一株高产魔芋葡甘聚糖酶菌种的中试发酵条件初探

27 h 后，取样测定酶活。
表 1 正交试验方案
水平
A pH 值
B 通气量 （m3/h）
C 搅拌速度 （r/min）
D 接种量 （%）
1
7.0
0.5
50
2
2
7.0
0.8
100
4
3
7.0
1.0
150
6
4
7.5
0.5
100
6
5
7.5
0.8
150
2
6
7.5
1.0
50
4
7
8.0
0.5
150
4
8
8.0
0.8
50
糖酶菌株，经鉴定为芽孢杆菌属，菌株编号 B23。 1.1.2 培养基 种子培养基（g/L）：蛋白胨 10，牛肉 膏 3，NaCl 5，K2HPO4 2，魔芋精粉 10，pH 值 7.0~ 7.2；发酵培养基（g/L）：魔芋精粉 10，（NH4）2SO4 10， NaCl 5，K2HPO4 2，消泡剂，pH 值 7.0~8.0。
2.3 发酵过程中 pH 值的调控
如图 3 所示，pH 值在 7.0~8.5 时，细菌在中性 偏碱的环境中生长良好，生物量较高；pH 值在 6.5~
1 800 1 600 1 400
酶活力 生物量
1 650 1 600
1 200
1 550
1 000 800
1 500
600
1 450
400
1 400
200
6
9
8.0
1.0
100
2
1.2.6 数据测定 （1）生物量测定：平板计数法。 （2） 酶活力测定：25 mL 试管中加入 0.9 mL 0.5% （W/V）魔芋葡甘聚糖溶液（pH 值 5.8，0.2 mol/L 磷 酸缓冲液配制），50℃水浴中预热 2 min，向待测试 管中加入 0.1 mL 酶液反应 10 min。迅速将所有试 管转入 100℃水浴，5 min 后向对照试管 CK 中加入 0.1 mL 酶液，继续反应 3 min。取出试管，加入 4 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，放入沸水中反 应 10 min，流水冷却后测定 OD540[8]。酶活定义为在 上述反应条件下，每分钟释放出 1μmol 甘露糖的酶 量为一个活力单位[9]。（3）转速、温度、罐压、空气流 量、溶氧率、pH 值等发酵体系参数直接从发酵罐控 制电路上读取。
湖南农业科学 2012，（09）：16~18
Hunan Agricultural Sciences
一株高产魔芋葡甘聚糖酶菌种的中试发酵条件初探
陈思洋，谭 军，吴永尧
（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）
摘 要：采用（NH4）2SO4 为无机氮源，利用实验室筛选的高产魔芋葡甘聚糖酶的 B23 菌种，在 50 L 发酵罐中进行中试放大，研究
producing strain, was taken to conduct pilot production in 50 L of fermentor in order to study the producing conditions and pH regulation and control during commercial fermenting production and to discuss the feasibility of commercial producing konjac glucomannanase of Amorphophallus rivieri Durieu. The results showed that the best fermentation conditions were inoculum size of 6%, aeration rate of 0.8 m3/h and stirring speed of 100 r/m. Under the best conditions, the total enzyme activity reached 2 574 U/ml. The aeration rate, stirring speed and inoculum size, which must be determined during the changing process from laboratory flask -shaking production to fermentor production, were optimized, and the activity of B23 in laboratory flask-shaking production were enhanced. Therefore, the trial-production can be performed.
酶活力（U/mg）
1 800
酶活力
2 500
1 600 1 400
生物量
2 000
1 200 1 000
1 500
800
1 000
600
400
500
200
0
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54
发酵时间（h）
图 2 发酵过程中生物量与酶活的变化
调控前
8.5
调控后
8.0
7.5
pH 值
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 发酵时间（h） 图 4 发酵过程中的 pH 值调控
2.4 正交试验
正交试验结果如表 2 所示，pH 值是影响细菌
生长和产酶的最主要因素，次之为接种量。根据正
交试验结果，发酵最优条件：pH 值 8.0，接种量 4%，通气量 0.5 m3/h，搅拌速度为 150 r/min，此时
2 结果与讨论
2.1 发酵过程中 pH 的变化规律
试验发酵培养基氮源使用无机氮源，对发酵液 pH 值无缓冲作用，故发酵过程中 pH 值变化明显， 且易控[7]。发酵周期为 60 h，结果如图 1 所示，发酵
酶活力（U/mg）
12 h 后 pH 值开始明显降低；发酵 24 h 后 pH 值 降至 6.4，且持续下降；至 60 h 发酵结束时，pH 值 降至 5.7。
第 09 期
陈思洋等：一株高产魔芋葡甘聚糖酶菌种的中试发酵条件初探
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摇瓶发酵最优条件为参照，配制培养基，设定转速
为 100 r/min，通气量 0.5 L/h，接种量 2%，对发酵
过程中生物量和葡甘聚糖酶活进行研究，每 3 h 取
样测定。
1.2.4 发酵过程中 pH 值的调控 采用对发酵液
pH 值有缓冲作用的有机氮源，在摇瓶中培养，设
CHEN Si-yang, TAN Jun, WU Yong-yao
(College of Bioscience and Biotechnology, HNAU, Changsha 410128, PRC)
Abstract: The (NH4)2SO4 was taken as the inorganic nitrogen source, the B23 bacterium, a high konjac glucomannanase
1.2 方 法
1.2.1 菌种活化与扩大培养 取保存菌种 B23 接 种于 100 mL 种子液培养基中，37℃、100 r/min 摇床 活化培养。取 1 mL 活化后的种子液加入 100 mL 种 子液中，相同条件下培养 24 h，得到发酵罐种子液。 1.2.2 发酵过程中 pH 值的变化规律 采用无机 氮源，设定初始 pH 值为 7.0，每 6 h 取样一次，测定 pH 值变化规律。 1.2.3 发酵过程中生物量和酶活的变化规律 以
0
1 350
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0
pH 值
图 3 pH 值对生物量和发酵产酶的影响
生物量（104/mL）
生物量（104/mL）
18
湖南农业科学
第 09 期
7.0 时，细菌酶活力表达最高。 结合上述试验中测定的发酵过程中 pH 值变
化规律、细菌生长及产酶规律，设计调控 pH 值。如 图 4 所示，设定初始 pH 值为 8.0，在发酵初期不断 补碱，pH 值维持在 8.0 左右，使细菌有良好的生长 环境，加速扩增。在 24 h 扩增完成后，开始降低 pH 值，使细菌高效产酶。
了工业发酵生产中的生产条件以及 pH 的调控，讨论了工业生产魔芋葡甘聚糖酶的可行性。结果表明：pH 值 7.0、接种量 6%、通气
量 0.8 m3/h、搅拌速度 100 r/min 为最佳条件，总酶活力达到 2 574 U/mL。优化了从实验室摇瓶生产至发酵罐生产中必须测定的通
气量、搅拌速度、接种量等工业生产条件，提高了该菌在实验室摇瓶发酵的酶活力，可进入工业生产研究。
关键词：50 L 发酵罐；魔芋；葡甘聚糖酶；无机氮源；pH 值调控；发酵
中图分类号：Q939.9
文献标识码：A
文章编号：1006-060X（2012）09-0016-03
Pilot Test of Fermentation Condition for a High Konjac Glucomannanase Producing Bacterium
7.5
7.0
pH 值
6.5
6.0
5.5
5.0 0
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 发酵时间（h）
图 1 发酵过程中的 pH 值变化
2.2 发酵过程中生物量和酶活的变化规律
如图 2 所示，细菌生长周期较短，发酵 12 h 后，进入对数生长期；至 15 h 时扩增速度降低，18 h 后生长速度再次提高；至 27 h 时达到最高点，进入 稳定期。从图 2 中看出，酶活力随着细菌大量生长 而提高，27 h 时达到峰值，然后伴随菌体生长趋于 下降趋势，为同步合成型酶。对于细菌生长中出现 一个明显的二次生长现象，应是发酵液中分解产生 的低聚糖增多，细菌更易利用，且随着魔芋葡甘聚 糖分解，发酵液黏度降低，使搅拌效率上升，溶氧率 提高的缘故。