCAGCCAGC AACTCGCGCGAGCCTAGCAAGGCAAATGCGAGAGAACGGCCTTACGCTTGGTGGCACAGTTCTCGTCCAC AGTTCGCTAAGCTCGCTCGGCTGGGTCGCGGGAGGGCCGGTCGCAGTGATTCAGGCCCTTCTGGATTGTG TTGGTCCCCAGGGCACGATTGTCATGCCCACGCACTCGGGTGATCTGACTGATCCCGCAGATTGGAGATC GCCGCCCGTGCCTGCCGATTGGGTGCAGATCAGCCTCGAGGCCAGCTAGCTTGAACTTGTTTATTGCAGC TTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCT AGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTA ATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAA GCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCC CGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGT TTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAG CGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACAT GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTC CGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAA GATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATA CCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCG GTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTAT CCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAA CAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTAC ACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCT CTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAG AAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAA GTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC ACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACG ATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAG ATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTC CATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTT GTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCC AACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGAT CGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACT GTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTA TGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAA AGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGT TCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAG CAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACT CTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGT ATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAApCoBlast其他昆虫表达载体：pMT/BioEase-DEST pVL1392 pVL1393 pXINSECT-DEST39 pXINSECT-DEST38 pBacPAK9 pBacPAK8 pIB/V5-His-TOPO pIEX/Bac-1 pFastBacHT B pFastBacHT A pFastBac1pMT/V5-His-TOPO pMT/BiP/V5-His A pCoHygro pAc5.1/V5-His C pAc5.1-V5-His A pAc5/V5-HisA pAc5-V5-HisB pAc5-V5-HisC pCoBlast pAc5.1/V5-His B pIZ/V5-His pIB/V5-HispIZT/V5-His pMIB/V5-His C pMIB/V5-His A pMT/BiP/V5-His C pMT/BiP/V5-His B pIEx/Bac-4 pIEx/Bac-3 pIEXBac-c-EGFP-3 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